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Vídeo- 1 Cromatografia de Papel Neste vídeo mostra as partes de adsorção em cromatografia de papel, onde há separação dos componentes misturados nos filtros, o álcool faz o processo de separação onde o pigmento mais leve sobe e o mais pesado desce fazendo a separação por completo. Vídeo- 2 Métodos cromatográficos A cromatografia tem o método físico químico de separação na qual os compostos presentes em uma mistura são distribuídos em uma fase estacionaria e uma fase móvel a separação, ocorre por que tem afinidades diferentes com estas fases deslocando com diferentes velocidades pelo sistema. Este vídeo fala sobre a separação de origem proteica, onde vai ser abordado o estudo sobre a cromatografia liquida clássica em colunas de baixa pressão, a cromatografia liquida de alta desempenho, estudo este chamado (HPLC) High performance liquid cromatography e também a cromatografia gasosa (CG). Cromatografia Liquida Na cromatografia liquida a fase móvel é o liquido que percorre a coluna chamada de eluente pode ser tanto uma solução salina, solução tampão quanto um solvente orgânico dependendo do tipo de cromatografia que esta sendo aplicado no experimento. A fase estacionaria e o gel que preenche a coluna com sua composição bastante diversificada da cromatografia liquida onde á uma enorme gama de possibilidades para isolamento e obtenção de preparações proteicas. A resolução de uma coluna cromatográfica que significa a capacidade de distinguir as diferentes frações de uma amostra durante o progresso de analise. Depende do tipo de eluente da fase estacionaria da altura da coluna do fluido ou vazão do fluente pela coluna da temperatura. No processo cromatográfico de mistura são registrados com picos em um gráfico de absorvência por volume de diluição após sua detecção. Os aparelhos cromatográficos são detectores espectrofotômetros que varrem em comprimentos de onda que vai da faixa ultra violeta ao visível. Métodos de cromatografia: Cromatografia de gel ou peneira molecular. A cromatografia de gel ou exclusão ou peneira molecular é um tipo de cromatografia liquida, onde as proteínas são separadas em função de sua forma e do seu peso molecular. A resina é composta com furos ou canais variados contendo proteínas de diferentes quantidades e de volume ao ser aplicado na coluna terá seu conjunto de proteínas separadas da seguinte maneira: Proteínas de tamanho maior passam por fora das esferas e são eluidas primeiro, proteínas de tamanho menor conseguem entrar os buracos das esferas fazendo um percurso maior sendo eluidas depois. Cromatografia de troca iônica Na cromatografia de troca iônica as proteínas são separadas em função de sua carga, dessa forma tipos de resinas com trocadores específicos são utilizados: Trocador catiônico troca cátions (reserva com carga negativa); Trocador aniônico troca ânions (reserva com carga positiva). As trocas dependem de seu PKA do seu grupo de troca por isso existem trocadores fortes e fracos. É importante o tipo de trocador na fase estacionaria, mas o mais importante é o ph do tampão que é utilizado como eloente na fase móvel, esse ph determina as cargas da proteína da amostra que por sua vez faz a função dos pontos elétricos. Ph menor pI : ph<pI= carga positiva (ideal para trocação catiônica); Ph maior pI: ph>pI= carga negativa (ideal para trocação aniônicas). Cromatografia de Afinidade É um processo da separação usado para refinar moléculas ou um grupo de moléculas que estão em uma mistura bioquímica. Emprega duas fases: uma fase estacionária e uma fase móvel. É usada frequentemente para refinar biomoléculas tais como enzimas, anticorpos, e proteínas de recombinação. Pode igualmente ajudar a remover as substâncias prejudiciais tais como os micróbios patogénicos com os mesmos princípios. Por exemplo, uma proteína em uma solução pode ser refinada passando a através de uma coluna que tenha uma outra molécula anexada a ela (a ligante) que tem uma afinidade para a proteína. Quando ligam, este permitirá que a reative e que a solução do não-limite passe através da coluna. A molécula do alvo eluido então da ligante por uma mudança feita nas condições do amortecedor de modo que a proteína possa ser removida dessa superfície. Cromatografia Gasosa A separação ocorre na coluna, onde á duas fases são envolvidas: Fase estacionária: a fase estacionária reside dentro da coluna; Fase móvel (gás de arraste): a fase móvel move sobre a fase estacionária. A Cromatografia Gasosa (CG) é uma técnica para separação e análise de misturas de substâncias voláteis. A amostra é vaporizada e introduzida em um fluxo de um gás adequado denominado de fase móvel (FM) ou gás de arraste. Este fluxo de gás com a amostra vaporizada passa por um tubo contendo a fase estacionária FE (coluna cromatográfica), onde ocorre a separação da mistura. A FE pode ser um sólido adsorvente (Cromatografia Gás-Sólido) ou, mais comumente, um filme de um líquido pouco volátil, suportado sobre um sólido inerte (Cromatografia Gás-Líquido com Coluna Empacotada ou Recheada) ou sobre a própria parede do tubo (Cromatografia Gasosa de Alta Resolução). Na cromatografia gás-líquido (CGL), os dois fatores que governam a separação dos constituintes de uma amostra são: A solubilidade na FE: quanto maior a solubilidade de um constituinte na FE, mais lentamente ele caminha pela coluna. A volatilidade: quanto mais volátil a substância (ou, em outros termos, quanto maior a pressão de vapor), maior a sua tendência de permanecer vaporizada e mais rapidamente caminha pelo sistema. Vídeo- 3 Método de cromatografia na pratica A cromatografia em coluna é comumente utilizada para purificação de substâncias orgânica, ou para remover o material de partida ou isolar o produto desejado de uma reação. Para isto, a mistura é passada através de um tubo de vidro vertical preenchido com sílica, alumina ou outra fase estacionária e é coletada em pequenas frações. Os vários componentes de uma amostra podem ser separados através da interação diferenciada com o solvente na fase móvel e a fase estacionária. Para uma fase estacionária contendo sílica, compostos polares irão interagir mais fortemente que compostos não polares, ficando mais retidos e sendo eluídos posteriormente. Quando a polaridade dos componentes da amostra é similar, a separação/purificação se torna um desafio. Se feita de maneira correta, a cromatografia em coluna pode levar a compostos com alto grau de pureza.
