DNA RECOMBINANTE 2018

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INTRODUÇÃO À TECNOLOGIA 
DO DNA RECOMBINANTE
Disciplina: Biologia Molecular
Profa. Dra. Raquel Alves dos Santos
extração Com isolar o fragmento de 
interesse ?
Numa população de DNA extraído de uma célula, existe 
uma mistura complexa de moléculas
A manipulação do material genético
depende:
Da compreensão da estrutura e funcionamento dos genomas;
De modelos experimentais adequados;
Dos avanços tecnológicos (engenharia; informática).
•1972 – Produção da primeira molécula de DNA 
recombinante
Molécula de DNA recombinante :
DNA formado pela combinação de segmentos de 
DNA de origens diferentes
Possibilitou a clonagem
Processo que permite o aumento 
seletivo do número de cópias de 
um determinado gene
Principais passos da 
clonagem
Organização do genoma
bacteriano;
Formas “reprodutivas” (de
transferência genética) das
bactérias;
Propriedades adaptativas
das bactérias;
Presença de genes de resistência a antibióticos
Primeiro passo: como o DNA é cortado 
Enzimas de restrição : endonucleases que reconhecem 
e cortam ligações internas do DNA 
Reconhecem sequências de bases específicas do DNA
Origem : bactérias : sistema restrição - modificação
Confere proteção contra DNAs 
estranhos (bacteriófagos)
Sistema restrição-modificação em bactérias
 Uma enzima de restrição que reconhece e corta uma
sequência particular do DNA, se esta não estiver metilada;
 Uma metiltransferase que reconhece a mesma sequência na
bactéria e metila bases particulares, modificando-a.
Virtualmente todas as bactérias têm sistema
restrição/modificação
Seq. Reconhecimento Enzimas
AA/CGTT Acl I Arthrobacter luteus
A/AGCTT Hind III Haemophilus influenzae
A/CATGT Pci I Planococcus citreus
A/CCGGT Age I Agrobacterium gelatinovorum
ACCTGC(4/8) BspM I Bacillus sphaericas
A/CGCGT Mlu I Micrococcus luteus
A/GATCT Bgl II Bacillus globigii
AG/CT Alu I Arthrobacter luteus
AGG/CCT Stu I Streptomyces tubercidicus
AGT/ACT Sca I Streptomyces caespitosus
•Reconhecem sequências específicas do DNA, geralmente 
palindrômicas
5’-TGGCCA-3’
3’-ACCGGT-5’
BalI
5’-TGG CCA-3’
3’-ACC GGT-5’
Extremidades não-
coesivas (“blunt”)
Clivagem
Extremidades coesivas
Ponto de digestão no eixo 
de simetria
Ponto de digestão fora do 
eixo de simetria
Maior parte das enzimas tipo 2 
reconhecem sequências palindrômicas
de 4-8 pb.
Enzima de restrição e o DNA recombinante
Vetor recombinante
Uma DNA ligase sela a união dos segmentos
Pontes H : Ocorrem 
espontaneamente
Mais usada : T4 DNA ligase
Requer ATP
Segundo passo: o DNA é inserido num vetor
Vetores : moléculas de DNA que se reproduzem 
autonomamente em uma célula hospedeira, no qual um 
segmento de DNA (inserto) pode ser inserido
Alguns tipos de vetores:
Plasmídeos
Bacteriófagos
Cromossomos artificiais de bactérias
Capacidade dos insertos dos vetores frequentemente 
utilizados em clonagem molecular
100 a 300E. coliCromossomo artificial derivado do 
Bacteriófago P1- PACs
100 a 2.000leveduraCromossomo artificial de levedura - YACs
50 a 300E. coliCromossomo bacteriano artificial - BACs
80 a 100E coliBacteriófago P1
35 a 45E coliCosmídeo
10 a 20E.coliBacteriofago lambda
0,1 a 8E. coliPlasmídeo
Capacidade de 
clonagem (kb)
Sistema 
hospedeiro
Sistema Vetor
Plasmídeos 
Moléculas circulares de DNA que se duplicam de modo
independente do DNA cromossomal bacteriano
Plasmídeos naturais são modificados para serem mais 
eficientes na produção de DNA recombinante
Insertos de até 10 kb,
frequentemente
menores do que 5 kb
O bacteriófago lambda como vetor
BACs (cromossomos artificiais de bactérias)
Fator F : plasmídeo de
fertilidade em E.coli
Contém genes que
promovem a distribuição
igualitária dos plasmídeos
após a divisão bacteriana
Insertos de mais de 300 kb
YACs (cromossomos artificiais de levedura)
São combinadas 4 sequências 
curtas :
2 telômeros
1 centrômero
1 elemento ARS (replicon)
1 inserto de ate 2 Mb
Vetores de expressão
Construídos para que haja a expressão do inserto
São usados sistemas de acordo com :
•Tipo de expressão do produto : RNA (produção de sondas, RNA
antisenso); em outros casos, é necessária a expressão proteica.
•Tipo de ambiente : se o vetor será expresso in vitro ou em um
sistema celular
•Proposta do sistema de expressão : se é somente para
investigar a expressão, ou se pretende-se produzir grandes
quantidades da proteína
•Seleção de recombinantes
•O vetor contém um gene marcador, o qual complementa 
uma deficiência da célula hospedeira :
Gene de resistência a antibiótico : ampicilina, tetraciclina, 
cloranfenicol 
ou
Complementação com gene da -galactosidase : a enzima 
produzida pelo vetor age sobre uma substância incolor (X-
gal) tornando-a azul
•1 – A bactéria contém o vetor ?
•Sítio poly-
linker
•Gene da -
galactosidase 
•Gene de resistência a 
kanamicina
•Indica se a bactéria tem o vetor
•Indica se o 
vetor tem o 
inserto
•Bactéria sensível à ampicilina
•Vetor com gene 
de resistência a 
amp •Bactéria adquire 
resistência a amp
•Bactéria sem gene da 
-galactosidase ativa
•Bactéria capaz 
de metabolisar X-
gal
•Vetor com 
gene lacZ
•2 – O vetor contém o inserto ?
• Um gene marcador é inserido no sítio polylinker. Ex. : -galactosidase 
• A inserção do fragmento causa disrupção do gene
•O vetor com o inserto não expressa o gene marcador
•Células com vetor, sem 
o inserto
•Lac Z íntegro
•-galactosidase ativa 
converte X-gal
•Célula azul
•Células com vetor, com 
o inserto
•Lac Z é rompido
•Sem produção de -
galactosidase 
•X-gal não é convertido
•Célula branca
•O gene lacZ foi 
rompido-gene 
inativado
•O gene 
ampR está 
íntegro –
pode conferir 
resistência à 
ampicilina