Prepaaração prova 1 Separação e Purificação de Produtos Biotecnológicos

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Separação e Purificação de Produtos Biotecnológicos
Conceitos e Definições
Resumo feito com base no Livro Purificação de Produtos Biotecnológicos.
Slides Internet, unesp, unicamp
1
SUMÁRIO
PREPARAÇÃO PROVA 1
Métodos de Rompimento
Moinho de Bolas
Homogeneizador de Alta Pressão
Prensa Francesa
Pistilo
Filtração
Filtração Comum
Filtração Tangencial
Centrifugação
SUMÁRIO
PREPARAÇÃO PROVA 2
Cromatografia de Troca Iônica
Cromatografia de Interação Hidrofóbica
 Cromatografia de Afinidade
Cromatografia de Imunoafinidade
SUMÁRIO
PREPARAÇÃO PROVA 3
Cromatografia de Leito Expandido
Cromatografia de Exclusão Molecular
Cromatografia Covalente
Cromatografia de Íons Metálicos
Integração de Processos
ETAPAS DE UM PROCESSO DE PURIFICAÇÃO
Etapa do processo
Operações unitárias
Princípio
Clarificação
 
 
 
Filtração convencional
Tamanho de partículas
Centrifugação
Tamanho e densidade de partículas
Filtração tangencial (membranas)
Tamanho de partículas
Floculação
Hidrofobicidade de partículas
Rompimento de células
H omegeneização
Cisalhamento
Ultra-som
Cisalhamento
Moagem em moinho de bolas
Cisalhamento
Rompimento químico ou enzimático
Hidrólise, solubilização ou desidratação de moléculas que compõem a parede ou a membrana celular
Purificação de baixa resolução
Precipitação
Solubilidade
U Itrafiltração (membranas)
Massa molar e raio hidrodinâmico de moléculas
Extração em sistemas de duas fases líquidas
Solubilidade, massa molar
Purificação de alta resolução
Cromatografia de troca-iônica
Tipo e densidade de carga na superfície da biomolécula
Cromatografia de afinidade (biológica ou química)
Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção)
Cromatografia de imunoafinidade
Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção antígeno/anticorpo)
Cromatografia de interação hidrofóbica
Hidrofobicidade
 
Cromatografia de exclusão molecular
Massa molar
Membranasadsortivas
Massa molar e características para adsorção ou sítios específicos da superfície de uma proteína
Tratamentos finais
Cristalização
Solubilidade e características de equilíbrio líquido-sólido
Liofi I ização
Características de equilíbrio líquido-sólido
Secagem
Características de equilíbrio líquido-sólido
PREPARAÇÃO PROVA 1- MÉTODOS INICIAIS
Rompimento Celular
Clarificação
ROMPIMENTO CELULAR
O Rompimento Celular geralmente ocorre após a etapa de separação e lavagem das células que foram cultivadas.
ROMPIMENTO CELULAR
Qual técnica escolher?
Aplicações
Devemos levar em consideração os seguintes critérios
Tamanho da célula
Tolerância as tensões de cisalhamento
Necessidade de controle de temperatura
Tempo de operação 
Rendimento do processo
Gasto de energia
Custo e capital de investimento
Células só com membrana plasmática (animais e hibridomas) são mais frágeis e por isso necessitam de técnicas de rompimento mais brandas.Uma simples operação de bombeamento pode romper a célula e fazer com que a molécula alvo seja perdida.
Células com parede celular, o rompimento deve ser mais vigoroso.Depende do tipo de microrganismo ou planta.
Células de Bactérias Gram Positivas
Tem paredes mais rígidas que as gram negativas e então necessitam de um rompimento mais brusco
Células de Leveduras
Possuem parede celular ainda mais rígida que as bactérias
Células Vegetais
ROMPIMENTO CELULAR
O que devemos levar em consideração?
Composição da membrana
Molécula de interesse é intracelular ou extracelular?
O que será melhor permeabilizar a membrana ou fazer o rompimento efetivo?
dependendo da situação permeabilizar a membrana é mais vantajoso pois gera um número menor de contaminantes
Qual a composição da membrana do organismo que estou trabalhando?
Devo tomar com o cuidado com o calor excessivo?
Devo tomar cuidado com contaminantes que prejudiquem a minha molécula alvo? 
Ex: Proteases
Os compostos indesejáveis podem ser removidos pelos seguintes processos:
 Filtração
Centrifugação
Centrifugação
Precipitação
Extração líquido-líquido
Cromatografia
As molécula intracelulares geralmente necessitam de um número maior de etapas de purificação que as moléculas extracelulares devido aos fragmentos celulares e outros contaminantes intracelulares. 
A biologia molecular tem sido muito importante para a redução do número de etapas de purificação. Pois nela se pode fazer modificações genéticas para produzir moléculas de interesse que sejam mais fáceis de se purificar. 
ROMPIMENTO CELULAR
O Rompimento Celular geralmente ocorre após a etapa de separação e lavagem das células que foram cultivadas.
HOMOGENEIZADOR DE ALTA PRESSÃO
PRINCÍPIO
A redução instantânea da pressão de cisalhamento associada ao impacto provoca o rompimento celular sem danificar as biomoléculas
A quantidade de células rompidas é proporcional à pressão na alimentação.
Bactérias e Leveduras 
INDICAÇÕES
Homogeneizador de Alta Pressão EGSA
HOMOGENEIZADOR DE ALTA PRESSÃO
VANTAGENS	
DESVANTAGENS
VANTAGENS
MOTIVO/OBS
Possibilitaa recirculação do material
Amplamente utilizado em escala industrial
Maisfácil de encontrar
DESVANTAGENS
MOTIVO/OBSERAÇÕES
Aumento da temperatura
Moléculastermo sensíveis necessitarão de refrigeração
Elevado custo no processo
Geração de Fragmentos Celulares muito pequenos
Podegerar um número grande de contaminantes
Contraindicado para Fungos Filamentosos
Podem entupiro equipamento
*Possibilidade de degradação da molecula alvo
HOMOGENEIZADOR DE ALTA PRESSÃO 
PRENSA FRANCESA
LIQUIDIFICADOR
Rompimeno celular em escala laboratorial
MOINHO DE BOLAS 
PRINCÍPIO
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA
Ocorre a passagem da suspensão celular por uma câmara de trituração (vertical ou horizontal) que possui um eixo com discos de agitação e que é preenchida por esferas de vidro
O rompimento ocorre devido a força de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das células.
Fungos Filamentosos 
Leveduras e Microalgas 
INDICAÇÕES
MOINHO DE BOLAS
EFICIÊNCIADEPENDE
MOTIVO/OBSERAÇÕES
Tipode Câmara de Rompimento
Horizontais: comportammais esferas e por isso são mais eficientes
Verticais: ocorre afluidizaçãodas esferas
Velocidade de Agitação
Quanto>velocidade de rotação mais rápido é o rompimento
Tipo do Agitador
Devem ser projetadosde forma a proporcionar a máxima transferência de energia cinética para as esferas.Não é possível fazera correlação direta entre tipo e a eficiência
Composição das Esferas
Esferas de vidrosão as mais utilizadas
EFICIÊNCIADEPENDE
MOTIVO/OBSERAÇÕES
Tamanhodas Esferas
Quanto < diâmetro>eficiência . Pois aumenta a probabilidade de cisalhamento com células intactas.
Diâmetro das esferas
Bactérias: 0,1mm
Leveduras: 0,5 mm
Larga Escala: <=0,4 mm
Concentração Celular
Pouca eficiência norompimento. Recomenda-se 30 a 50% v.v
Velocidadede Alimentação
%células caí quando aumenta o fluxo de alimentação, isso pois elas ficam menos tempo no moedor. O Fluxo ótimo dependeda velocidade do agitador, da carga de esferas, da geometria do equipamento e das propriedades do microrganismo.
Temperatura
As temperaturas de operação em processos de rompimento celular devem ser controladas para prevenir a destruição da biomolécula-alvo.Processo liberacalor, ele deve possui manta de refrigeração entre 5 e 15ºc
Entre 5 e 40º a temperatura gera pouco efeito sobre a eficiência do rompimento
Cargade Esferas
Câmara Horizontal: 80 a85% de volume
CâmaraVertical:50 e 60% de volume
Carga muito grande: As esferas se chocarão diminuindo a eficiência. Aumenta temperatura e gasto de energia
Carga muito pequena: Não haverá colisões suficientes para a desintegração das células
MOINHO DE BOLAS
VANTAGENS	
DESVANTAGENS
DESVANTAGENS
MOTIVO/OBSERAÇÕES
Condições de rompimento são facilmente controláveis
MOINHO DE BOLAS 
Ampliação de Escala
ESCALA LABORATORIAL
Na ampliação de escala do rompimento com moinho de bolas devem se manter constantes os seguintes parâmetros:
tamanho das esferas 
proporção em volume entre a suspensão celular e as esferas de vidro 
 velocidade de rotação do eixo ou velocidade periférica das pás do agitador. 
ULTRASSOM 
PRINCÍPIO
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA
Ondas sonoras a uma frequencia de 20 kHz convertidas em vibração em um meio líquido causam o fenômeno de cavitãção( surgimento de bolhas muito pequenas que entram em colapso causando uma onda de choques no meio líquido, aumentando assim a força de cisalhamento e causando o rompimeno celular.
Células Frágeis
INDICAÇÕES
ULTRASSOM
VANTAGENS	
DESVANTAGENS
DESVANTAGENS
MOTIVO/OBSERAÇÕES
Inviável emescala industrial
Processoe caro e necessita de uma grande quantidade de sondas e eficiente sistema de refrigeração.
ULTRASSOM
O aparelho que gera essas ondas é o sonicador.
A amplitude das ondas aumentam quando o diâmetro de sua extremidade diminui.
O aumento de temperatura deve ser controlado com refrigeração ou aplicando o ultrassom em forma de pulsos.
Na prática a potência deve ser de 0,2 a 3 W/mL.
No modelo 04712-84 disponível na SPLABOR, é possível obter controle aprimorado de amplitude e freqüência, programações de sequência e capacidade de acompanhar com precisão o total de energia fornecida para a amostra. 
ROMPIMENTO CELULAR
O Rompimento Celular geralmente ocorre após a etapa de separação e lavagem das células que foram cultivadas. 
Pode liberar um número mair de contaminnates, deixar o meio mais viscoso e também desnaturar a proteína alvo.
CHOQUE OSMÓTICO 
PRINCÍPIO
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA
As células são mantidas por 30 minutos em meio com concentração de sacarose ~20% (m/v) (CÉLULA MURCHA), separadas por centrifugação e ressuspensas em água destilada a 4ºC ( CÉLULA FICA TÚRGIDA, INCHADA).
Em geral o choque é insuficiente para romper a célula mas é capaz de promover a permeabilidade seletiva.
Bactérias com parede celular mais seníveis- Gram Negativas
INDICAÇÕES
Esquema Choque Osmótico
Meio com 20% Sacarose
Célula Normal
Célula Murcha
Ressuspensão em água destilada
Centrifugação
Célula Túrgida-
 Permeabilizada
VANTAGENS
Rompimento Total x Parcial
Facilita as etapas posteriores de purificação pois o este método é capaz de reduzir a quantidade de contaminantes, quando a célula é permeabilizada.
CHOQUE OSMÓTICO 
DESVANTAGE S
CONGELAMENTO/DESCONGELAMENTO 
PRINCÍPIO
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA
As células passam por vários processos de congelamento e descongelamento. Logo, ocorre a formação intracelular de grandes cristais de gelo que podem perfurar a célula, induzindo à lise celular ou a formação de poros( onde a biomolécula alvo poderá passar)
 Rompimento de patógenos.
É válido quando esses patógenos não são resistentes a esse tipo de rompimento. ( Eles ganham resistencia quando produzem alguns compostos crioprotetores como por exemplo, biopolímeoros.
INDICAÇÕES
Célula Normal
Célula com 
cristais de gelo
Devido ao congelamento/
descongelamento
Cristais intracelulares 
perfuram a célula.
Célula é permeabilizada
Célula é lisada
VANTAGENS 	
DESVANTAGENS
Método é simples	
Tipo e idade da célula
Temperatura 
Velocidade dos ciclos de congelamento ( está relacionado com o tamanho dos cristais)	
Processo demorado
Custo elevado 
Inadequado para moléculas sensíveis ao congelamento
Devido ao elevado tempo de processo, o método praticamente passa a ser inviável em escala industrial
CONGELAMENTO/DESCONGELAMENTO 
FATORES QUE INFLUENCIAM 	
TERMÓLISE 
PRINCÍPIO
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA
Elevação da temperatura da suspensão celular.
No caso a suspensão celular pode ser aquecida em banho termostatizado , com injeção de vapor direto, em tambor rotativo ou spray-dryer.
Algas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias destinados a produção de proteína microbiana.
É viável desde que a biomolécula alvo não seja danificada.
INDICAÇÕES
VANTAGENS 	
DESVANTAGENS
Adequada para processos em larga escala.
 Gera fragmentos com maiores dimensões, o que facilita nas etapas posteriores como filtração ou centrifugação.
Tipo do microrganismo, condições da parede celular.
Microrganismos com parede celular mais espessa (gram positivos) levam mais tempo de processo que os gram negativos...
O aumento da temperatura tem grades chances de desnaturar a biomolécla alvo.
TERMÓLISE 
FATORES QUE INFLUENCIAM 	
VANTAGENS 	
DESVANTAGENS
Adequada para processos em larga escala.
 Gera fragmentos com maiores dimensões, o que facilita nas etapas posteriores como filtração ou centrifugação.
Tipo do microrganismo, condições da parede celular.
Microrganismos com parede celular mais espessa (gram positivos) levam mais tempo de processo que os gram negativos...
O aumento da temperatura tem grades chances de desnaturar a biomolécla alvo.
TERMÓLISE 
FATORES QUE INFLUENCIAM 	
ROMPIMENTO CELULAR
O Rompimento Celular geralmente ocorre após a etapa de separação e lavagem das células que foram cultivadas. 
Pode liberar um número mair de contaminnates, deixar o meio mais viscoso e também desnaturar a proteína alvo.
ÁLCALIS 
PRINCÍPIO
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA
?? Variações no pH
Por exemplo, o hidróxido de sódio faz com que o álcali possa quebrar a cadeia polimérica e afetar as propriedades do polímero.
Isso dependerá do álcali aplicado?
Adequado quando a molécula-alvo é estável em pH maior que 11 (pq?)
INDICAÇÕES
VANTAGENS 	
DESVANTAGENS
Método simples 
 De baixo custo
A eficiencia do rompimento depende de
pH	
temperatura
Ocasiona geração de poluentes
Formação de espuma e desnaturação e/ou precipitação de proteínas 
ÁLCALIS 
FATORES QUE INFLUENCIAM 	
DETERGENTES
PRINCÍPIO	
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA
São capazes de dissociar proteínas e lipoproteínas das paredes celulares, provocando a formação de poros e liberar a molécula-alvo 
Dependendo do tamanho dos poros a célula pode ser totalmente rompida.
INDICAÇÕES
Proteínas integrais da membrana
detergente
micelas
Complexos não micelares
Dependendo da concentração
DETERGENTES
EXEMPLOS DE DETERGENTES
Lauril Sulfato de Sódio
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)
Triton
Detergentes não iônicos
Triton X-100
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)
SDS
Dodecil sulfato de sódio
Cetab
Cetyltrimethylammonium bromide
Deoxicolato de sódio
Detergentes iônicos
Octilglicosídeo
(octyl-b-D-glucopyranoside)
SOLVENTES
PRINCÍPIO	
SOLVENTES MAIS UTILIZADOS
Desidratantes químicos das células.
Biomoléculas que não sejam desnaturadas na presença do solvente escolhido
Etanol
Metanol
Tolueno
Acetona
INDICAÇÕES
SOLVENTES 	
VANTAGENS
DESVANTAGENS
ROMPIMENTO CELULAR
O Rompimento Celular geralmente ocorre após a etapa de separação e lavagem das células que foram cultivadas. 
Pode liberar um número mair de contaminnates, deixar o meio mais viscoso e também desnaturar a proteína alvo.
LISE ENZIMÁTICA
PRINCÍPIO
INDICAÇÕES
Enzimas são capazes de hidrolisar paredes celulares microbianas.
 Membrana citoplasmática é rompida pela pressão osmótica interna, após a parede celular, ou parte dela, ser removida por ação das enzimas, permitindo que o conteúdo intracelular seja liberado.
Recuperação de biomoléculas sensíveis ao rompimento mecânico, temperatura, tensão de cisalhamento e elevadas pressões.
Presença de Inibidores
Possibilidade de Reciclo da Enzima
Resistência a tensão de cisalhamento
Influência de pH, temperatura, força iônica,concentração celular da enzima devem ser conhecidas
A composição da membrana dos microrganismos também deve ser analisada pois cada uma pode ter um substrato diferente, logo o tipo da enzima escolhido dependerá desse substrato.
FATORES A CONSIDERAR
LISE ENZIMATICA
VANTAGENS	
DESVANTAGENS
Fácil controle do pH e temperatura do meio
Baixo investimento de capital
Alta especificidade para a degradação da parede celular
Uso em associação com métodos mecânicos e não mecânicos
Custo da
enzima, que muitas vezes impede que o método seja aplicado em escala industrial
Eficiencia da lise enzimática pode variar devido às condições fisiológicas do microrganismo.
LISE ENZIMATICA
PRINCIPAIS ENZIMAS BACTERIOLÍTICAS
Glicosidades
Acetilmuramilalanina amidases
neuroamidases
Endopeptidases
proteases
Em bactérias o peptídeoglicano é o principal alvo para ataque enzimático pois ele é um constituinde significante na parede celular
EXEMPLOS
Faça um protocolo para purificação de uma molécula intracelular de um fungo filamentoso. Até a obtenção de um homogeneizado.
Faça um protocolo para obtenção de homogeneizado de uma molécula que está dentro de uma célula da E. Coli
EXEMPLOS
A célula A é de uma bactéria gram negativa e foi cultivada em um meio rico em nutrientes. A célula B é de uma bactéria gram positiva e foi cultivada em um meio pobre em nutrientes. A partir disso é possível saber qual célula passará por um processo de rompimento mais brando? Por que?
Geralmente a primeira etapa de um processo consite nesses métodos justamente para retirar as células do meio de cultivo.
FILTRAÇÃO
FILTRAÇÃO CONVENCIONAL
APLICAÇÕES
 A suspensão sob pressão é perpendicularmente direcionada a um meio filtrante.
Clarificação de grandes volumes de suspensões diluídas de células, produtos extracelulares e situações onde não é necessário assepsia. 
Suspensões de Bolores ( devido o micélio apresentar densidade muito baixa)
APLICAÇÕES
FILTRAÇÃO
VANTAGENS	
DESVANTAGENS
Gera uma torta relativamente seca
Gera grandes volumes de torta o que dificulta a manutenção e assepsia
Gasta muita mao de obra
Bacterias e Leveduras podem ocasionar grandes problemas de entupimento
FILTRAÇÃO
AUXILIARES DE FILTRAÇÃO
Atuam reduzindo a compressibilidade ou a compactação da torta de filtração fazendo com que a permeabilidade do leito aumente.
Normalmente usa- se perlita ou terra diatomácea (plantas aquáticas sedimentadas), que podem ser adicionadas à suspensão inicial ou depositada como uma fina camada no meio filtrante. 
A adsorção de células sobre as partículas de terra reduz 2 problemas
Compressibilidade da torta
Entupimento do filtro devido à penetração de células e fragmentos no meio filtrante
FILTRAÇÃO
AUXILIARES DE FILTRAÇÃO
Atuam reduzindo a compressibilidade ou a compactação da torta de filtração fazendo com que a permeabilidade do leito aumente.
Normalmente usa- se perlita ou terra diatomácea (plantas aquáticas sedimentadas), que podem ser adicionadas à suspensão inicial ou depositada como uma fina camada no meio filtrante. 
A adsorção de células sobre as partículas de terra reduz 2 problemas
Compressibilidade da torta
Entupimento do filtro devido à penetração de células e fragmentos no meio filtrante
FILTRAÇÃO
AUXILIARES DE FILTRAÇÃO
VANTAGENS
 Como as bactérias e fungos tem dimensões frequentemente abaixo de 10 µm e os poros dos meios filtrantes convencionais tem cerca de 10 a 1000 µm geralmente é necesssário o uso de auxiliares de filtração para viabilizar a retenção dessas células.
Diminuem o tempo de filtração de 5 a 20 vezes
Evitam entupimento
Molécula alvo pode adsorver irreversivelmente nesse auxiliar causando diminuição do rendimento.
Células com prdutos intracelulares não podem ser adicionadas de terra diatomacea( prejudica etapas posteriores)
DESVANTAGENS
FILTRAÇÃO
FILTROS
APLICAÇOES
Clarificaçao, bolores cultivados na produção de antibioticos.
Filtro Rotativo à Vácuo
CENTRIFUGAÇÃO
PRINCÍPIO
APLICAÇÕES
Células em suspensão em um meio líquido sedimentam por ação da gravidade, a centrifugação acelera essa sedimentação por ação de um campo gravitacinal centrífugo.
Bactérias e Leveduras
Produtos Intracelulares, visto que na filtração eles não podem ser separados por auxiliares de filtração
CENTRIFUGAÇÃO
 A centrifugação geralmente é uma das primeiras etapas de purificação aplicado a um extrato bruto.
 Através do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força centrífuga é aplicada à amostra, separando seus componentes através de
 suas massas e/ou densidade, conforme a técnica. 
Com sucessivas etapas e com velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, obtém-se diferentes frações de um homogenado de células ou tecidos.
A centrífuga
Câmara blindada
Amostra 
sedimentando
refrigeração
vácuo
rotor
ângulo
fixo
R$ 3.000
US$ 70,000
Centrífuga
Clínica
Ultracentrífuga
Força centrífuga
1,200g por 15 minutos separa plasma de células sanguíneas
200,000 g por 24 horas para separar organelas menores ou complexos proteicos
(necessitam vácuo para evitar atrito do ar, além de refrigeração)
Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g)
Preço aproximado
Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações, dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar.
CENTRIFUGAÇÃO
AUXILIARES DE CENTRIFUGAÇÃO
AMPLIAÇÃO DE ESCALA
Podem ajudar na agregação das células microbianas com base nas características iônicas da superfície, aumentando a densidade dos sólidos suspensos, o que resulta em uma maior velocidade de centrifugação. 
Esse processo pode ser obtido por ajuste
de pH (reduz a carga superficial das células resultando em partículas maiores e mais densas) 
 adição de eletrólitos (reduz a repulsão eletrostática entre as células favorecendo a reunião delas) à suspensão.
Para se fazer ampliação de escala deve- se manter o produto Fc*t (força * tempo). 
INTRODUÇÃO
Os produtos obtidos e desejáveis dos mostos fermentados muitas vezes se encontram em baixas concentrações. 
Além disso, os mostos apresentam diversas moléculas como 
sólidos suspensos ou coloidais,
 fragmentos de microrganismos e de células, 
solutos extracelulares (proteínas, Ac. nucléicos, etc) 
 produtos do metabolismo da célula (ácidos orgânicos, antibiotiocos)
 além dos diferentes nutrientes presentes no meio (sais, açucares). 
As dimensões dessas substancias variam de nanômetros para milímetros, o que provoca consideráveis problemas na separação.
Os Bioprodutos de alto valor agregado geralmente estão presentes em baixíssimas concentrações 
Os custos envolvidos na etapa de recuperação são muito superiores.
Um desafio na aplicação de diferentes processos de separação em biotecnologia além do que foi citado anteriormente é a sensibilidade de muitas moléculas alvo em condições de pH e temperatura, força ionica e tensões cisalhantes
Os processos de separação pro membrana vem como alternativa
PROCESSO DE SEPARAÇÃO POR MEMBRANAS
VANTAGENS
A reação e a separação podem ocorrer simultaneamente e se possível no mesmo equipamento.
PRECIPITAÇÃO
É uma das operações mais adotadas para a purificação de proteínas de origem microbiana, animal ou vegetal
A precipitação é uma perturbação em uma solução proteica que causa a formação de partículas insolúveis recuperadas posteriormente por uma separação sólido líquido.
Precipitados de proteínas são agregados de de diferentes moléculas proteicas, grandes o suficiente para serem observadas olho nú e sedimentam-se sobre valor de força centrífuga relativamente baixa.
Ela pode ser utilizada como etapa única de purificação dependendo do grau de pureza, isso geralmente pode ocorrer para proteínas extracelulares.
PRECIPITAÇÃO
VANTAGENS
DESVANTAGENS
De se concentrar e purificar proteínas,ácidos nucléicos e pequenos metabolitos
 Facilidade de Operação 
Adptados para grande escala
Processo pode ser contínuo
Equipamentos relativamente simples
Grande numero de precipitantes que podem ser utilizados (muitos são de baixo custo ou baixa concentração necessária)
Pode desnaturar a biomolécula alvo
PRECIPITAÇÃO
PRINCÍPIOS DE PROTEÍNAS
Proteínas são formadas por aminoácidos ( tem 20 tipos principais)
Estruturas
Primáriaa.a ligação peptídica
Secundáriaespiral, helice,folhas pregueadas lig de hidrogenio entre duas lig. petídicas
Terciáriadobramento da estru. Secundária pontes dissulfeto(lig. Covalente entre 2 resíduos de cisteína) proteínas
globulares
Quartenáriaassociação de 2 ou mais glóbulos de proteínas ligações de Van der Waals e Ligações de Hidrogenio
CADEIAS LATERAIS DOS a.a
Estrutura terciária
Estrutura primária
Estrutura secundária
Estrutura quaternária
Solubilidade de Proteínas
Regiões Hidrofóbicas (Apolares)
Regiões Hidrofílicas
(Polares)
Determinam a solubilidade
Além dos aa, íons ferro e cobre, oligossacarídeos e lipídeos conferem diferentes solubilidades às proteínas.
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PRECIPITAÇÃO
SOLUBILIDADE 
FATORES QUE INFLUENCIAM A SOLUBILIDADE
Solubilidade de um soluto e solvente é determinada pelo resultado global das interações atrativas repulsivas entre as moléculas de solvente e soluto.
A distribuição dos resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos na superfície das proteínas determinará sua solubilidade em diferentes solventes.
Glicoproteínas Solúveis em água devido seus resíduos de carboidratos serem fortemente hidratados.
Lipoproteínas Relativamente Insolúveis em virtude da hidrofobicidade dos lipidios.
pH: exerce grande influência na presença ou ausência de cargas pois ele regula a dissociação dos grupos ácidos e básicos de uma proteína.
O pH de solubilidade é igual ou próximo ao PI.
Aumento da temperatura pode romper ligações de hidrogênio e pontes dissulfeto e resultar na desnaturação
Valores de pH muito incomuns ao que determinada proteína habituada pode causar desnaturação
Solventes orgânicos também podem desnaturar a proteína pois são capazes de penetrar no seu glóbulo e causar interferências nas zonas hidrofóbicas internas.
As variariações de temperatura e Ph não são independentes no aspecto da desnaturaçaõ.
DESNATURAÇÃO
PRECIPITAÇÃO
Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.
A precipitação de proteínas pode ser induzida por:
	- adição de sais (Precipitação salina)
	- adição de solventes
	- variação de pH (Precipitação isoelétrica)
PRECIPITAÇÃO POR SAIS
PRINCÍPIO
Salting-in:Diminuição da concentração de sal
Salting-out:Aumento da concentração de sal
Em baixa concentração salina, a solubilidade das proteínas aumenta, pois os íons do sal ajudam a reforçar a camada de solvatação.
Em alta concentração salina, a solubilidade das proteínas diminui pois os íons do sal competem pelas moléculas de água disponíveis para formar a sua própria camada de solvatação.
Sais com ânions divalentes são mais eficientes do que os monovalentes na precipitação de proteínas
Ocorre a neutralização das cargas superficiais da proteína e redução da camada de hidratação, favorecendo a agregação dos resíduos hidrofóbicos
A baixa força ionica O aumento da temperatura favorece o salting-out, mas o processo é conduzido preferencialmente à 4ºC.
Sais mais adequados são aqueles que apresentam elevada solubilidade.
Os mais usados são:
citrato de sódio
sulfato de sódio
sulfato de amônio
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PRECIPITAÇÃO POR SOLVENTES
A solubilidade das proteínas varia com a distribuição dos resíduos hidrofílicos e hidrofóbicos na superfície da molécula;
Álcoois de cadeia inferior, acetona, éteres e outros são usados como precipitantes desde início do século XIX;
Aplicação clássica: fracionamento das proteínas do plasma sanguíneo por etanol frio (Método de Cohn)
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MECANISMO
Principal efeito:  da constante dielétrica do meio
Agregação de proteínas por interações eletrostáticas entre superfícies com cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgânico. 
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Precipitante
Princípio
Vantagens
Desvantagens
Sais neutros
(salting-out)
Interações hidrofóbicas pela redução da camada de hidratação da proteína
- Uso universal
- Baixo custo
- Corrosivo
- Liberação de amônia em pH alcalino
Polímeros não-iônicos
Exclusão da proteína da fase aquosa reduzindo a quantidade de água disponível para a solvatação da proteína
- Uso de pequenas quantidades de precipitante
- Aumento da viscosidade
Calor
interações hidrofóbicas e interferência das moléculas de água nas ligações de hidrogênio,
- Baixo custo
- Simples
- Risco de desnaturação
Principais métodos de precipitação de proteínas
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Precipitante
Princípio
Vantagens
Desvantagens
Polieletró-litos
Ligação com a molécula de proteína atuando como agentefloculante
- Uso de pequenas quantidades de precipitante
- Risco de desnaturação
Precipitação isoelétrica
Neutralização da carga global da proteína pela alteração do pH do meio
- Uso de pequenas quantidades de precipitante
- Risco de desnaturação
Sais metálicos
Formação de complexos
- Uso de pequenas quantidades de precipitante
- Risco de desnaturação
Solventes orgânicos
Redução da constante dielétrica do meio aumentando as interações eletrostáticas intermoleculares
- Facilidade de reciclagem
- Facilidade na remoção do precipitado
- Risco de desnaturação de proteínas
- Inflamável e explosivo
PREPARAÇÃO PROVA 2- CROMATOGRAFIAS
Etapas Cromatográficas Gerais
Afinidade
Imunoafinidade
Interação Hidrofóbia
Troca Iônica
PREPARAÇÃO PROVA 3- CROMATOGRAFIAS
Leito Expandido
Exclusão Molecular
Íons Metálicos
Covalente
Integração de Processos
Cromatografia de Leito Expandido