Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL TÉCNICO EM BIOTECNOLOGIA PROCESSOS BIOQUÍMICOS RELATÓRIO SOBRE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS E DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS Carolina Bibiano Villar Carolina Beatriz Marinho Eduarda Picoli Ferreira Professora Alessandra Nejar Bruno Porto Alegre, 25 de setembro de 2018. INTRODUÇÃO 1. Proteínas As proteínas são polímeros de aminoácidos, que por sua vez são compostos por um grupo amino (-NH) e um grupo carboxila (-COOH), tendo como exceção à prolina, que contém um grupo imino (-NH-) no lugar do grupamento amino. Além disso, os aminoácidos possuem uma fórmula comum, na qual os grupos amino e carboxila estão ligados ao carbono , ao qual também se liga um átomo de hidrogênio (-H) e um grupo variável conhecido como cadeia lateral ou grupo R. (MARZZOCO; TORRES, 1999). As proteínas são moléculas que possuem diferentes formas e funções, as quais podem ser classificadas como estruturais e dinâmicas. Elas formam elementos do esqueleto celular e estruturas responsáveis pela sustentação, como o colágeno e a elastina. As proteínas também desempenham um importante papel nos processos biológicos, já que incluem as enzimas, que catalisam milhares de reações químicas que ocorrem nos organismo. Elas também têm à função dinâmica de transporte de moléculas, como, por exemplo, o transporte de oxigênio por hemoglobina. Além disso, estão presentes nos mecanismos de defesa do organismo, controle do metabolismo (ação hormonal) entre outras funções. (MARZZOCO; TORRES,1999) O valor biológico de uma proteína na dieta é uma medida de sua qualidade - isto é, sua capacidade de fornecer os aminoácidos essenciais requeridos para a manutenção dos tecidos. Os valores biológicos são medidos em uma escala relativa, com a proteína total do ovo ou albumina de ovo com escore 100. (CHAMPE, 2000) Os seres humanos não têm necessidades dietéticas de proteína em si; em vez disto, a proteína no alimento fornece aminoácidos essenciais. Dez dos 20 aminoácidos necessários para a síntese de proteínas corporais são essenciais - isto é,eles não podem ser sintetizados nos seres humanos em uma velocidade adequada. Desses dez, oito são essenciais em qualquer situação, enquanto dois (arginina e histidina) são requeridos somente durante períodos de crescimento rápido dos tecidos, característico da infância e da recuperação de uma doença(CHAMPE, 2000) 1.1 Estrutura Primária A estrutura primária é caracterizada pela sequência única de aminoácidos em uma cadeia polipeptídica (Artigo Proteins). Embora a sequência de aminoácidos em algumas regiões da estrutura primária possa variar consideravelmente sem afetar a função biológica, a maior parte das proteínas contém regiões cruciais que são essenciais para suas funções e cuja sequência é, portanto, conservada. A fração da sequência geral que é crítica varia de proteína para proteína, complicando a tarefa de relacionar a sequência à estrutura tridimensional, e a estrutura à função. (LEHNINGER, 2014) 1.2 Estrutura Secundária A estrutura secundária se refere a arranjos particularmente estáveis de resíduos de aminoácidos dando origem a padrões estruturais recorrentes (LEHNINGER, 2014). O dobramento do polipeptídeo em algumas regiões dá origem à estrutura secundária da proteína. As estruturas secundárias mais comuns são a α-hélice e a folha-β. Ambas estruturas são mantidas pela presença de ligações de hidrogênio, que se formam entre o oxigênio do grupo carbonila de um aminoácido e o hidrogênio do grupo amino de outro aminoácido. (Artigo Proteins) 1.3 Estrutura Terciária A estrutura terciária é tridimensional, isto é resultante das interações entre os grupos R dos aminoácidos que compõem a proteína, como as ligações de hidrogênio, ligações iônicas, interações dipolo-dipolo, ligação iônica e forças de dispersão London.(Artigo Proteins) A estrutura terciária descreve todos os aspectos do enovelamento tridimensional de um polipeptídeo. (LEHNINGER, 2014) Por exemplo, as ligações iônicas ocorrem quando os grupos R possuem cargas iguais e causam repulsão uns pelos outros, e quando os grupos R possuem cargas diferentes, ocasionando uma atração uns pelos outros. Outro tipo são as interações hidrofóbicas que ocorrem quando no dobramento de proteínas, os grupos R não polares (hidrofóbicos) estão no interior da proteína, enquanto os grupos R hidrofílicos estão no lado de fora. Já a ligação covalente ocorre quando a interação entre as cadeias laterais de cisteína formam ligações dissulfeto na presença de oxigênio. (Artigo Proteins) 1.4 Estrutura Quaternária Algumas proteínas são formadas por vários polipeptídeos, também conhecidos como subunidades, e a interação dessas subunidades forma a estrutura quaternária. São as interações que ocorrem entre as subunidades que ajudam a estabilizar a estrutura geral. (Artigo Proteins) 2. Aplicações O desenvolvimento de metodologias para determinar proteínas têm, cada vez mais, se tornado de fundamental relevância em várias áreas do conhecimento, como por exemplo, em análises clínicas, favorecendo o diagnóstico de certas doenças correlacionadas com a alteração da quantidade de proteínas nos fluidos biológicos; em nutrição animal, ressaltando o aproveitamento racional de nutrientes; em problemas relacionados à nutrição humana, como obesidade, anorexia nervosa, desnutrição, devendo as dietas apresentar teor balanceado de proteínas; em tecnologia e ciências de alimentos, objetivando o aproveitamento racional da matéria prima e o melhoramento dos produtos novos e já existentes; em ecologia, relacionando o comportamento alimentar com a quantidade de proteína ingerida dos alimentos, favorecendo o entendimento dos vários aspectos da vida dos animais silvestres; e na área de química de proteínas objetivando purificar novas proteínas e enzimas. (ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J, 1998) 3. Desnaturação e agentes desnaturantes As proteínas têm uma existência surpreendentemente precária. A conformação de uma proteína nativa é apenas marginalmente estável. Além disso, a maioria das proteínas deve manter certa flexibilidade conformacional para funcionar. A estabilidade marginal da maioria das proteínas pode produzir um balanço tênue entre os estados dobrados e desdobrados. A perda de estrutura tridimensional suficiente para causar a perda de função é chamada de “desnaturação”. O estado desnaturado não necessariamente corresponde ao desdobramento completo da proteína e à randomização da conformação. Na maioria das condições, as proteínas desnaturadas existem como um conjunto de estados parcialmente dobrados. (LEHNINGER, 2014) A desnaturação frequentemente leva à precipitação de proteínas, uma consequência da formação de agregados proteicos pela exposição de superfícies hidrofóbicas associadas. Os agregados são, com frequência, altamente desordenados.O precipitado proteico visto após ferver um ovo é um exemplo. Agregados mais ordenados também são observados em algumas proteínas. (LEHNINGER, 2014) 3.1 Sais (Sulfato de Amônia) A centrifugação precipita as proteínas pelo fato de que ela rompe com as ligações das moléculas mecanicamente. E o sulfato de amônia age ligando-se às cadeias laterais da proteína. 3.2 Ácidos Fortes (Ácido Tricloroacético) É um tratamento relativamente brando, já que nenhuma ligação covalente da cadeia polipeptídica é rompida. Extremos de pH alteram a carga líquida da proteína, causando repulsão eletrostática e o rompimento de algumas ligações de hidrogênio. (LEHNINGER, 2014) 3.3 Metais Pesados (Acetato de Chumbo) Desnatura proteína pois há incorporação do chumbo nas cadeias laterais dos aminoácidos. 3.4 Calor (+80ºc no banho-maria) A maioria das proteínas pode ser desnaturada pelo calor, que tem efeitos complexos nas muitas interações fracas da proteína (principalmente sobre as ligações de hidrogênio). Se a temperatura é aumentada lentamente, a conformação da proteína em geral permanece intacta até que, em uma estreita faixa de temperatura, ocorre uma perda abrupta da estrutura (e da função). A mudança repentina sugere que o desdobramento é um processo cooperativo: a perda de estrutura em uma parte da proteína desestabiliza as outras partes. (LEHNINGER, 2014) 4. Ponto isoelétrico Ponto isoelétrico é quando há equivalência de cargas, ou seja, o número de cargas positivas e negativas se igualam, causando a neutralidade.Quando a amostra chega no PI significa que ela precipitou, ou seja, ocorre a diminuição da solubilidade da amostra, pois o soluto vai interagir mais com o soluto e menos com o solvente, ocasionando a diminuição da solubilidade. O ponto isoelétrico nem sempre é visível, pois a amostra pode ser menos concentrada, ou seja, possuir pouco soluto. Com isso, é possível descobrir o ponto isoelétrico de uma amostra à partir da verificação de seu pH, porém a forma mais precisa de determinar o PI de uma proteína é realizando a técnica de titulação. OBJETIVOS Verificar experimentalmente a precipitação de proteínas com e sem desnaturação e determinar o ponto isoelétrico médio das proteínas de amostras biológicas. MATERIAIS E MÉTODOS ● Materiais 6 Tubos Falcon de 15 ml 9 tubos de vidro grande 25 ml de leite 4 ml de solução saturada de (NH4)2SO4 (sulfato de amônio) – aprox. 4 M 35 ml tampão fosfato ph 7,0 2 ml da solução de acetato de chumbo 20% 2 ml ácido tricloroacético 10% Pêras 3 pipetas de vidro de 2 ml; 3 pipetas de vidro de 5ml; 2 pipetas de vidro de 1ml 1 béquer de vidro de 2 L para banho maria Banho maria Centrífuga com adaptador para tubos falcon 1 Estante para tubos de ensaio Água destilada 8mL de Ácido acético 0,1 M Indicador de pH ou potenciômetro 3 pipeta de vidro de 5mL 1 pipeta de vidro de 1mL 1 micropipeta de 40-200 uL 1 micropipeta de 200- 1.000 uL ● Procedimento ➢ PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS (1) Experimento 1. Precipitação por sais 1. Adicionar, em 2 tubos falcon, 2 mL da solução protéica a ser testada (leite, clara de ovo e proteína isolada de soja). 2. Em um dos tubos contendo a amostra protéica, adicionar, pelas paredes do tubo, 2 mL da solução de sulfato amônio -(NH4)2SO4; 3. No outro tubo (controle) com a amostra proteína, adicionar 2mL de tampão fosfato (PBS) pH 7,0, ao invés de (NH4)2SO4. 4. Misturar ambos, por inversão, e anotar o resultado comparando o tubo contendo o sal (tubo teste) e o tubo controle; 5. Centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos; 6. Descartar o sobrenadante e observar o tamanho do pellet formado; 7. Anotar os resultados observados comparando o tubo contendo o sal (tubo teste) e o tubo controle; Experimento 2. Precipitação por metais pesados 1. Adicionar, em 2 tubos falcon de centrífuga, 1 mL da solução protéica; 2. Em um deles, adicionar 1 mL da solução de acetato de chumbo -(CH3COO)2Pb; 3. No outro tubo (controle), adicionar 1 mL de PBS ao invés de acetato de chumbo. 4. Misturar por inversão; 5. Anotar os resultados comparando o tubo contendo o metal pesado (tubo teste) e o tubo controle; Experimento 3. Precipitação por ácidos fortes 1. Adicionar, em um tubo falcon de centrífuga, 1 mL da solução protéica; 2. Adicionar 1 mL da solução de Ácido tricloroacético 10% (ou outro ácido forte a 10%). 3. Misturar por inversão e anotar os resultados comparando o tubo contendo o ácido forte (tubo teste) e o tubo controle contendo PBS. Como o volume final é o mesmo do experimento 02, pode-se usar o seu tubo controle para a comparação; Experimento 4. Precipitação pelo calor 1. Adicionar a um tubo de ensaio DE VIDRO 3 mL de solução de proteína. 2. Colocar o tubo em banho-maria fervente por 15 minutos. 3. Observar e anotar os resultados. ➢➢ DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO DAS PROTEÍNAS DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS (2) 1. Dispor uma série de tubos de ensaio, conforme tabela. 2. Agitar todos os tubos vigorosamente. 3. Deixar decantar por cerca de 10 minutos. 4. Observar a turbidez e determinar o pH do tubo que apresentar maior precipitação. 5. Indicar o pI das amostras utilizados. RESULTADOS Experimento 1: Precipitação de proteínas por: 1) Sais Tubo 1 (Leite de soja + (NH4)2SO4) Tubo 2 (Leite + Tampão PBS) Após centrifugar a amostra foi possível observar o pellet e o sobrenadante de forma bifásica no interior do tubo falcon 1 e no tubo controle (2) não houve precipitado. 2) Metais pesados Tubo 1 (Leite de soja + (CH3COO)2Pb) Tubo 2 (Leite de soja + Tampão PBS) Ao colocar Acetato de Chumbo no tubo 1, foi possível notar uma rápida precipitação da amostra. Ao comparar os dois tubos foi possível notar uma grande diferença em relação à precipitação das amostras pois no tubo controle (2) não houve qualquer tipo de mudança visível, enquanto no tubo com Acetato de Chumbo(1) a visualização foi nítida e rápida. Imagem 1:O tubo controle é o que contém a amostra de leite de soja e o tampão PBS, já o outro tubo contém a amostra de leite de soja com acetato de chumbo (metal pesado). 3) Ácidos fortes Tubo 1 (Leite de soja + Ácido tricloroacético 10%) Tubo 2 (Leite de soja + Tampão PBS) No tubo 1, ao agitá-lo foi possível identificar a precipitação da proteína, mas em menos quantidade ao compararmos com o tubo que colocamos o agente desnaturante metal pesado. Ao comparar com o tubo controle (2) não houve qualquer tipo de mudança visível, enquanto no tubo (1) a precipitação foi nítida. Imagem 2: O tubo controle contém a amostra de leite de soja e o tampão PBS, já o outro tubo contém a amostra de leite de soja em que foi adicionado ácido tricloroacético 10% (ácido forte). 4) Calor (80ºc em banho-maria) Tubo único (Leite de Soja) Este foi o único tubo que não foi possível notar uma diferença bifásica com relação a precipitação das proteínas presentes no leite de soja. A única mudança foi a sua textura, pois após retirarmos o tubo do banho-maria o leite grosso. Imagem 3: Tubo contendo apenas leite de soja após ser submetido calor excessivo durante 15 minutos. Nota-se o aspecto mais grosso que a amostra ficou.Experimento 2: Determinação do ponto isoelétrico das proteínas de amostra biológica Nº do tubo 0 1 2 3 4 5 6 Água destilada (mL) 4,5 4,4 4,3 4,0 3,5 2,5 0,5 Ácido acético 0,1 M (mL) 0,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0 Solução protéica (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 pI -- -- -- -- -- -- 3,99 Tabela 1: Tabela referente ao experimento da determinação do ponto isoelétrico das proteínas da amostra do leite de soja. Neste experimento, os tubos 3, 4 e 5 não foram feitos devido o curto tempo de aula. Tubo 0: Representa o controle, não foi observado o processo de precipitação e nem a perda de solubilidade pois nesse tubo não foi utilizado nenhum agente desnaturante. Tubo 1: É provável que tenha ocorrido o processo de desnaturação, mas não reduziu de forma significativa a solubilidade pois a concentração do ácido acético, o agente desnaturante, não era tão alta a ponto da precipitação ser facilmente visualizada. Tubo 2: Foi possível observar a precipitação, mas a diferença de fases foi menor. Tubo 6: Foi o tubo em que a visualização da precipitação foi mais significante, pois nele a concentração do agente desnaturante foi mais alta que nos demais. Dado P.I = 3,99 Imagem 4. Tubo 1 após a decantação de 10 minutos Imagem 5 e 6: Tubo 6 após decantar por cerca de 10 minutos. Imagem 7. Tubo 6 após ser agitado com a finalidade de observar os “talhados” (precipitado) na parede dos tubos. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO Precipitação de proteínas Foi observado durante o experimento, quando ocorreu a precipitação de proteínas que a principal propriedade observada foi: a solubilidade. A diminuição de solubilidade em algumas amostras, é explicada pela exposição de radicais apolares (hidrofóbicos) e outros, os quais prejudicam a interação proteína-solvente e favorecem a interação proteína-proteína, formando um precipitado. Além da solubilidade alterações como a viscosidade da solução foram observadas nas amostras, assim como em algumas também houve a alteração de coloração. O sal utilizado, sulfato de amônio (NH4)2SO4, devido a sua propriedade em baixa concentração pode aumentar a solubilidade de muitas proteínas (solubilização por salificação), isso porque a interação da proteína com o sal causa a diminuição da interação proteína-proteína. Já em concentrações elevadas, a solubilidade da proteína se reduz gradativamente (precipitação por salificação), isso porque acredita-se que a concentração elevada de sal pode remover água de hidratação das moléculas protéicas, levando a um aumento na interação proteína-proteína, ocorrendo precipitação. Após a adição do sal nós utilizamos a centrífuga para acelerar o processo de precipitação, porém, se esperássemos por muito tempo conseguiríamos observar a mudança do conteúdo do tubo do mesmo jeito. A precipitação por metal pesado foi utilizado o acetato de chumbo (CH3COO)2Pb, a adição de sais de metais pesados, tais como mercúrio, chumbo, cobre, zinco levam a formação de sais denominados “quelatos’’ entre os aminoácidos ácidos e estes metais. As proteínas precipitam porque estes sais são insolúveis em água e também porque, com a quebra das ligações iônicas, os aminoácidos hidrofóbicos ficam mais expostos ao meio aquoso. Os metais pesados (Pb, Hg, Ag, Cu) causam a desnaturação de proteínas, isto é, modificam a sua conformação natural com a atividade biológica, para uma conformação não natural, biologicamente inativa (desnaturada). As moléculas protéicas desnaturadas precipitam porque o chumbo é insolúvel em água. Os metais pesados precipitam as proteínas por desnaturação. O ácido forte utilizado no experimento “precipitação de proteínas” foi o ácido tricloroacético 10%. Quando a proteína está com pH abaixo do ponto isoelétrico, as bases provenientes de ácidos fortes são exemplos de íons negativos que combinam-se com partes positivas de proteínas, formando complexos insolúveis, que precipitam na solução. Como exemplos dessas bases podemos citar os alcalóides, uma classe de compostos naturais, e as bases derivadas do ácido tricloroacético (TCA). Esses reagentes também têm ação desnaturante, ou seja, provocam a perda da conformação tridimensional da proteína de forma irreversível. Conseqüentemente, a proteína separada por esse método perde a sua função. Precipitação por ação de calor, o calor fornecido a proteína provoca desestabilização das interações fracas (pontes de hidrogênio, interações dipolo-dipolo, interações de Van der Vaals, etc.) acarretando em um desarranjo da conformação tridimensional desta estrutura. Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação e altera as estruturas secundária, terciária e quaternária das proteínas, não afetando suas estruturas primárias (pontes dissulfeto e ligações covalentes não são afetadas). A desnaturação promove alterações na solubilidade da proteína, levando à sua precipitação. Com o aquecimento da solução de proteínas, verificou-se precipitação. Ao realizar os experimentos, foi possível observar a propriedade da proteína aqui discutida, a solubilidade. E, de acordo com a observação e o estudo detalhado, conclui-se que as proteínas sofrem alterações causadas pela desnaturação quando expostas ao calor, ácidos, sais, metais pesados, entre outros, que resultam na diminuição da solubilidade, perda de atividade, alteração na viscosidade, etc. Sendo o melhor método a precipitação por sais em conjunto da centrífuga. Ponto isoelétrico Para descobrirmos os pontos isoelétricos usamos a amostra que demonstrou maior precipitação. A precipitação está intimamente ligada a concentração do agente desnaturante, como vimos, o tubo 2 era mais diluído que o tubo 6, então houve mais precipitação no 6, pois era mais concentrado que o 2. Então o escolhido foi o tubo 6, porque a precipitação é uma das características que acompanha o PI (momento que as cargas da proteína são neutras). Desse modo, utilizamos a amostra do tubo 6. O pH da amostra foi 3,99, que podemos inferir ser o PI da proteína, porém não há uma exatidão nessa afirmação, visto que a melhor técnica para descobrir esse dado é a titulação. O pH característico no qual a carga elétrica final é zero é chamado de ponto isoelétrico ou pH isoelétrico (LEHNINGER, 2014). Como sabemos o pH influencia na solubilidade das proteínas, pois interfere nas cargas dos radicais que constituem essa biomolécula, e esse é um dos fatores que é responsável pela solubilidade delas. No PI como elas estão em equilíbrio de cargas elas apresentam baixa solubilidade e tendem a precipitar, pois a força de repulsão das moléculas e a interação com o solvente são mínimas, o que gera aglomerados proteicos que precipitam. Não sabemos se a bebida de soja utilizada para amostra era feita a partir de extrato de soja ou proteína isolada, mas o ponto isoelétrico da literatura foi diferente da qual conseguimos na amostra. O leite de soja que utilizamos para amostra pode ser obtido através do processo de extratoda soja ou da proteína isolada de soja, possui um ponto isoelétrico diferente, pois o ponto isoelétrico da proteína isolada de soja é ≈4,5 e o valor que inferimos ser o pH foi 3,99. Outro fator que pode influenciar é a preparação das amostras. Mesmo que não tenha sido observado nenhum erro durante o processo, uma das possibilidades é que tenha ocorrido baixa acidificação da amostra o que influencia nos resultados de pH e o tempo de decantação. Ou ainda, o mau funcionamento dos pHmetros. BIBLIOGRAFIA 1. Artigo Proteins. Disponível em: <https://cnx.org/contents/GFy_h8cu@9.85:2zzm1QG9@7/Proteins> 2. CHAMPE, Pamela C.; HARVEY, Richard A.. Bioquímica ilustrada. 2 ed. Porto Alegre: Artmed, 2000. (pg 314) 3. Disponível em: <https://pt.khanacademy.org/science/biology/macromolecules/proteins-and-amino-acids/a/ord ers-of-protein-structure> 4. MARZZOCO, A.; Torres, B. B.. Bioquímica Básica. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S.A, 1999 (pg 11-13) 5. NELSON, L. D.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger: 6. ed. Porto Alegre: Editora ARTMED, 2014 6. ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Scielo, 1998
Compartilhar