Técnica de Pulldown GST

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Pull-down 
A técnica de pulldown de proteína de fusão GST usa a afinidade de GST para esferas acopladas a glutationa para purificar proteínas que interagem a partir de uma solução de proteínas não interagentes. A proteína sonda de fusão da GST é expressa e purificada a partir de bactérias. Em paralelo, um lisado celular (que pode ser marcado com 35S ou não marcado) é preparado. A sonda de proteína de fusão GST e o lisado celular são misturados na presença de esferas de glutationa-agarose e incubadas para permitir que ocorram associação de proteínas. A proteína sonda de fusão GST e quaisquer moléculas associadas são recolhidas por centrifugação e os complexos são lavados. Os complexos podem ser eluídos das pérolas com excesso de glutationa livre ou fervidos diretamente em SDS-PAGE-tampão de carregamento de gel. As proteínas são dissolvidas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e processadas para análise adicional por Western blotting, autorradiografia ou coloração de proteína. A técnica de pulldown GST é especialmente útil para sondar interações de proteínas em solução que podem passar despercebidas em um ensaio baseado em membrana.
Duas utilizações gerais de experimentos de GST pulldown são para identificar novas interações entre uma proteína de fusão (ou sonda) e proteínas desconhecidas (ou alvo) e para confirmar suspeitas interações entre a proteína sonda e uma proteína conhecida. Esses dois experimentos são projetados e executados de maneira diferente.
Ao tentar identificar novas interações entre uma sonda e proteínas desconhecidas, é possível que as proteínas desconhecidas estejam em concentrações limitantes. Para identificar uma nova interação, a proteína desconhecida deve estar presente em quantidades suficientes para permitir que a interação seja visualizada com o método de detecção escolhido. Os lisados ​​celulares radiomarcados são a fonte de proteína mais frequentemente utilizada para experiências deste tipo. Algumas perguntas importantes a serem feitas antes de escolher a fonte das proteínas de teste são: A proteína sonda é normalmente expressa naquela célula ou tecido em particular? Se não, as proteínas tragetas fisiologicamente relevantes também podem não estar presentes. O objetivo é comparar diferentes tipos de populações de células (ex. Células quiescentes versus células de ciclo ou células tratadas com fator de crescimento versus células não tratadas)? Contemplar essas variáveis ​​em um estágio inicial pode significar a diferença entre sucesso e fracasso.
Se uma interação prevista entre a proteína sonda e outra proteína está sendo testada, o desenho experimental é mais simples. Uma ampla variedade de fontes de proteína pode ser usada para identificar e mapear a interação. O método usado para detectar a interação é determinado pela disponibilidade de anticorpos para a proteína alvo. Se nenhum estiver disponível, a proteína traduzida in vitro marcada com S pode ser utilizada ou a proteína alvo pode ser marcada com um epítopo. É necessário, as células em cultura podem ser transferidas com um plasmídeo que codifica a proteína alvo para aumentar a abundância dessa proteína para análise. No entanto, é importante controlar os efeitos da ação de massa (ex. Agregação não específica) e assegurar a especificidade da ligação é a inclusão de uma proteína de fusão GST com uma interação domais mutada. A perda de ligação com esta proteína sonda mutada sugere que a associação normal entre o alvo e a sonda é específica. Também é importante testar a ligação entre a proteína alvo putativa e a GST.
A técnica de pulldown GST deve ser otimizada para cada complexo de proteínas sendo testado. Uma variável importante é o buffer no qual as interações ocorrerão. Este é frequentemente o tampão no qual as proteínas parceiras potenciais são preparadas e podem variar de um tampão de lise celular (tal como RIPA) a uma mistura de reação de tradução in vitro. Uma grande variedade de buffers funciona, no entanto, a eficiência da interação pode ser afetada pelos buffers usados. Outra variável a considerar é a quantidade de proteína alvo misturada com a proteína de fusão (sonda). A quantidade de material requerida é determinada principalmente pela abundância da proteína alvo e pela afinidade da interação (ambos os parâmetros são geralmente desconhecidos quando o experimento é iniciado). Finalmente, as condições usadas para lavar as contas devem ser otimizadas. Neste protocolo, o tampão de lise celular é usado para lavar os complexos de puldown de GST; no entanto, tampões com diferentes concentrações de sal e detergente podem ser usados ​​nesta etapa para eliminar interações não específicas. Experiências de suspenso de GST têm uma vantagem sobre far westerns: A proteína sonda é incubada com potenciais proteínas parceiras em um ambiente mais nativo, aumentando assim a eficiência das interações.