Segunda parte de Biologia Molecular

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Segunda parte de Biologia Molecular
Epigenetica e controle da expressão genica
Genotipo e a constituição genética do organismo
Fenótipo e o conjunto de características observáveis – pode ser resultado do genótipo, fatores ambientais ( como uma cidade altamente poluída) e da interação entre eles – pode tornar o animal eficiente ou não 
Exemplo: artrogripose multiplex – leva a ma formação do animal, tendo seu fenótipo exclusivamente genético F=G
Gêmeos univitelinicos : podem apresentar fenótipo diferente mesmo tendo o mesmo genótipo, devido a fatores ambientais F=A
Organismos multicelulares : como células se diferenciam com base em seu microambiente, no entanto,tem o mesmo genótipo – regulação da expressão vai ser modulada F=A+GxA
Epigenetica
Quando o ambiente altera o fenótipo do animal . E as vezes seu genótipo 
Ex: nascer em ambiente, no qual existe falta de alimento, faz com que esse animal nasca menor que os demais – crescimento retardado devido a alimentação da mae 
Alguns efeitos podem ser passados para mais de uma geração – fenótipo transgeracional epigenetico
Ex: uma mae em fase gestacional que fuma afetara seu filho presente na barriga e também a células germinativas desse bebe que assim afetara a terceira geração
Comportamento materno x efeito na prole
Femeas que tem meljor comportamento materno fazem com que seus bebes na vida adulta sejam mais calmos, isso acontece devido a metilacao de alguns genes, expressando receptor glicocorticoide - ocorre essa expressão devido a descondensacão de determinadas partes da cromatina 
Ex: plantas de régioes temperadas – vernalizacao – so ocorre a floração após a exposição ao frio – existe um gene que inibe a floração, após o frio esse gene e inibido e assim ocorre a floração 
Gene imprinted: deveria expressar alelos do pai e da mae, no entanto, as vezes so o alelo determinado da mae e expresso, e o receptor do pai não , assim a mae a passa a expressar o receptor ( que deveria ser feito pelo pai ) Tambem , tendo ambas as funções expressar e ser um receptor para esse.
Definicao da Epigenetica
E o estudo das mudanças herdáveis na expressão genica sem alteração na estrutura do DNA. Podem ser estáveis toda a vida e ate transgeracionais – sem ser uma mutação 
Epigenoma: conjunto de marcas epigeneticas globais de uma celila - Essas marcas são feitas por enzimas que podem marcar e ler essas, e também apagar do código epigenetico 
Mecanismos epigeneticos que regulam a expressão do gene
Metilacao do DNA (ilhas de CPG): Pre-transcricao, regulação antes da formação do mRNA 
Metilacao do DNA nas ilhas CPG – silenciar as regiões promotoras dos genes – ligação d eum metil nessas ilhas colocados por enzimas 
Enzimas : Dna N-Metil Transferase 
DNMTs `` de novo `` - novas metilacoes ao longo da vida da célula 
DNMTs ``manutenção `` - mantem o perfil após a replicação do DNA – fitas metade metilados – fitas novas replicadas tem que ser iguais a fita mae ( o perfil) assim a enzima DNMT de manutenção coloca metil nessas fitas replicadas também ficando igual o DNA mae
De – Metil : retira metil caso seja necessário 
Modificacao das histonas : responsável pela condensação. Alteracoes das caudas das histonas apresenta amnoacidos que podem sofrer alterações pos – traducionais ira aumentar ou diminuir o nível de condensação 
- metilado a cromatina fica mais condensada – genes não expresso 
- acetilado a cromatina fica mais separada, menos condensada – assim o gene e expresso 
Metilacao e acetilacao dao reações competitivas
Quem controla ? fatores regulatórios da expressão genica ativam ou reprimem : histonas acetil- transferase, complexos proteicos de acetilase, histonas metil- transferase, histonas de metilase
Complexos de remodelamento de cromativa – varias proteínas juntas que deslizaram pelo DNA
Degradacao do mRNA por RNAs não codificadores : controle da expressão genica pos- traducional
Conhecida como : interferência por RNA ou silenciamento por RNA
Vantagem: produção de terapias
- Micro RNAs: importa para a regulação da expressão do genica . São oriundos de genes endógenos, transcritos pelo RNA pol 2, muito pequenos
Formação : tem Cap e Poli-A e sofre autopareamento, sodre a acao da RNAse 2, no citoplasma sofre influencia do RNAse 3 que fara cortes, depois dera reconhecido e acopla a esse o complexo RISC – corta, e degrada esse mRNA para que não forme proteína ( devido não ter mais proteção nas pontas)
Dependendo o quanto pareis degrada RNA rapidamente ou atrasa a tradução 
-Si RNA – importante para respostas ao vírus , geralmente exógenos, originários do RNA dupla fita
Variabilidade genética do ponto de vista molecular
Genotipo : constituição genética do individuo 
Fenótipo : características observáveis de um organismo ou população 
Melhoramento genético – baseado no fenótipo do animal e sua herdabilidade que pode variar com o ambiente 
- fenótipos podem variar conforme as pessoas e sua população
Variabilidade genética 
E a tendência de genótipo individuais numa população variar entre os indivíduos – feito através do sequenciamento 
Medida pela frequência alelica ou genotípica 
Ex: humanos – existe uma variação genotípica de 0,1 a 0,4% de variação de bases do DNA entre dois humanos distintos isso mais as variações ambientais que podem alterar os indivíduos
Causas da variabilidade – mutações em células germinativas , recombinação homologa durante a meiose ( reprodução sexual), epigenetica ( por algumas gerações – como uma mae fumante)
Células somáticas com variação como mutação so e importante para o individuo não passara para seus descendentes. Em células germinativas em animais e importante analise do DNA, pedigree, paternidade e sexagem
Doencas podem ser causadas por alterações genéticas – muitas são multiespecies 
Condições genéticas: ex o fenótipo de dupla musculatura do boi, devido a mutação do gene de miostatina – gene que perde a função causando o aumento da musculatura 
- função da miostatina : controla ativação das células tronco no musculo e regula a homeostase – não deixa proliferar tanto esse tipo de célula, se ela perde sua função não existe controle sobre essas células tronco 
Mutação recessiva passada para os descendentes 
-Biodiversidade = analise genética para fazer acasalamentos
Maior variação de alelo, conservação de espécies, maior variabilidade 
-selecao de DNA – melhoramento genético, seleção dos alelos favoráveis 
-marcadores moleculares
Uma variação no DNA pode existir entre os animais e e associado a expressão de uma característica, seja quantitativa ( ex: mais de um gene e responsável pela característica como produção de leite) ou qualitativa (ex: mutações altera o fenótipo )
Marcadores torna possível marcar uma característica 
Polimorfismo de nucleotídeo único = mais de uma forma de nucleotídeo, uma pessoa pode ter um e o outro pessoa um nucleotídeo diferente = 1 base
Variações estruturais 
Variações no numero de copias de genes (SNPs) = são sempre herdados ( todas as células ), quando a variação de frequência e >1%, constitui 90 % da fonte de variação 
A cada 100 a 300 bases uma variação. Deveria ser, mas não são aleatórios no genoma, mais frequentes em regiões não codificantes – assim menor pressão de seleção 
Exemplo :variação do gene calpaina 3 ( um único gene) deixa a carne do boi mais mascia – tem que combinar com uma dieta adequada e manejo 
Variação estrutural :variação do numero de copias, pedaços maiores de cromossomos, sua duplicação ao longo do tempo ou sua deleção que serão selecionados como o tempo .
Ex: CNVs associados com fenótipo de crescimento de bos Indicus. Outras variações : deleção, inserção, translocação, inversão, duplicação.
Variacao de sequencias repetitivas : régios do genoma que tem uma sequencia repetitiva ( ATATAT...) 
- microsatelites ( <6bp) - minissatélite ( >6bp)
Usa essa técnica para distinguir indidviduos, mas não estão relacionados a variabilidade
Classificacao das variantes alélicas do ponto de vista molecular 
Funcionais: são causais e podem alterar proteínas formadas( na estrutura ou quantidade) e podem também afetar a expressão do gene - Obs: causais – faz mudanças fenotípicas
Geralmente nas regiões codificantes e regulatórios 
Não funcionais : não são causais, assim não alteram as proteínas e a expressão genica, geralmente nas régios não codificantes. 
Ponto de vista nos efeitos nos genes
Funcionais : perde a função do gene, ganho de função e deminante negativo
Não funcionais: sem função 
Efeitos na proteína 
Funcionais : altera a frequência proteica, sem sentido ( quando se coloca um códon de para antes) e troca de sentido ( altera as bases mudando o sentido)
Não funcionais : sem função 
Marcacao que passam de geração para geração sem alterar a sequncia de DNA – Epigenetica
Marcadores moleculares e genotipagem
Variação do DNA – alelos diferentes que variam de um para o outro 
Alelos são sempre herdados – esse tem quantidade variada para cada gene
O que faz eles serem diferentes e o que eles causam 
Marcadores diretos : e a aquele funcional, portanto, causal aquela alteração leva ao fenótipo 
Marcadores indiretos : aquele não causais, mas marcam a característica, por desequilíbrio de ligação ( associado a variação responsável pela característica – linkage)
Ligação = ao longo das meioses causal e não causal então próximas que não sofrem crossing over mantendo esses marcadores ligados, sendo o não causal um marcador indireto ligado a um marcador direto que condiciona a característica – importante para a seleção 
Sendo sempre esse pedaço de DNA passado por gerações 
Desequilibrio de ligação – e a associação não aleatória de alelos em loci diferentes em determinada população – selecionados ao longo da evolução 
Cria bloco haplotipicos = pedaços de DNA mantidos ao longo das gerações . São pedaços importantes qur não podem ser perdido e não podem ser quebrados ou variados . Tendo sempre um marcador indireto ligado a um variante causal, que através desses poderam ser selecionados para que não ocorra crossing over 
Quando uma mutação vai para frente e algo não aleatório 
Marcadores são usados para descobrir características, no entanto, características poligênicas se usa vários marcadores ao mesmo tempo – tipo o ganho de peso 
Ex: calpaina – maciez – essa e ativada pela cálcio quando se rompe no reticulo sarcoplasmático, essa calpaina ira degradar as fibras musculares
Marcadores são usados para = diagnostico de doenças, genealogia ( pedrigree), detecção de portadores de alelos responsáveis por doenças genéticas, e teste de paternidade de animais , seleção assistida ( decisão sobre acasalamento, semem de touro, avaliar doadoras de embrião ), seleção de características de difícil mensuração ( eficiência alimentar, maciez), manejo assistido por marcadores (decisões de otimizacao de decisão de manejo), marketing assistifo ( decisões de compra e venda de animais)
Para analisar marcadores moleculares tem técnicas de biologia molecular = genotipagem de SNPs e CNVs
Genotipagem = identificar marcadores, pedaços de DNA que distingue os animais. Determina o genótipo, mostrando que alelos se tem , qual herda de cada pai, uso da sequencia de DNA, para características biológicas
Métodos baseado em enzimas – PCR e suas variações 
Tecnica de biologia molecular aplicada MV 
Servem para o diagnóstico e prognostico (saber se o animal irá melhorar ou piorar em relação a uma doença). 
Diagnóstico: determinar por examinação e natureza e circunstância de uma condição patologica. E tomar uma decisão a partir da examinação --> determinação cientifica ou nalise da causa ou natureza do problema. 
Prognóstico: previsão do curso clínico da doença para determinado paciente, podendo ser uma previsão boa, ruim ou reservado (duvidoso, não se tem certeza do que vai ocorrer) 
Usado hoje para o diagnóstico de microorganismos 
Pode ser usado tecnicas convencionais, no entanto, são mais lentas e de baixo custo beneficio 
Aplicacoes das tecnicas de biologia molecular na medicina veterinaria 
* Presença ou ausência de microorganismos 
* Respostas do organismos frente à doença 
* Sucetibilidade à doença 
* Oncologia/ cancerologia 
Testes comerciais --> métodos científicos que possibilitam a caracterização da presença ou forma de macromoleculas – avaliar casos de câncer, modificações de proteínas 
Elas irão avaliar = DNA > presença ou ausência de DNA (- ou +) ou usar tecnicas de variantes de sequência de DNA. RNA > presença ou ausência, quantidade da expressão gênica . Proteinas > presença ou ausência 
DNA 
1. Reações enzimáticas ( PCR e variações) 
2. Hibridização ( cheps de DNA) 
3. Sequencialmente ? - raramente usado para diagnóstico metódo científico que permite amplificar (replicar) milhões de copias de um fragmento de DNA escolhido 
A pessoa escolhe os primers para assim copiar o fragmento que deseja 
Metodo de detecção do DNA, sequenciamento... 
Exemplo de onde é aplicado : clonagem 
* Primer dá especificidade a reação, portanto, é importante saber qual o pedaço de DNA vai que vai ser amplificado 
PCR= repeticao de passos especificos (ciclos com temperaturas diferentes parta realizar replicações) - reação em cadeia - replicação de forma exponencial. Conformação do DNA é diferente em temperaturas diferentes 
Fez uso de uma polimerase que não denaturam a altas temperaturas – através da polimerase de bactérias resistentes a meios com altas temperaturas sem ter problemas 
O que precisa? 1- Extrair DNA genômico ou mitocondrias 2- primers (desenhar e mandar sintetizar) 3- Nucleotideos livres 4- DNA polimerase 5- Magnesio 6- Tampão 7- Água 
Passos: 1- Denaturação do DNA ( abertura da dupla fita a altas temperaturas) 2- Anelamento dos primers ( pareamento dos oligos na sequência especifica ) 55 C – 65 C – temperatura no qual ele se pareia 3- Extensão da fita pela DNA pol, em torno de 68 C – 72C melhor temperatura para essa enzima, esse se liga aos primers e polimeriza a nova fita. 
Apenas a fita de DNA específica vai amplificar em exponencial, aquela fita replicada, mas que não era a específica aumenta de forma linear – devido a replicação senso e anti-senso 
Usado para extração de DNA, quantificar o DNA, realizar a PCR (amplificação) e visualização do resultado (em eletroforese em gel de agarose) - separação de fragmentos de DNA – sendo esse eletronegativo. Se fizer no teste a mesma banda que o controle positivo, significa que esse testado também é positivo para a doença 
Variações de PCR 
VNTR, PCR- RFLP, PCR em tempo real, Multiplex (vários produtos ao mesmo tempo ) 
* PCR VNTR = faz estudo dos microssatélites (variações repetitivas). Faz primers que flanqueiam as regiões. Mais pesado essas regiões de DNA mais próximos do Negativo irá ser 
* PCR-RFLP = polimorfismo de comprimentos de fragmentos de restrição, o produto é digerido posteriormente com enzima de restrição - Enzimas reconhece o polimorfismo - separa por letras de nucleotideos – mutação Pontual 
* PCR em temnpo real, detecção em tempo real do produto formado durante a região. Coloca-se fragmentos de DNA que pareiam e irá fluorecer o produto. Analise ao longo dos ciclos, apresentação em Graficos. Resultado quantitativo – com aplicacao na genotipagem de SNPs