Aula 7

Prévia do material em texto

Testes Biológicos em 
Biomateriais
Bruna N. Teixeira
Laboratório de Biopolímeros – I245
e-mail: bnarj86@gmail.com
Desenvolvendo um dispositivo médico
Conhecer as relações entre 
estrutura - função do 
tecido/órgão; 
Conhecer as relações entre 
estrutura - função do 
tecido/órgão; 
Conhecer as condições 
fisiológicas relacionadas a 
função do tecido/órgão;
Conhecer as condições 
fisiológicas relacionadas a 
função do tecido/órgão;
Definir as propriedades 
alvo para o 
material/dispositivo;
Definir as propriedades 
alvo para o 
material/dispositivo;
Planejar os ensaios de 
caracterização para 
avaliação da 
biocompatibilidade do 
material/dispositivo em 
desenvolvimento;
Planejar os ensaios de 
caracterização para 
avaliação da 
biocompatibilidade do 
material/dispositivo em 
desenvolvimento;
Caracterização de Biomateriais
 Ao desenvolver um biomaterial, é importante ter
conhecimento de suas propriedades físicas e químicas;
 É preciso reproduzir as condições encontradas in vivo
Caracterização de Biomateriais – 1ª
etapa
Caracterização do 
Biomaterial
Testes in 
vitro
Testes in 
vivo
Caracterização de Biomateriais – 2ª
etapa
Ensaios Técnicos
Testes Pré Clínicos
Testes Clínicos
???
???
5 anos!
Caracterização do Material Caracterização do Material 
Morfologia e/ou ComposiçãoMorfologia e/ou Composição
MEV/EDSMEV/EDS MET/EDSMET/EDS Difração de Raios X
Difração 
de Raios X XPSXPS FTIRFTIR
Medida de 
Rugosidade
Medida de 
Rugosidade
PerfilometriaPerfilometria Microscopia confocal
Microscopia 
confocal
Testes 
Mecânicos
Testes 
Mecânicos
1. Dissolução da 
superfície do 
biomaterial;
2. Precipitação da 
solução sobre o 
biomaterial;
3. Troca de íons e 
rearranjo estrutural 
do biomaterial;
4. Interdifusão da 
camada formada na 
superfície do 
biomaterial;
5. Efeitos sobre a 
atividade das 
células adjacentes 
ao implante;
6. Deposição das 
fases mineral ou 
orgânica sem 
integração;
7. Deposição com 
integração;
9. Adesão e 
proliferação celular;
10. Diferenciação 
celular;
11. Formação de 
matriz extracelular.
Eventos da interação tecido – biomaterial:
Avaliação do Desempenho Biológico
• Testes in vitro constituem a primeira
etapa na seleção de materiais
– Hemocompatibilidade (ASTM F756)
– Citotoxicidade (ASTM F813, F895)
Testes in Vitro
Cultura Celular
Conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter células
isoladas fora do organismo, sem que ocorra perda de
características morfofisiológicas
Crescimento de linhagens celulares a partir de células isoladas,
aderidas à superfície de garrafas/placas de cultura
Cultura Celular
Cultura Celular
Cultura primária;
• Aproxima-se mais das propriedades biológicas do 
tecido original
Linhagens estabelecidas;
• Mais fácil de manter em laboratório
Tipos celulares
Vantagens da Cultura Celular 
Estudo de 
fenômenos 
inacessíveis em 
tecidos intactos
Uso de células bem 
caracterizadas
Controle das 
condições do 
ambiente (pH, 
temperatura, O2, etc)
Conhecimento do 
comportamento e 
função da linhagem 
utilizada
Economia de 
reagentes e tempo
Avaliação in vitro da Biocompatibilidade
Citotoxicidade
Morfologia Proliferação Atividade Metabólica Genotoxicidade
Avaliação in vitro da Biocompatibilidade
• Ensaios de contato direto;
• Adição de extratos;
• Ensaios de contato indireto – Material testado é separado das células por uma
barreira de difusão (ágar ou agarose) ou substâncias são extraídas do material a
ser testado, através de um solvente e colocada em contato com as células.
Avaliam a viabilidade celular (integridade de membrana, replicação, fagocitose,
ativação de quimiotáxicos, secreção de citocinas e proteínas de matriz, entre
outros
Citotoxicidade
A toxicidade de um biomaterial é definida como a capacidade de liberar
substâncias que possam causar danos, ou morte celular, direta ou
indiretamente, através da inibição das vias metabólicas.
Testes devem ser realizados para avaliar os materiais e identificar aqueles que
apresentam comportamento citotóxico, sendo possível selecionar apenas os
materiais mais adequados para a aplicação in vivo, minimizando assim o
número de animais experimentais.
ISO 10993-5:2009 - Biological evaluation of medical devices -- Part 5: Tests for in vitro
cytotoxicity
ASTM F-813-83 - Método de contato direto para avaliação de materiais e dispositivos
médicos frente à cultura de células;
ASTM F-895-84 - Método de difusão em ágar de cultura de células para seleção de
materiais por citotoxicidade;
Testes in vitro para avaliação da citotoxicidade
Testes in vitro para avaliação da citotoxicidade
 Os testes de extrato e de contato direto possibilitam avaliar,
qualitativa e quantitativamente, a citotoxicidade dos materiais
ou da viabilidade das células quando em contato com os
materiais.
Como preparar um extrato???
É feita imersão do biomaterial, em meio de
cultura, sem soro fetal bovino, por 24h ou o
tempo experimental determinado. Após esse
período, o material é removido do meio e
obtém-se o extrato.
Testes in vitro para avaliação da citotoxicidade
Testes in vitro para avaliação da citotoxicidade
Os testes de contato indireto (extratos) permitem,
APENAS, a avaliação qualitativa da citotoxicidade,
enquanto que os textes de contato direto permitem
avaliar resposta biológica ao material.
Proliferação celular
• Incubar célula no material
• Cultivar por x horas/dias a 37°C em ambiente
com 5% de CO2
– Métodos colorimétricos
– Microscopia de Fluorescência
– Microscopia Confocal
– Técnicas que empregam biologia molecular
• Como analisar???
Contagem manual 
ou via software
Ensaios Colorimétricos
Adição do corante
0
0,4
0,8
1,2
Day 1 Day 3 Day 7 Day 10 Day 14 Day 17 Day 21M
et
ab
ol
ic
 a
ct
iv
ity
 (A
bs
or
ba
nc
e)
PLA DopaCOL
Microscopia Confocal de Fluorescência
Live/Dead ®
Diferenciação
• Dosagem de proteínas
– Ex.: Para osteoblastos, dosar fosfatase alcalina.
• Detecção de marcadores específicos de
determinadas linhagens de células
– Ex.: Para osteoblastos, RANKL e OPG.
• Técnicas de biologia molecular
Testes Microbiológicos
• Utilizado para biomateriais cuja função é controlar 
uma infecção:
– Teste do halo de inibição;
– Teste da macro-diluição;
– Teste de permeabilidade;
Testes in Vivo
Por que fazer um teste in vivo?
• De acordo com a lei, um produto só pode ser
empregado no homem após testes prévios em modelo
animal;
• Esses testes fornecem dados sobre o comportamento
do biomaterial no organismo;
• Estudo da resposta inflamatória (aguda e crônica) e
relação destas em período tardio – Sucesso, ou não, do
biomaterial.
Modelos Animais
• Camundongos e ratos
• Coelhos; 
• Cachorros;
• Bodes; 
• Entre outros.
• Duração: 1 a 3 meses
Como selecionar modelos e testes?
• Considerar características (estruturais e químicas) e uso
pretendido do biomaterial;
• Aplicação clínica específica – considerando
semelhanças e diferenças entre o modelo e o homem;
• A similaridade das respostas de cura e remodelação do
local de teste com o previsto para o implante, no
homem, é fundamental na escolha de um modelo
animal.
Processos Biológicos – Resposta do Tecido 
aos Implantes
Espaço morto criado pelo implante
Trauma da implantação - Inflamação
Agentes solúveis liberados pelo implante (íons ou fragmentos de polímeros, 
por exemplo)
Interações químicas de moléculas biológicas com a superfície
Alteração na distribuição das forças nos tecidos - diferençano módulo de elasticidade 
entre implante e tecido vizinho
Movimento do implante – Falta de união entre tecido e biomaterial
Como Escolher Local para Implante
Vascularização
Natureza da célula quanto a capacidade mitótica e migratória –
capacidade regenerativa do tecido
Presença de macrófagos 
Efeito mecânico e resposta celular
E os testes?
• Avaliação Clínica – reação tecidual (edema,
alteração da cor, presença e cicatrização de
feridas, inchaço, expulsão do implante ...).
• Avaliação histológica e bioquímica.
Avaliação Histológica e Bioquímica 
• Histologia;
• MEV ;
• MET;
• Imunoistoquímica;
• Imunomicroscopia;
• Bioquímica celular e molecular;
• Microrradiografia;
• TESTES MECÂNICOS 
Morfologia do implante e 
tecido vizinho
Ética e o Uso de Modelos 
Animais
“A questão não é: podem eles raciocinar?
Ou então, podem eles falar?
Mas, podem eles sofrer ?”
(Jeremy Bentham, 1789)
A Ética na Pesquisa
• A ética não permite que humanos sejam testados sem que
o produto passe por testes em animais;
• Historicamente, nas duas grandes guerras foram
conduzidos experimentos em prisioneiros;
• Em alguns casos, é permitido que humanos se voluntariem
para testes específicos;
• Atualmente, a OMS liberou o uso de soro anti-Ebola sem
que testes in vivo fossem conduzidos.
De Acordo com a Lei
• A pesquisa em animais deve ter como diretrizes
mínimas:
– a definição de objetivos legítimos;
– A imposição de limites à dor e ao sofrimento;
– A fiscalização de instalações e procedimentos;
– A garantia de tratamento digno e de manutenção de
condições controladas;
– A responsabilização pública.
Princípios Orientadores da Utilização 
de Modelos Animais
• Os seres humanos são mais importantes que os animais (Será?),
mas os animais também tem importância, diferenciada de acordo
com a espécie considerada;
• Nem tudo o que é tecnicamente possível de ser realizado deve ser
permitido;
• Nem todo o conhecimento gerado em pesquisas com animais é
plenamente transponível ao ser humano;
• O conflito entre o bem dos seres humanos e o bem dos animais
deve ser evitado sempre que possível.
É impossível fazer testes em seres humanos
justamente porque não se pode ter controle
sobre eles e a pesquisa necessita de ambientes
rigorosamente controlados laboratorialmente
(biotérios);