Relatorio Meios de culturae técnicas de semeadura

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PR
CECE - CENTRO DE ENGENHARIAS E CIÊNCIAS EXATAS
 ENGENHARIA QUÍMICA – 3º ANO
 MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
MEIOS DE CULTURA E TÉCNICAS DE SEMEADURA
TOLEDO/PR
Outubro, 2018
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PR
CECE - CENTRO DE ENGENHARIAS E CIÊNCIAS EXATAS
 ENGENHARIA QUÍMICA – 3º ANO
 MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Éden Rockembach
Marllon Felipe 
Victoria Lanzana 
MEIOS DE CULTURA E TÉCNICAS DE SEMEADURA
Relatório entregue como requisito parcial de avaliação da disciplina de Microbiologia Industrial do curso de Engenharia Química da Universidade Estadual do Oeste do Paraná - Campus Toledo.
Prof. Jacqueline Ferandin Honorio.
Toledo, 24 de outubro de 2018.
INTRODUÇÃO 
Para que seja possível realizar o estudo de bactérias é necessário que estas sejam previamente isoladas e identificadas, para isso são utilizados meios de culturas diferentes, os quais devem oferecer condições compatíveis à sobrevivência do microrganismo em questão. Os nutrientes indispensáveis são o carbono, nitrogênio, oxigênio, hidrogênio, enxofre e fósforo, que podem se apresentar em compostos orgânicos e inorgânicos, dependendo se a bactéria é heterotrófica ou autotrófica. Além dos nutrientes, as condições físicas devem permitir o crescimento das colônias, portanto os meios de cultura devem ser incubados em temperatura, atmosfera gasosa, pH, umidade e outros fatores específicos para cada microrganismo que se pretende estudar. 
Os meios de cultura podem se classificar quanto à composição, ao estado físico e a à finalidade e características e entre essas classificações existem ainda subclassificações. As composições dos meios de cultura podem ser naturais, os quais são encontrados na natureza, de origem animal (gema de ovo) ou vegetal (pedaço de batata), ou artificias, que podem ser definidos, onde se conhece a composição qualitativamente e quantitativamente ou indefinidos, no qual é feita apenas uma estimativa qualitativa da sua composição, como meios suplementados com sangue e alimentos. O estado sólido é definido pela concentração de ágar no mesmo, onde os meios sólidos, de maior concentração, possuem de 1,5 a 2,5% de ágar em sua composição, os semilíquidos apresentam até 1% de ágar e os meios líquidos são desprovidos de ágar. 
Afim de facilitar os estudos, é possível utilizar um meio de cultura específico para cada microrganismo, esses meios são classificados quanto à finalidade e suas características, podendo ser seletivos, diferenciais, indicadores, de enriquecimento. Os meios seletivos possuem agentes inibidores de determinados microrganismos, permitindo o crescimento apenas da bactéria de estudo. Os meios diferenciais permitem a distinção de microrganismos baseando-se na capacidade de metabolização de componentes específicos do meio de cultura. Meios indicadores são utilizados para realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas dos organismos. Meios de enriquecimento proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de um microrganismo específico ou em baixos números ou de crescimento lento. Além de estimular o crescimento este meio tem a propriedade de inibir o desenvolvimento de outros, mas não seu isolamento, uma vez que o meio é líquido. 
Para que os microrganismos de estudo se desenvolvam no meio de cultura é necessário que se realize a inoculação dos mesmos, a qual consiste na contaminação proposital do meio de cultura por meio de técnicas de semeadura. Para que apenas a bactéria desejada seja semeada é indispensável que se adote técnicas de assepsia afim de que não haja contaminação de materiais, meios e culturas. 
As técnicas de inoculação dependerão do estado físico dos meios de origem e destino e da finalidade. Em meios sólidos a inoculação pode ser feita em tubos ou placas de Petri. Em tubos com o meio inclinado, deve-se semear com alça ou agulha bacteriológica em zig-zag (estria sinuosa) ou em uma linha reta (estria reta), partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio) cuidando para não perfurar o ágar, ou então perfurando a agulha no centro do ágar (picada central). A estria sinuosa é utilizada quando se deseja obter intensa massa de microrganismos, a reta quando se deseja pequena massa de microrganismos e a picada central utiliza-se para verificar fermentação e motilidade. Quando o meio está em placa de Petri é possível realizar a semeadura por pour-plate, onde a placa está vazia e é transferido 1 mL da cultura para a placa e depois colocado cerca de 15 mL do meio fundido sobre a cultura e então homogeneíza-se ambos em movimentos circulares, que visa a contagem bacteriana. É realizada também a técnica de estria simples, em que se transfere a cultura para o meio com uma alça bacteriológica, estriando-a, em zig-zag ou uma linha reta, e esta técnica é utilizada para visualizar determinadas atividades metabólicas e produção de pigmentos. O método de esgotamento é o mais utilizado para isolamento de colônias, o qual é feito estriando a alça bacteriológica contaminada pela cultura sobre o meio divido em 4 quadrantes sendo possível inocular de duas maneiras, sendo uma delas realizar 3 estrias, onde uma delas ocupará dois quadrantes e nenhuma delas terá a mesma direção, ou 4 estrias, cada uma ocupando um quadrante e nenhuma delas na mesma posição, que é possível obter girando a placa em 90° ao terminar cada uma. É importante que as estrias de cada quadrante não se cruzem, para que as colônias sejam isoladas. O método de spread-plate consiste em transferir 0,1 mL da cultura para o meio sólido na plca e então espalhar uniformemente com a própria ponta da pipeta, alça bacteriológica, swab ou alça de Drigalsky, visando obter crescimento confluente ou para contagem bacteriana.
Em meio semissólido utiliza-se a técnica de picada em profundidade, a qual diferencia da técnica de picada central apenas na posição do meio, onde este não estará inclinado. 
Ao utilizar meio líquido deve-se contaminar uma alça com o microrganismo e introduzi-la no meio com agitação da mesma, para que o microrganismo esteja difuso no líquido. Este método é um repique genérico para crescimento bacteriano em meio líquido.
OBJETIVOS
Determinar a finalidade das principais técnicas de semeadura de bactérias, em diferentes meios e vidrarias, e diferentes meios de cultura e suas características. 
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
- Cultura bacteriana de E. coli em caldo nutriente;
- Cultura mista (E. coli, Salmonella, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Staphylococcus aureus);
- Alça bacteriológica;
- Swabi;
- Bico de Bunsen;
- Placa contendo meio com Ágar Nutriente;
- Tubo de ensaio com Ágar nutriente inclinado;
		- Placa contendo meio Plate Count Ágar (PCA);
		- Placa contendo meio Ágar Mc Conkey;
		- Placa contendo meio Ágar Eosina Azul de Metileno;
		- Placa contendo meio Ágar Manitol Sal;
		- Placa contendo meio Ágar Rappaport;
		- Placa contendo meio Potato-dextrose-ágar (PDA) acidificado.
Métodos 
Meios de cultura 
A partir da cultura mista inocular placas, em forma de esgotamento com auxílio de um swabi, contendo meio Ágar Eosina Azul de Metileno, Ágar Mc Conkey, Plate Count Ágar (PCA), Ágar Rappaport e Potato-dextrose-ágar (PDA) acidificado e então incubar as placas a 37°C por 48 horas e observar o crescimento em cada uma delas.
 
Técnicas de semeadura 
Com a alça bacteriológica contaminada pela cultura de E. coli, inocular o tubo com caldo nutriente por meio de difusão, o tubo com ágar inclinado pela técnica de estria sinuosa ou reta. Inocular a placa de Petri através da técnica de esgotamento em estrias. 
 
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Após 24horas de incubação alguns meios de cultura apresentaram intenso crescimento, enquanto outros não apresentaram nenhum, a Figura 1 mostra o desenvolvimento destes microrganismos. 
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Figura 1 - Meios de cultura após 24h de incubação, cada um deles contendo (a) Potato-dextrose-ágar acidificado, (b) Plate Count Ágar, (c) Ágar Eosina Azul de Metileno, (d) Ágar Rappaport e (e) Ágar Mac Conkey.
	É possível observar que os microrganismos não foram bem isolados, já que estão completamente espalhados pelo meio, apenas no ágar Rappaport obteve-se diminuição na quantidade de organismos em cada estria. O swabi, utilizado para inocular os meios, é capaz de armazenar grande quantidade dos microrganismos e por ser um caldo líquido, acaba se espalhando pela placa. 
	O ágar batata dextrose (PDA) não apresentou nenhuma colônia, apesar de ser utilizado para crescimento de leveduras e bolores, como a Saccharomyces cerevisiae e Candida albicans, respectivamente. Este ágar pode ser suplementado com ácido ou antibióticos para inibir o crescimento de bactérias, o que não permitiu o crescimento dos outros microrganismos presentes na cultura mista. A composição de dextrose e infusão de batata estimulam o crescimento de fungos, porém a concentração pode não ser o suficiente para que os microrganismos se desenvolvessem (NEOGEN, 2011)
	O plate count agar (PCA) é um meio utilizado para contagem bacteriana em produtos alimentícios, água e amostras de importância sanitária, o qual apresenta bom crescimento de E. coli e Staphylococcus aureus, porém não é possível diferenciar ou quantificar cada uma delas. 
	O ágar azul de metileno possui em sua composição Eosina y e Azul de Metileno, corantes que agem como indicadores de pH e como inibidores, o que caracteriza o meio como seletivo e diferencial. (NEOGEN, 2011). O corante azul de metileno inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos e a eosina diferencia as bactérias fermentadoras das não fermentadoras, de forma que as fermentadoras apareçam com cor metalizada por diminuírem o pH do meio, como foi possível observar na Figura 1-(c) por conta do desenvolvimento de E. coli.
	O ágar Rappaport possui diversos princípios de procedimento, os quais o caracteriza como seletivo e de enriquecimento, já que o Verde Malaquita inibe organismos que não sejam da espécie Salmonella (seletivo) e promove o crescimento desta bactéria juntamente com baixo pH e cloreto de magnésio. 
	O Ágar Mac Conkey é recomendado para a detecção e isolamento de organismos Gram-negativos e a mistura de Sais Biliares e Cristal Violeta são os agentes seletivos, inibindo os organismos Gram-positivos e permitindo o crescimento de organismos Gram-negativos. Além da capacidade seletora, este ágar é um meio diferencial também por conter lactose e um indicador de pH (vermelho neutro) que distingue bactérias que fermentam, como a E. coli, e que não fermentam como a Salmonella, a qual foi a que se desenvolveu melhor no meio uma vez que as colônias das bactérias fermentadoras de lactose aparecem rosadas. 
CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS
http://foodsafety.neogen.com/pdf/acumedia_pi/7149_pt_pi.pdf
http://foodsafety.neogen.com/pdf/acumedia_pi/7134_pt_pi.pdf
FIORESE L. M. Apostila dos Roteiros para a realização das Práticas em Microbiologia Industria l. Universidade Estadual do Oeste do Paraná. Toledo, 2016.
Biomedicina e Microbiologia. Meios de cultura. Disponível em: < http://biomedicinaemicro.blogspot.com.br/p/meios-de-cultura.html>. Acesso em 22 de outubro de 2018.