Enzimas-Atual

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Paulo Preté
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 Enzimas: catalisadoras das reações que ocorrem nos sistemas biológicos. 
 Reações químicas necessárias para o crescimento, a restauração e a manutenção de organismos vivos. 
 Catalisador: não são consumidos podendo ser reutilizados.
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Sem a catálise as reações não ocorreriam em velocidade útil: 
 digestão de alimentos.
 envio de sinais através dos nervos.
 contração muscular.
Catalisadores: aumentam a velocidade das reações diminuindo a energia de ativação. 
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Energia de ligação
 Energia de ligação da enzima ao substrato: pode ser utilizada para tensionar o substrato ou provocar uma mudança conformacional na enzima (ajuste induzido). 
 Essa energia também responde pela refinada especificidade da enzima pelo substrato.
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 Enzimas são Proteínas, exceto um grupo de moléculas de RNA (Ribozima).
 Alta especificidade pelos substratos, funcionam em soluções aquosas sob diferentes condições de temperatura e pH. 
 A maioria das enzimas apresenta uma temperatura ótima (quando a reação em que ela está envolvida alcança seu máximo de velocidade) em torno de 30 a 40°C, principalmente em temperatura corporal.
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 Em adição aos efeitos da temperatura e do pH, a atividade enzimática (velocidade da reação química) pode ser aumentada com o aumento das concentrações dos reagentes. 
 A velocidade da reação diminuirá quando as enzimas estiverem saturadas. 
 Enzimas também apresentam uma faixa ótima de pH (ex: pepsina encontrada no suco gástrico o pH 2,0; tripsina do suco pancreático o pH 8,2).
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 Com o aumento da quantidade de enzima a velocidade da reação aumentará se houver suprimento ilimitado de substrato.
 Enzimas podem ser desnaturadas quando expostas a altas temperaturas, álcool, ácidos fortes e reagentes alcalóidicos (inibidores não específicos).
 Estruturas 1ª, 2ª, 3ª e 4ª: fundamentais para a atividade
 Isozimas: enzimas que tem a mesma função mas possuem características estruturais levemente diferentes.
 PM: 12.000 a 1 milhão Da.
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 NOMENCLATURA DAS ENZIMAS
Nome Recomendado:  Mais curto e utilizado no dia a dia; Sufixo "ase" para caracterizar a enzima. Ex: Urease, Hexoquinase, Peptidase. 
Nome Sistemático: Mais complexo, nos dá informações precisas sobre a função metabólica da enzima. Ex: ATP-Glicose-Fosfo-Transferase. 
- Nome Usual: Consagrados pelo uso; Ex: Tripsina, Pepsina, Ptialina. 
 O termo: "en" = dentro "zima" =  levedura
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Classificação internacional das enzimas
Oxidorredutases: Catalisam reações de oxirredução entre 2 substratos (Transferência de elétrons).
Transferases: Transferência de grupos funcionais entre 2 substratos.
Hidrolases: Reações de hidrólise.
Liases: Remoção de grupos de substratos através de reações diferentes da hidrólise.
Isomerases: Transferência de grupos na mesma molécula para formar isômeros (cis-trans).
Ligases: Acoplamento de 2 compostos com a ruptura de ligações pirofosfato. Formação de ligações (C-C, C-S, C-O e C-N) por meio de reações de condensação acopladas a quebra de ATP.
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CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS
OXIDORREDUTASES: São enzimas que catalisam reações de transferência de elétrons, ou seja: reações de oxi-redução. São as Desidrogenases e as Oxidases 
TRANSFERASES: Enzimas que catalisam reações de transferência de grupamentos funcionais como grupos amina, fosfato, acil, carboxil, etc. Como exemplo temos as Quinases e as Transaminases 
HIDROLASES: Catalisam reações de hidrólise de ligação covalente. Ex: As peptidases; 
LIASES: Catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico. As Dehidratases e as Descarboxilases são bons exemplos; 
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ISOMERASES: Catalisam reações de interconversão entre isômeros ópticos ou geométricos. As Epimerases são exemplos; 
LIGASES: Catalisam reações de formação e novas moléculas a partir da ligação entre duas já existentes, sempre às custas de energia (ATP). São as Sintetases;
CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS
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 Co-fatores ou ativadores: 1 ou mais íons inorgânicos, uma molécula orgânica complexa ou uma molécula metalorgânica (coenzima).
Co-fatores enzimáticos
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Vários tipos de reações químicas ocorrem entre o substrato e os grupos funcionais da enzima:
 cadeias laterais de aa específicos
 íons metálicos
 coenzimas
Esses grupos funcionais catalíticos podem formar uma ligação covalente transitória com um substrato e ativa-lo p/ a reação ou algum grupo pode ser transferido do substrato para a enzima. 
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 Grupo prostético: Coenzima ou íon metálico ligado firmemente ou covalentemente à parte protéica da enzima; não são desativadas pelo calor (ex: vitaminas ou compostos derivados das vitaminas).
 Holoenzima: enzima completa e cataliticamente ativa com coenzima ou íon metálico ligado.
 Apoproteína: parte protéica desta enzima.
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 Coenzima A (CoA): essencial no metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas no corpo humano.
 A hidrólise de CoA produz 1 vitamina, 1 purina, 1 açúcar, ácido fosfórico e 1 composto sulfurado. 
 Acetil CoA: age na oxidação dos alimentos no ciclo de Krebs.
 NAD+ e NADP+ : estão envolvidas na maioria das reações de oxirredução na mitocôndria além de atuarem no ciclo de Krebs. 
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 Modificações covalentes: fosforilação, glicosilação e outros processos (interferem na atividade).
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 A maior parte da energia necessária para diminuir a energia de ativação é derivada de interações fracas (não-covalentes) entre substrato-enzima (pontes de H, interações hidrofóbicas e iônicas).
 GB energia de ligação = derivada destas interações, é a maior fonte de energia livre usada pelas enzimas p/ diminuir a energia de ativação das reações.
 Estado de transição: ponto no topo da colina de energia no qual a passagem para o estado de (S) ou (P) é igualmente provável. 
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E – pode sofrer mudanças conformacionais induzidas pelas múltiplas interações fracas com o S 
[S] – afeta a velocidade das reações catalisadas pelas E 
E + S  ES (reação rápida) 
 V0 proporcional  [S] -  formação ES
 Quando todas as E estão na forma combinada ES, pode-se aumentar [S] que não haverá aumento V0 
 A Vmáx será atingida quando praticamente todas as E estiverem combinadas (ES)
 ES resulta em E + P e a E se liga a outro S.
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CINÉTICA ENZIMÁTICA
	É a abordagem utilizada para estudar o mecanismo de uma reação catalisada por uma enzima e Determinar a função de uma enzima em uma rota metabólica.
Determinar a velocidade da reação e como ela se altera em função de mudanças nos parâmetros experimentais;
Determinar as constantes de afinidade do S e dos inibidores;
Conhecer as condições ótimas da catálise;
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Km = constante de Michaelis-Menten
 Km é a concentração de substrato que produz metade da velocidade máxima de uma reação.
 Km é característica para cada enzima agindo sobre um determinado substrato.
 A equação relaciona a velocidade inicial (V0) de uma reação enzimática com a concentração de substrato e a velocidade máxima (Vmáx) pela constante Km.
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CINÉTICA DA REAÇÃO ENZIMÁTICA
DIFERENTES SUBSTRATOS
LEONOR MICHAELIS
1875 - 1949
MAUD MENTEN
1879 - 1960
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CINÉTICA DA REAÇÃO ENZIMÁTICA
 Reação enzimática processa-se em duas etapas:
Enzima (E) liga-se reversivelmente ao substrato (S), formando o complexo enzima-substrato (ES).
	 E + S  ES
É liberado o produto
 E + S  ES  E + P
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INTERAÇÃO ENZIMA-SUBSTRATO
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E pode se ligar a 2 ou mais S
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Inibidores: agentes moleculares que interferem com a catálise diminuindo ou interrompendo as reações.
Reversíveis: 
- Competitiva: compete com o substrato pelo sítio ativo da enzima. Seu desligamento pode ser obtido com o aumento do substrato.
- Incompetitiva: se liga a 1 sítio diferente, liga-se apenas ao complexo ES formando ESI.
- Mista: o I também se liga a 1 sítio diferente mas pode
se ligar a E ou a ES formando ESI.
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 Inibidores irreversíveis: formam ligações covalentes fortes com a enzima, tornando-a inativa. Este inibidor não se desliga com o aumento do substrato. 
Ele se combina com um grupo funcional na E ou o destroem ou ainda formam uma associação covalente bastante estável.
Ex: Zalcitabina é usada em pacientes com infecção avançada pelo HIV; na célula ela é convertida a um metabólito ativo que atua como inibidor competitivo do substrato natural para o sítio ativo da transcriptase viral reversa, inibindo a replicação do vírus. 
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Inibidores específicos das enzimas
 Afetam uma única enzima ou um grupo de enzimas (a maioria das substâncias venenosas).
 Íons cianeto (CN-): inibem a atividade da enzima citocromo oxidase.
 Compostos de mercúrio e chumbo: reagem com o grupo sulfidrila (_SH) de uma enzima alterando sua conformação (envenenamento: resulta em perda de equilíbrio, visão e tato, audição, que geralmente é irreversível).
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Compostos organofosforados
 Inseticidas (malation e paration) e vários gases de guerras.
 Inibidores irreversíveis da colinesterase (enzima que rompe a acetilcolina no espaço sináptico das células nervosas do cérebro)
	- Bloqueio de neurotransmissores fazendo com que os sítios receptores no cérebro “acendam” repetidamente superestimulando os músculos.
 Coração bate rápido e de forma irregular (convulsões e morte).
 Antídotos: podem agir deslocando o substrato venenoso da enzima ou bloqueando os efeitos do excesso de acetilcolina.
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Inibidores enzimáticos benéficos
 Penicilina: atua como inibidor enzimático para a transpeptidase (essencial para que as bactérias construam suas paredes celulares). Sem a parece celular as bactérias são destruídas pela pressão osmótica.
 Linhagens bacterianas desenvolveram a penicilinase, que inativa a penicilina, sendo necessário desenvolver penicilinas modificadas sinteticamente para manter sua efetividade.
 cAMP: mensageiro químico que regula a atividade enzimática dentro das células que armazenam carboidratos e gorduras. 
 A falta de cAMP gera caos com todas as enzimas trabalhando em velocidade máxima e seu suprimento inadequado pode levar ao desenvolvimento de câncer. 
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CINÉTICA DA REAÇÃO ENZIMÁTICA CATALISADA 
EM PRESENÇA DE INIBIDOR COMPETITIVO
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CINÉTICA DA REAÇÃO ENZIMÁTICA CATALISADA 
EM PRESENÇA DE INIBIDOR NÃO-COMPETITIVO
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pH ótimo no qual sua atividade é máxima em pH > ou < a atividade diminui. 
 Cadeias laterais dos aa do centro ativo da E podem atuar como ácidos e bases fracas, com funções críticas dependentes de certos estados de ionização.
 As cadeias laterais ionizadas podem desempenhar um papel essencial nas interações que mantém a estrutura da E.
 O pH no qual a E sofre mudanças na atividade pode fornecer uma pista sobre qual aa está envolvido.
Ex: mudanças na atividade em pH 7.0, em geral reflete a titulação de uma His.
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 temperatura :
-  taxa de reação (maioria das reações químicas);
-  estabilidade da proteína devido a desativação térmica.
Temperatura ótima: enzima atinje sua atividade máxima (t ºC máxima na qual a enzima possui atividade cte. por um período de tempo).
EFEITO DA TEMPERATURA
Efeito da temperatura depende:
	- pH e a força iônica do meio;
	- presença ou ausência de ligantes.
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 Velocidade de transformação do S em P  quantidade de E.
 Desvios da linearidade ocorrem:
 Presença de inibidores na solução de enzima;
 Presença de substâncias tóxicas;
 Presença de um ativador que dissocia a enzima;
 Limitações impostas pelo método de análise.
 Recomenda-se:
 Enzimas com alto grau de pureza;
 Substratos puros;
 Métodos de análise confiável.
CONCENTRAÇÃO DAS ENZIMAS
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 [S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P.
 Medir Vo = velocidade inicial da reação.
 [E] = cte.
 [S] pequenas  Vo  linearmente.
 [S] maiores  Vo  por incrementos cada vez menores.
 Vmax  [S]  Vo insignificantes.
 Vmax é atingida  E estiverem na forma ES e a [E] livre é insignificante, então, E saturada com o S e V não  com  de [S].
CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO
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 Metabolismo celular: grupos de enzimas trabalham em conjunto em vias seqüenciais para desenvolver um dado processo metabólico.
 Nestes sistemas enzimáticos, o produto da reação da 1ª enzima torna-se o substrato da próxima e assim sucessivamente.
 Em cada via metabólica existe pelo menos uma enzima reguladora, que determina a velocidade de toda sequência, porque ela catalisa a reação mais lenta (reação limitante da velocidade).
Atividade enzimática pode ser medida pela velocidade da reação catalisada.
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 Ajustes de velocidade permitem a célula acertar as mudanças nas necessidades de energia e de biomoléculas requeridas para o crescimento e reparo.
 2 grandes classes de enzimas reguladoras: 
- Alostéricas: funcionam por meio de ligação não-covalente reversível de compostos reguladores (moduladores alostéricos) que geralmente são metabólitos ou cofatores (induzem mudanças conformacionais). 
- Outras enzimas: reguladas por meio de uma modificação covalente reversível.
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 Estimuladas ou Inibidas quando ligadas a outras enzimas regulatórias.
 Ativadas quando segmentos peptídicos são removidos por meio de uma clivagem proteolítica (irreversível).
Enzimas podem ser:
Enzima reguladora homotrópica: o substrato e o modulador são idênticos;
Heterotrópica: substrato diferente do modulador.
 E reguladoras: sítio ativo, 1 ou mais sítios reguladores para ligação do modulador (maiores e mais complexos). 
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 E reguladora: inibida pelo P (sempre que [P] > as necessidades celulares), inibição por retroalimentação.
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 A fosforilação de resíduos de aa específicos é um meio muito comum de regular a atividade da enzima.
 Muitas enzimas proteolíticas apresentam precursores inativos chamados zimogênio.
 Pequenos peptídeos são quebrados do zimogênio para formar a protease ativa.
ZIMOGÊNIO
Ex: Pepsinogênio – pepsina
Tripsinogênio-tripsina
Protrombina-trombina
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TIPOS DE APLIÇÕES INDUSTRIAIS
Alimentos
- Indústria de azeite de oliva: poligalacturonase e pectinesterase na melhoria da estabilidade a longo prazo.
- Panificação: Melhoria de cor, sabor e estrutural através de preparado enzimático que contém alfa-amilase fúngica. 
	- Atua sobre a farinha de trigo, acelera o processo de fermentação devido a maior formação de açúcares para o fermento.
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 Enzimas nas rações para leitões durante o período de lactação: Xilanase, Beta-glucanase e Alfa-amilase (digestão de amido e conseqüente ganho de peso e abate precoce).
Papel e Celulose
 Remoção de depósitos em máquinas de papel:
 Substituição de álcalis e ácidos fortes por enzimas (assegurar a integridade física dos funcionários e cumprir leis ambientais).
Rações animais
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 Eliminação dos pelos (Enzimas substituem a utilização do sulfureto de sódio – forte cheiro desagradável e poluente dos efluentes).
Indústria de Couro
Amilase bacteriana (Bacillus subtilis e B. lichenformis), estável ao calor para eliminar a goma dos produtos têxteis, (substituindo ácidos e álcalis na hidrólise do amido).
Indústria têxtil
Outras aplicações
 Indústria de Cosméticos.
 Produtos de Limpeza.
 Inativação Enzimática.
 Ferramentas laboratoriais. 
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Quimioterapia
É o uso de agentes químicos para destruir microorganismos infecciosos e células cancerosas sem danificar as células hospedeiras.
Esses agentes químicos funcionam inibindo certas reações enzimáticas.
Antibióticos: inibem enzimas essenciais para o crescimento bacteriano (ex: penicilina e tetraciclina; adriamicina - tratamento da doença de Hodgkin).
Antimetabólitos: apresentam estruturas intimamente relacionadas com a de substratos enzimáticos, inibindo a atividade enzimática (ex: mercaptopurinas - tratamento de leucemias).
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Diagnósticos
 Medidas dos níveis enzimáticos no plasma
podem ser de grande valor diagnóstico.
↑ glutâmico pirúvico transaminase caracteriza a ocorrência de hepatite infecciosa.
↑ tripsina é indicativo de doenças agudas do pâncreas.
↓ ceruloplasmina é indicativo da doenças de Wilson.
Alterações nos níveis de enzimas Lactato desidrogenases (LDH) podem ser úteis no diagnóstico de: infarto do miocárdio, hepatite aguda, distrofia muscular, anemia megaloblástica, anemia falciforme e artrite com derrame nas juntas.
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Em adição às enzimas já citadas, diversas enzimas séricas são utilizadas em diagnósticos:
 Transaminase glutâmica – oxaloacética sérica (SGOT)
 Amilase
 Ácido fosfórico
 Alcalino fosfatase
 Creatina fosfocinase (CPK)
 Renina
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Assim como as proteínas, as enzimas são fundamentais para a maquinaria dos seres vivos, atuando na fotossíntese, na respiração celular, nas vias metabólicas e na maioria dos processos em tudo que nasce, cresce, desenvolve e morre.
Conclusão
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Referências
- Reginald Garrett and Charles Grisham. Biochemistry, 2ª edição. 
 David L. Nelson e Michael M. Cox. Lehninger Princípios de bioquímica, 3ª edição. 
- Donald Voet, Judith G. Voet e Charlotte W. Pratt. Fundamentos de bioquímica.