Relatório Microbiologia

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UNIVERSIDADE DO VALE DO TAQUARI - UNIVATES
CURSO DE ENGENHARIA QUÍMICA
RELATÓRIO DAS AULAS PRÁTICAS 
Felipe Tres Capra
Fabrício Zeni
	
Lajeado, maio de 2019
Felipe Tres Capra
Fabrício Zeni
RELATÓRIO DAS AULAS PRÁTICAS
 Relatório apresentado na disciplina de Microbiologia Industrial, do curso de Engenharia Química, da Universidade do Vale do Taquari - Univates, para a avaliação do semestre.
Professora: Mônica Jachetti Maciel
Lajeado, maio de 2019
INTRODUÇÃO
Microbiologia é a ciência que estuda os microrganismos, muitas vezes, o termo é associado à transmissão de doenças, porém, nem todos os microrganismos são patogênicos, existindo até mesmo aqueles que são benéficos à saúde humana. Os microrganismos, assim como outros seres vivos, precisam de um meio para obter o nutriente necessários para sua sobrevivência. Além dos meios de cultura e nutrientes, também é necessário que as condições de oxigênio, pH, temperatura e pressão osmótica estejam adequados ao crescimento desses microrganismos. Os meios de cultura podem ser encontrados em meios sólidos, os que possuem ágar, e os líquidos, sem ágar. 
As aulas práticas da disciplina de microbiologia industrial foram realizadas nos dias 12, 19 e 26 de abril de 2019, as quais foram ministradas pela Dra. Mônica Jachetti Maciel. Nessas aulas aprendemos vários conceitos essenciais para qualquer atividade em laboratório como por exemplo: as técnicas de assepsia, materiais e instrumentos e o quão importantes são para a microbiologia. As aulas sempre tinham início com uma parte teórica que visava nos repassar os conhecimentos necessários para a realização das práticas, no intuito de conseguirmos realizar a parte prática com total segurança.
Durante as aulas pudemos aplicar a técnica da diluição decimal com corante e água, realizamos a análise completa de um alimento de origem animal e fizemos o teste da coloração de Gram, que é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram em 1884. 
Aula prática número 1: Processamento de amostras microbiológicas
Atividade 1: Método de contagem de microrganismos
	Na primeira aula prática no laboratório, como de praxe, foi nos apresentado alguns cuidados que devemos ter ao ingressarmos num laboratório, cuja avaliação microbiológica está envolvida. Entre elas estão: usar jaleco fechado; calça comprida e calçado fechado; não usar o jaleco fora do laboratório; manter os cabelos amarrados e usar toucas; unhas pintadas e/ou compridas; não levar nenhum instrumento à boca, nariz ou qualquer parte do rosto; não cheirar os meios de cultura inoculados; todo o material deve ser recolocado no lugar ao término de cada aula, inclusive microscópio, material semeado em aula, corantes, alça de platina, porta tubos, bancos; desenvolver o hábito da limpeza e da organização; manter as mãos e a bancada “livres” de microrganismos através do uso do álcool 70% antes, durante e após uma análise, dentre outras normas. Têm-se como objetivo principal das aulas práticas ensinar os princípios, técnicas e métodos utilizados em um laboratório de microbiologia de alimentos. Após esta breve explicação, partimos para o conteúdo propriamente dito.
Iniciamos a primeira prática utilizando 225 mL de água misturados com um corante em um frasco, homogeneizamos a mistura, utilizando a pipetadora e a ponteira estéril retiramos 1 mL da mistura e passamos para um tubo de ensaio com 9 mL de água. Agitamos o tubo e repetimos o processo, com a pipetadora e uma nova ponteira retiramos 1 mL deste tubo e passamos para um outro tubo de ensaio com 9 mL de água. Descartamos a ponteira. Deste novo tubo, novamente, retiramos 1 mL utilizando a pipetadora e a ponteira e passamos para um outro tubo. Entre as retiradas das alíquotas, os tubos foram homogeneizados em vórtex (homogeneizador) para garantir que a mistura estava totalmente misturada. Resumidamente, este processo é conhecido por diluição decimal, consiste nas diluições em que a quantidade de substância a ser diluída corresponde à unidade, ou múltiplos da unidade e o volume final da solução diluída seja igual a 10 ou múltiplo de 10. Conforme dilui-se a mistura inicial, pode-se verificar que a cor original do corante foi ficando mais fraca, conforme as alíquotas eram passadas de um tubo para outro. Essa cor mais fraca representa a concentração do corante frente ao líquido no qual está diluído. Conforme orientado no início da aula, todo processo foi feito próximo a chama do Bico de Bunsen e os tubos de ensaio tiveram seu bocal flambado antes de receberem a alíquota, visando evitar a contaminação de microorganismos externos. A imagem abaixo, fornecida pela professora Mônica Jachetti Maciel, a qual ministra esta disciplina, representa o processo acima descrito, de forma mais sucinta. 
Atividade 2: Preparo de placas
	A segunda parte prática da noite começou logo após o término da primeira. Em primeiro lugar identificamos as placas de Petri que estar/íamos usando com as siglas SAB, PCA e VRB, três placas para cada sigla e com os seguintes valores: 10-1, 10-2,10-3. Já nos tubos de ensaio que continham peptonada salina os valores foram somente 10-2 e 10-3, essa peptonada foi usada para realizar a diluição seriada. Com isso, haviam placas e tubos de valores referentes a 10-1, 10-2 e 10-3. Logo em seguida, pesamos 25 g do nosso alimento de origem animal (queijo), colocamos em um saco de stomacher e com o auxílio de uma pinça estéril, adicionamos ao queijo 225 mL de peptonada salina para homogeneizar a mistura. Após, com a pipetadora automática, transferimos 1 mL da mistura do saco de Stomacher para o tubo com peptonada salina (10-2), e deste tubo retiramos 1 mL para colocar no outro tubo com peptonada salina seguinte (10-3). Na parte final, transferimos 1 mL da mistura para as placas de SAB e PCA (ambas 10-1) e 0,1 para a placa de VRB (10-1). Fizemos o mesmo com o tubo (10-2) para as placas 10-2 e com o tubo (10-3) para as placas (10-3).
	Para finalizar a segunda prática da noite, adicionamos ágar as placas; na placa SAB, realizamos o plaqueamento por superfície; na placa de PCA, realizamos o plaqueamento por profundidade; e na placa de VRB, realizamos o plaqueamento por sobrecamada. Adicionamos o ágar VRB, espalhamos pela placa até que o mesmo se solidificasse. Então, adicionamos a segunda camada de ágar VRB, deixamos solidificar. Com a prática já concluída, entregamos todas as placas confeccionadas e limpamos a bancada com álcool 70%. 
Aula prática número 2: Contagem microbiana e Caldos
A aula prática 2 teve início com a explicação, feita pela professora, com o objetivo de nos ensinar a contar as colônias que haviam crescido em nossas placas, placas estas, que havíamos preparado na aula prática 1. Nossas colônias foram incubadas em temperatura ideal para o crescimento microbiano, de acordo com a resistência de cada organismo. O PCA foi incubado invertido com temperatura de aproximadamente 30ºC por 72 horas. Já, o SAB foi incubado não invertido com temperatura igual a 25ºC por 5 dias e o VRB foi incubado invertido a 36ºC por 24 horas. O próximo passo foi partirmos para os cálculos do número de colônias das placas de PCA e SAB. A seguir, temos os resultados: 
Cálculo em relação a 1mL (Placa PCA):
Número de colônias × diluição inversa: 
= 42 colônias
= 42 × 
= 42000
= 4,2 × UFC/g
Cálculo em relação a 1mL (Placa SAB):
Número de colônias × diluição inversa × 10: 
 = 42 colônias
= 42 × × 10
= 420000
= 4,2 × UFC/g
Como podemos perceber, usa-se para expressar os resultados o termo UFC/mL ou UFC/g, dependendo do estado em que o alimento se encontra (sólido: gramas e líquido: mL). Também podem haver casos em que não existam colônias nas placas, e nesses casos deve-se expressar por: < 1 X UFC/mL ou UFC/g. 
Em seguida realizamos a contagem donúmero de colônias presentes nas placas, sendo que o número precisa estar entre 30 e 300, pois assim existe menor probabilidade de erro na contagem. Se os resultados estiverem fora do intervalo de precisão citado, deve-se usar a expressão “estimado”. Os resultados da contagem foram:
Placas PCA - Plaqueamento por profundidade:
 = incontáveis;
 = incontáveis;
 = 1248 colônias; 
Cálculo:
== 1248 colônias
= 1248 × 
= 1248000
= 1,24 X UFC/g estimado.
Placas SAB - Plaqueamento por superfície:
 = incontáveis;
 = 386 colônias;
 = 212 colônias;
Cálculo: 
 = 212 colônias × 10
= 212 × × 10
= 212 × 1000 × 10
= 2120000
= 2,12 X UFC/g
Placas VRB - Plaqueamento por sobrecamada:
 = incontáveis;
 = Típicas: 45 colônias; Atípicas: 720 colônias;
 = Típicas: 22 colônias; Atípicas: 250 colônias;
	Após termos obtido os resultados dos plaqueamentos partimos para aula propriamente dita. Para iniciar alguns conceitos gerais sobre o crescimento microbiano foram abordados, tais como: temperatura adequada para o desenvolvimento, pH favorável, microrganismos anaeróbicos e ou aeróbicos. Também foi nos apresentado quais são os tipos de nutrientes que os microrganismos utilizam em seu processo de desenvolvimento. 
	A primeira prática feita nesta noite iniciou logo em seguida. Fomos instruídos a selecionar uma placa de VRB que continha colônias típicas e atípicas, para então identificarmos as mesmas em tubos de ensaio com as letras T (típicas) e AT (atípicas) e o nosso nome. Depois, foram repicadas três colônias típicas e três colônias atípicas da diluição 10-3. Em seguida, elas foram depositadas em tubos de ensaio com caldo verde brilhante (típicas) e em tubos de ensaio e caldo EC (atípicas). Os primeiros três tubos foram armazenados a 36ºC por uma semana para confirmar os coliformes totais; já os segundos foram postos em banho-maria a temperatura aproximada de 45ºC, também durante uma semana, mas com agitação para que confirmassem os coliformes termotolerantes.
	Em seguida, outra atividade iniciou-se. Identificamos os meios de cultivo sem micro-organismos com o nome do meio de cultura, do microrganismo e de um componente do trio. Posteriormente, homogeneizamos o inoculo de S. aureus e o caldo BHI no vórtex e com o auxílio de uma alça de inoculação estéril, transferimos parte de S. aureus para o tubo de ágar Nutriente Inclinado; com uma segunda alça, passamos no ágar BHI da placa de Petri em forma de estrias. Por fim, com a ajuda de uma agulha bacteriológica flambada no bico de Bunsen, retiramos uma colônia da placa com Salmonella e a depositamos no caldo BHI com a ajuda de uma alça de inoculação e também, no meio semi-sólido-SIM com auxílio da agulha de inoculação, foi feito uma picada central. Ao término desta atividade, organizamos os materiais, limpamos a bancada e finalizamos a aula.
Aula prática nº 3 - Contagem de microrganismos, coliformes totais e termotolorantes e visualização em microscópio óptico 
A 3ª e última aula prática teve início com a observação dos resultados dos ÁGAR que havíamos manuseado na aula anterior. Observamos que sim, houve crescimento bacteriano no ÁGAR NUTRIENTE INCLINADO (S. aureus), pois este ficou com um aspecto esbranquiçado e parecido com um bolor; no ÁGAR BHI (S. aureus) também houve crescimento, pois pode-se observar uma película esbranquiçada e o aumento de colônias; de forma semelhante ocorreu no caldo BHI (Salmonella), pois este que era de cor bem clara, ficou turvo; assim como no meio de cultura semi-sólido-SIM (Salmonella), que era claro e ficou completamente escuro. 
Também fizemos a contagem dos microrganismos nos caldos que havíamos trabalhado na aula prática 2. Como não visualizamos a formação de mais de 1/10 do gás dentro do durham, em nenhum dos tubos, concluímos que não houve crescimento microbiano de coliformes. Sendo assim, os resultados foram:
Caldo verde brilhante (Típicas e Atípicas): <1,0 X UFC/g;
Caldo EC (Típicas e Atípicas): <1,0 X UFC/g;
Após esta primeira etapa na aula, de visualizações, iniciamos a prática da aula 3 com o processo para a coloração de Gram. Em primeira instância a professora demonstrou como o procedimento deveria ser feito, primeiro no quadro e depois de forma prática. Limpamos a bancada com álcool 70%, desinfetamos as mãos, colocamos toucas e luvas e ligamos o bico de Bunsen.
A primeira etapa do procedimento constituiu em identificar as lâminas de microscópios em A, B e C. A identificação das amostras procedeu da mesma forma, A (Ágar BHI - Staphylococcus), B (Caldo BHI - Salmonella) e C (Swab estéril). 
Na segunda etapa partimos para o preparo do esfregaço - meio sólido. Então foi retirado uma pequena quantidade do conteúdo da placa de Ágar BHI e transferida, com o auxílio de uma alça de inoculação, para a lâmina com a letra A. Na sequência, acrescentamos uma gota de salina estéril, com uma pipeta automática. Seguramos a lâmina ao lado do bico de Bunsen para que o procedimento não fosse afetado, e, com movimentos circulares por sobre a lâmina, espalhamos a amostra por toda a superfície da mesma, passando no fogo em até no máximo três vezes para que o conteúdo secasse. Na próxima lâmina, com a letra B, usamos outra alça de inoculação para pegarmos uma pequena amostra do tubo com o caldo BHI Salmonella, e a transferimos para a lâmina. Com os mesmos movimentos circulares da parte anterior, espalhamos o conteúdo até secar toda a superfície. Por fim, na lâmina de letra C, foi feita a raspagem da mucosa da boca de um dos três componentes do trio, com a ajuda do Swab estéril, retirando uma fração de material biológico, que em seguida foi transferido para a lâmina, também com movimentos circulares constantes, até secar o material. 
A terceira etapa constituiu em fazer a coloração do esfregaço. O procedimento foi o seguinte: 1° adicionamos o cristal violeta na três lâminas, esperamos 1 minuto e retiramos aplicando água destilada com uma pipeta de Pasteur. No 2º passo acrescentamos Lugol em cada uma das lâminas, esperando 1 minuto novamente e retirando com água. O 3º passo foi passar álcool descolorante, até limpar todas as lâminas e, novamente, limpar com água. No 4º e último passo, acrescentamos a Fucsina, também aguardando 1 minuto e finalizamos com a água. Depois que as lâminas estavam prontas, as colocamos em uma folha de papel, para poderem ser transportadas até o laboratório de microscopia, onde seria feita a observação das lâminas.
Quando adentramos o laboratório de microscopia, logo fomos orientados pela professora sobre o uso e manuseio do microscópio óptico, que nos auxiliaria na visualização das três lâminas preparadas. A lente objetiva usada foi a de 100x, que com o auxílio do óleo de imersão, multiplicava a visualização em 10, assim fornecendo uma ampliação de 1000x. Realizamos, em seguida, a atividade da visualização de bactérias.
Na lâmina A, esfregaço de bactérias do meio de cultura sólido, observamos bactérias de cor roxa, o que significa que elas são Gram+ segundo a escala de coloração, pois permaneceram com a cor inicial. Na lâmina B, esfregaço de bactérias do meio de cultura líquido, pudemos observar bactérias de cor rosa, o que significa que elas são Gram-, pois adquiriram um tom rosado. Na lâmina C, esfregaço de material biológico (captado na boca de um dos integrantes), observamos bactérias roxas e rosas e, concluímos que haviam Gram+ e Gram-.
Houve uma diferença entre as lâminas, no que diz respeito ao agrupamento de colônias. No meio de cultura sólido (A), as colônias eram observadas bem mais próximas, é uma lâmina bem densa. Já no meio de cultura líquido (B), as colônias ficam mais espalhadas, sendo possível visualizá-las dispersas por toda lâmina. Na lâmina C tivemos uma surpresa, pois conseguimos visualizar uma grande célula, esta é uma célula eucarionte animal, e nela pudemos observar membrana citoplasmática, citoplasma e núcleo. Tendo finalizado isso, arrumamos a bancada do laboratório e encerramos a aula. 
CONCLUSÃO
	Pode-se concluir, portanto, que os microorganismosestão presentes em todos os lugares imagináveis por nossa mente, não temos como livrar-nos destes seres. A aulas práticas tiveram como objetivo principal, o ensino das metodologias de esterilização, materiais e equipamentos utilizados em um laboratório de microbiologia. Pelos resultados, constatou-se que o queijo apresentou inúmeras colônias de bactérias, possivelmente pelo fato de ser um produto de origem animal produzido artesanalmente, fazendo com que alguns dos processos adotados pelas grandes indústrias para evitar o contágio de bactérias, não estão sendo seguidos na produção deste. Na coloração de Gram, pode-se verificar bactérias Gram-positiva, que se coram em roxo, e as Gram-negativas, que se coram em vermelho, devido às diferenças encontradas no tamanho da parede celular de ambas, cada uma apresenta características próprias, além de possuírem um grau de virulência diferenciado.
REFERÊNCIAS
CUNHA, Felipe Saluan da. Relatório de Prática em coloração Gram. Rio de Janeiro: 2013. 2 p. Disponível em: <https://www.passeidireto.com/arquivo/1663009/relatorio-de-pratica-em-coloracao-gram?utm_campaign=android-arquivo%3Futm_medium>. Acesso em: 01 maio 2019.
FONSECA, Emanuela. MICROBIOLOGIA BÁSICA: Relatório da aula teórica. São José: 2016. 5 p. Disponível em: <https://www.passeidireto.com/arquivo/22891607/relatorio-microbiologia?utm_campaign=android-arquivo%3Futm_medium>. Acesso em: 01 maio 2019.