Unidade IV (enzimas)

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Disciplina: Introdução à Bioquímica
Professor: Juan Carlos Alvarez-Pizarro 
Unidade IV 
Enzimas 
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Conceitos preliminares
Cofatores enzimáticos (íons metálicos e coenzimas)
Classificação de enzimas
Catálise enzimática
Modelo de Michaelis e Menten
Inibição da atividade enzimática
Mecanismos de regulação
Enzimas
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Enzimas
São proteínas que aceleram a velocidade das reações químicas celulares (catalisadores biológicos).
					S → P
A atividade catalítica delas depende da integridade da estrutura proteica.
A especificidade das enzimas é muito variável. Algumas atuam apenas sobre um tipo de molécula, não atuando sequer sobre seu estereoisômero. Por exemplo a desidrogenase láctica é específica para o L-lactato e a Oxidase de D-aminoácidos só ataca os D aminoácidos. Enquanto que outras atuam sobre vários compostos com alguma característica estrutural comum. Ex: fosfatases que hidrolisam diversos esteres de ácido fosfórico.
 
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A atividade enzimática (especificidade da catálise) depende, muitas vez, de cofatores que podem ser um íon metálico ou uma molécula orgânica (coenzima). Em geral, são termoestáveis e podem estar unidos à enzima de forma permanente ou temporária. 
O complexo formado pela enzima + cofator, chama-se holoenzima. A remoção do cofator resulta em uma enzima inativa , a qual é chamada de apoenzima.
Cofatores enzimáticos
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Cofatores metálicos
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Cofatores coenzimáticos
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Classificação de enzimas
Um número de classificação de quatro partes e um nome sistemático, que identifica a reação catalisada , são especificados para cada enzima.
 Exemplo:
O nome sistemático da enzima é a ATP:glicose fosfotransferase, indicando que ela catalisa a transferência de um grupo fosforribosil do ATP para a glicose. Seu número da comissão de enzimas é 2.7.1.1.
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Catálise enzimática
Os centros ativos são regiões da enzima cuja conformação tridimensional é complementar da molécula de substrato e encontra-se sobre ou próximo à superfície.
Dois componentes: o sítio de ligação (atrai e liga o substrato) e os grupos catalíticos (cadeias laterais reativas de aminoácidos e cofatores, que executam as reações envolvidas na clivagem e formação de pontes).
Quimotripsina e um substrato artificial
O fator decisivo na catálise é a interação direta entre a enzima e substrato através de interações não covalentes entre o substrato e as cadeias laterais ou pontes peptídicas das proteínas. O restante da estrutura proteica proporciona meios de posicionamento do substrato e dos grupos catalíticos, flexibilidade para mudanças conformacionais e controle regulador. 
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Modelo chave-fechadura. Formas geométricas e complementares entre o substrato e a enzima.
Modelo de ajuste induzido. Mudança de conformação quando o substrato se liga a ela, induzindo multiplas interações fracas . O ajuste induzido serve para levar grupos funcionais específicos para uma posição apropriada para catalisar a reação.
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Como as enzimas funcionam?
Onde E, S e P representam a enzima, o substrato e o produto. ES e EP são complexos transitórios da enzima com o substrato e o produto, respectivamente. 
As enzimas aumentam a velocidade das reações sem afetar o equilíbrio da reação.
Um equilíbrio favorável não significa que a conversão de S → P ocorra em uma velocidade detectável. A velocidade depende de um parâmetro totalmente diferente.
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O estado de transição é um momento molecular transitório no qual eventos como a quebra ou formação de ligações ocorrem com a mesma probabilidade de seguirem tanto para formar novamente o substrato como para formar o produto. A diferença entre os níveis energéticos do estado basal e do estado de transição é a energia de ativação. 
Os catalisadores aumentam a velocidade das reações por diminuírem as energias de ativação. Uma reação atinge o ponto de equilíbrio mais rapidamente, quando a enzima apropriada estiver presente.
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	Velocidade de reações
A velocidade de uma reação química é determinada pela concentração do reagente (ou reagentes) e por uma constante de velocidade normalmente designada por k.
Para uma reação unimolecular:
 
		 S ↔ P
		 V = k [S] 
Reação de primeira ordem (depende apenas da concentração de substrato).
		 k = constante de proporcionalidade (s-1) 
O ponto importante é que a relação entre a constante de velocidade e energia de ativação é inversa e exponencial. Significando que a energia de ativação mais baixa, velocidade de reação mais rápida 
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Equilíbrio e velocidade de reações químicas
O equilíbrio de uma reação está ligado à variação de energia livre padrão, ΔG’°.
Equilíbrio de reações
 
		 S ↔ P
		 ΔG’° = - RT ln K’eq 
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Como as enzimas conseguem diminuir a energia de ativação de uma reação química?
Rearanjo de ligações covalentes –
	Grupos funcionais da enzima podem formar ligações covalentes transitórias com um substrato e ativá-lo para a reação. Pode envolver também a transferência transitória de um grupo do substrato para a enzima.
	Essas interações covalentes entre a enzima e o substrato diminuem a energia de ativação, por darem condições para que a reação ocorra por uma via alternativa de baixa energia. 
 
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Como as enzimas conseguem diminuir a energia de ativação de uma reação química?
Estabelicimento de interações não covalentes – A formação de interações fracas é acompanhada pela liberação de uma pequena quantidade de energia que estabiliza a interação entre a enzima e substrato.
Chama-se de Energia de ligação àquela proveniente da interação entre a enzima e substrato e é a principal fonte de energia livre utilizada pelas enzimas para a diminuição da energia de ativação das reações.
A mesma energia de ligação que fornece energia para a catálise também dá as enzimas sua especificidade, isto é a capacidade, de discriminar entre um substrato e uma molécula competidora. 
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Mecanismos físicos e termodinâmicos que contribuem à redução da energia de ativação
Redução da entropia – A interação do substrato com o sítio ativo de uma enzima fixa as moléculas do substrato na posição apropriada. Restrição na mobilidade dos reagentes podem produzir um aumento de várias ordens de grandeza na velocidade da reação.
A formação de ligações fracas entre a enzima e o substrato resulta na desolvatação do substrato.
 A energia de ligação ajuda a compensar termodinamicamente qualquer distorção, principalmente a distribuição de elétrons, de modo que o substrato deve sofrer a reação.
Ajuste induzido – leva grupos funcionais específicos da enzima para uma posição apropriada para catalisar uma reação. Permite a formação de ligações fracas no estado de transição. 
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Grupos catalíticos que contribuem para a catálise
Uma vez que o substrato está ligado a uma enzima, grupos funcionais catalíticos ajudam no rompimento e na formação de ligações por vários mecanismos: 
Catálise geral ácido-básica – Envolve a estabilização de intermediários carregados pela transferência de prótons mediadas por moléculas diferentes da água. Nesta situação ácidos orgânicos fracos ou bases fracas podem funcionar como doadores ou aceptores de H.
Catálise covalente – há formação de uma ligação covalente transitória entre a enzima e o substrato 
	Várias cadeias laterais de aminoácidos e grupos funcionais de algumas coenzimas servem como agentes nucleofílicos na formação de ligações covalentes com substratos 
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Catálise geral por íons metálicos – 
Interações iônicas entre metais ligados a enzimas e substratos podem ajudar a orientar o substrato para a reação ou estabilizar os estados de transição carregados.
Os metais também podem ser mediadores de reações de oxidorredução por mudanças reversíveis no estado de oxidação dos íons metálicos.
Um terço de todas as enzimas conhecidas requer de um ou mais íons metálicos
para a atividade catalítica.
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Cinética enzimática
A curva que expressa a relação entre [S] e Vo (aproximadamente uma hipérbole retangular) pode ser expressa algebraicamente pela equação de Michaelis e Menten. 
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Transformação do gráfico de M-M: o gráfico duplo-recíproco 
Equação de Lineweaver - Burk
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Inibidores de enzimas são moléculas que interferem com a catálise, diminuindo ou interrompendo a catálise enzimática.
Classes de inibidores:
	Inibidores reversíveis: tipos
Inibição competitiva – é provocada por uma substância muito parecida ao substrato da enzima, ligando-se ao sítio ativo. O inibidor compete com o substrato para se localizar no centro ativo e o grau de inibição é influenciado pela concentração dos substrato.
	A inibição competitiva caracteriza-se pela ausência de efeito sobre a Vmax e um aumento no Km (Km aparente) da enzima.
Inibição não competitiva – liga-se a um sítio distinto do sítio ativo.
	O diagnostico deste tipo de inibição caracteriza-se porque o Km não é afetado, enquanto que a Vmax decresce em presença de quantidades altas do inibidor. 
Inibição enzimática
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Efeito de inibidores competitivos e não competitivos nas constantes cinéticas de reações enzimáticas: gráficos duplo-recíproco 
O Km é alterado, enquanto que a Vmax permanece semelhante.
O Km não é modificado, enquanto que a Vmax é alterada.
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Inibição enzimática
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Efeito do pH na catálise enzimática
A catálise enzimática é muito sensível ao pH.
Os gráficos das taxas de reações catalisadas por enzimas versus pH são geralmente campanulados. 
Entretanto, o efeito do pH sobre a atividade pode refletir uma mudança conformacional que resulta na ruptura do sítio ativo.
Ótimo de pH – valor de pH no qual a atividade da enzima é máxima.
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Efeito da temperatura na catálise enzimática
A maioria das reações catalisadas por enzimas mostram um aumento na taxa da reação com a temperatura crescente. Entretanto, pelo fato das enzimas serem proteínas, um outro fator importante entra em consideração, a saber, a desnaturação. Após ser alcançada a temperatura ótima, um decréscimo muito rápido ocorre, como consequência do início da perda da estrutura da enzima.
Ótimo de temperatura – valor de temperatura no qual a atividade da enzima é máxima.
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Uma via metabólica é conformada por um conjunto de enzimas que trabalham conjuntamente para realizar um determinado processo do metabolismo. Ex a via glicolítica, a via de síntese de aminoácidos. 
Em uma rota metabólica conformada por várias enzimas, algumas delas influenciam muito na velocidade da sequencia de reações como um todo.
Enzimas regulatórias 
apresentam uma velocidade aumentada ou reduzida em resposta a determinados sinais,
tendem a serem enzimas com subunidades múltiplas,
seguem um padrão cinético distinto ao de Micaelis e Menten
	 
Enzimas regulatórias em sistemas multienzimáticos
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Regulação alostérica – 
Proteínas alostéricas são aquelas que possuem “outras formas” ou conformações induzidas pela ligação de moduladores. 
No caso da enzima, a mudança conformacional interconverte formas mais ativas para formas menos ativas.
O efetor ou modulador combina-se com a enzima, através de ligações reversíveis e não covalentes, em um local diferente do centro ativo, denominado centro alostérico.
Classificação:
E. A. homotrópicas, quando o substrato e o modulador são idênticos
E. A. heterotrópica, quando o substrato e o modulador são diferentes.
	 
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Interação das subunidades de enzimas alostéricas com moduladores
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Inibição por retroalimentação (feedback)
Em muitos sistemas multienzimáticos, as enzimas regulatórias são inibidas especificamente pelo produto final da via metabólica sempre que a concentração do produto final exceder as necessidades celulares. 
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Propriedades cinéticas de enzimas alostéricas
O gráfico Vo versus [S] produz uma curva de saturação sigmoide. A metade da velocidade máxima é alcançada a uma [S] designada como K0,5 .
A cinética sigmóide reflete interações cooperativas entre as subunidades proteicas. Em enzimas regulatórias homotrópicas, a ligação de um dos substratos a uma dos sítios altera a conformação da enzima de modo a facilitar a ligação de mais moléculas de substrato.
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Curvas de substrato – atividade de enzimas alostéricas
(b) Efeito de um modulador positivo (+) e de um modulador negativo (-) na qual há uma alteração de K0,5 sem haver alteração de Vmax. A curva central mostra a relaçõa substrato-atividade na ausência de modulador. (c) tipo menos comum de modulação, na qual a Vmax é alterada e o K0,5 permanece praticamente constante.
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Modificação covalente – 
A atividade é modulada pela adição covalente de grupos quimicamente variados em um ou mais resíduos de aminoácidos. 
As modificações podem ser: 
	fosforilação, 
	adenilação, 
	acetilação, 
	miristoilação, 
	ubiquitinação, 
	ADP-ribosilação e 
	metilação.
	
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Modificação por fosforilação 
A adição e remoção covalente de grupos fosfato em resíduos específicos de uma proteína é catalisada por proteínas cinases e proteínas-fosfatases, respectivamente.
A adição do grupos fosforil ocorre em resíduos de Ser, Thr ou Tyr e, quando incorporada em regiões críticas da estrutura tridimensional da proteína, pode ter efeitos dramáticos na conformação da enzima e, portanto, sobre a ligação com o substrato e a catálise.
Exemplo: fosforilase do glicogênio no figado e no músculo, que catalisa a reação: 
	
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Regulação da atividade da glicogênio-fosforilase 
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Regulação por proteólise
No caso de algumas enzimas, um precursor inativo denominado zimogênio é hidrolisado formando a enzima ativa. Exemplos:
		quimiotripsinogênio → quimiotripsina
		tripsinogênio → tripsina
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Este tipo de ativação é irreversível e são necessários outros mecanismos para inativar as enzimas. 
		Inibidor da tripsina pancreática (Mr 6.000)
		α1-antiproteinase (Mr 53.000) 
Proteínas como colágeno é sintetizado como um precursor solúvel, o pró-colágeno (pró-enzima). 
A fibrina (proteína do coagulo sanguíneo ) é produzida por proteólise do fibrinogênio (pró-proteína inativa). A protease responsável por essa ativação é a trombina, a qual é produzida por proteólise de uma pró-proteína , a pró-trombina