Perguntas e respostas Sequenciamento de DNA

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O que é um sequenciamento de DNA?
Sequenciamento de DNA é o processo de determinação da sequência de nucleotídeos (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de DNA.
Explique o que é necessário para que a sequência de DNA funcione.
Uma enzima DNA polimerase;
Um primer, que é um pequeno fragmento de DNA de fita simples que se liga ao DNA molde e atua como um "iniciador" para a polimerase;
Os quatro nucleotídeos do DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP);
O DNA molde a ser sequenciado;
No sequenciamento de Sanger contém um ingrediente único:
Versões Dideoxi, ou terminadores de cadeia, para os quatro nucleotídeos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uma marcada com um corante de uma cor diferente.
Faça um breve resumo do método de sanger de sequenciamento de DNA
A amostra de DNA a ser sequenciada é combinada em um tubo com primer, DNA polimerase e nucleotídeos de DNA (dATP, dTTP, dGTP, and dCTP). Os quatro nucleotídeos terminadores de cadeia marcados com corantes são adicionados também, mas em concentração muito menor que a dos nucleotídeos comuns.
A mistura é primeiro aquecida para a denaturação do DNA molde (separar as fitas), então resfriadas para que os primers possam se ligar ao molde de fita simples. Uma vez que o primer se ligou, a temperatura é aumentada novamente, permitindo que a DNA polimerase sintetize um novo DNA a partir do primer. A DNA polimerase continuará a adicionar nucleotídeos à cadeia até que aconteça a adição de um dideoxinucleotídeo ao invés de um normal. Nesse ponto, os nucleotídeos não podem mais ser adicionados, e portanto a fita terminará em um dideoxinucleotídeo.
Este processo é repetido em um número de ciclos. Quando o ciclo se completa, é praticamente garantido que um dideóxinucleotídeo terá se incorporado em todas as posições do DNA alvo em pelo menos uma reação.
Faça um breve resumo de processo de sequenciamento de DNA realizado por sequenciamento automatizado.
Para sequenciar grandes extensões de DNA, o método de Sanger pode ser acelerado através da automação. Isso exigiu que as técnicas de marcação radioativa descritas anteriormente, que não são facilmente automatizadas, fossem substituídas por técnicas de marcação fluorescente (eliminando danos à saúde e problemas de armazenamento decorrentes do uso de nucleotídeos radioativos).
Cada um dos quatro ddNTPs usados para terminar a extensão de cadeia é ligado covalentemente a um marcador fluorescente de cor diferente e as reações de extensão de cadeia são realizadas em um único tubo que contém os quatro ddNTPs marcados. A mistura de fragmentos formados é, então, submetida à eletroforese em uma única canaleta do gel de sequenciamento e à medida que cada fragmento sai do gel, sua base terminal é identificada de acordo com o seu espectro de fluorescência, que é característico para cada base, por um sistema de detecção de fluorescência induzido por laser,[4]em cada reação, ou seja, para cada base (A,T,G,C) utiliza-se um fluorocromo diferente (uma cor diferente), de modo que os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes realizada em um único canal do gel de sequenciamento. O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda. A luz emitida é detectada por escaneamento do gel e a sequência deduzida por computador. Variáveis mais modernas, mais rápidas e poderosas; incluem a robotização total do processo com a inclusão das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do DNA.