Prévia do material em texto
MICROSCOPIA O objetivo da microscopia é a obtenção de imagens ampliadas de um objeto, que nos permitam distinguir detalhes não revelados a olho nu. O olho humano é um importante sensor em microscopia. O olho humano tem o poder de resolução correspondente a 0,1mm, sem auxílio de lentes. Como limite de resolução entende-se a menor distância entre dois pontos que permita distingui-los separadamente. Com isso, a capacidade de visualização de detalhes ou estruturas inferiores a esse limite de resolução ficam invisíveis ao olho humano, necessitando de ampliação. Um microscópio fotônico pode ampliar um material até 200 vezes, enquanto um microscópio eletrônico chega a aumentar mais de 300.000 vezes (Mannheimer, 2002). Assim, o microscópio é um aparelho que apresenta associação de lentes de vidro, de modo que é possível reproduzir para o olho humano uma imagem aumentada e detalhada de objetos, células, tecidos e órgãos, que à vista desarmada não seria possível se observar mais detalhes (Taboga, 2001). A microscopia com luz visível, a mais tradicional de todas, continua sendo uma técnica poderosa para o estudo da microestrutura dos materiais. Oferece resolução da ordem de mícron, à qual vulgarmente se associa a um aumento de 1000 vexes, com profundidade de campo semelhante. Em comparação com outros microscópios modernos atualmente disponíveis, o microscópio fotônico (MF) tem facilidade de operação e baixo custo, que fazem com que seja o instrumento básico em qualquer laboratório de microscopia (Mannheimer, 2002). As amostras podem ser examinadas por um grande número de técnicas diferentes, e de acordo com a sua natureza. As observações podem ser feitas tanto em luz transmitida, para materiais transparentes, como em luz refletida, para materiais opacos. Em geral, a preparação das amostras para microscopia fotônica pode requerer técnicas que podem ser de baixa ou média complexidade. Qualquer que seja a técnica requer sempre alguns cuidados especiais para garantir boa resolução e contraste adequado (Mannheimer, 2002). O microscópio mais comumente usado em laboratórios de anatomia vegetal é o MF composto. Ele é constituído por um conjunto de componentes que podem ser divididos em 3 grupos: o sistema mecânico, o sistema de iluminação e o sistema de magnificação. Muitas vezes é possível adicionar um 4º sistema, que é o de documentação de imagem. Os componentes óticos preenchem duas finalidades principais: iluminar o objeto e formar do mesmo uma imagem ampliada para observação ou fotografia (Mannheimer, 2002). O sistema mecânico destina-se a manter os elementos óticos e a amostra em posição relativa para observação. São partes constituintes do sistema mecânico: base ou pé; braço; tubo ou canhão; revólver de lentes; mesa ou platina; charriort, parafusos macro e micrométrico e parafuso de regulagem do condensador (figura 1). O sistema de iluminação compreende as seguintes partes: fonte luminosa; diafragmas; condensador e filtros (figura 1). O sistema de magnificação é composto por lentes oculares e objetivas (figura 1). Figura 1: Identificação das partes constituintes de um microscópio fotônico. Unidades de medida utilizadas em microscopia Divide-se as unidades de estruturas biológicas em macroscópicas e microscópicas, sendo essas últimas invisíveis ao olho humano nu. As unidades de medida em microscopia compreendem o micrômetro (µm), usada em microscopia ótica; o nanômetro (nm) e o angstrom (Å), usadas em microscopia eletrônica (Quadro 1). Quadro 1: Unidades de medida geralmente usadas em microscopia. UNIDADE DE MEDIDA SÍMBOLO VALOR Micrômetro µm 0,001mm (milésima parte do mm) Nanômetro nm 0,001 µm (milésima parte do µm) Ângstrom Å 0,0000001mm (10-7mm) O aumento total das amostras observadas é calculado multiplicando-se os valores do aumento da objetiva e da ocular (Quadro 2). Quadro 2: Cálculo do aumento da amostras, segundo as objetivas do microscópio fotônico. OCULAR OBJETIVA AUMENTO DIÂMETRO DO CAMPO 10x 10x (pequeno aumento) 100x 1.500 µm 10x 40x (grande aumento a seco) 400x 375 µm 10x 100x (imersão em óleo) 1000x 150 µm Procedimentos básicos para a correta utilização do microscópio na observação de material biológico 1. Ligar a fonte luminosa (lâmpada). 2. Acomodar a lâmina com a amostra sobre a platina. 3. Ajustar a iluminação com o auxílio do condensador e do diafragma. 4. Observando pelo lado externo do microscópio, girar o parafuso macrométrico, aproximando a objetiva de 10x o máximo possível da amostra. 5. Olhando pela ocular, girar o mesmo parafuso no sentido inverso até obter uma imagem nítida da amostra. Ajustar com o micrométrico, se for necessário. 6. Após observação, focalizar com a objetiva de 40x, girando o tambor e posicionando a objetiva de 40x na direção da amostra e focalizar com o auxílio do parafuso micrométrico. 7. Para uma ampliação maior, (objetiva de 100x), girar o canhão, afastando a objetiva de 40x da amostra. Colocar uma gota de óleo de imersão sobre a amostra. Em seguida, girar o tambor, posicionando a objetiva de 100x sobre a preparação. Girar o parafuso micrométrico até ajustar o foco da amostra. OBSERVAÇÕES IMPORTANTES: 1) O óleo de imersão não pode entrar em contato com as objetivas de 10 e 40x, para não danificá- las. 2) Após a observação da amostra, remover o óleo da lente antes de guardar o microscópio, para que ele não seque e danifique a lente. Aula prática com preparação de lâmina com um pedaço de jornal de 1mm² Material: jornal, tesoura, lâmina de vidro, lamínula de vidro, pinça, conta gotas e água. Preparação da lâmina: 1) Obter um fragmento de jornal, de onde as letras sejam memores, medindo 1mm²; 2) Pingar um gota de água no centro de uma lâmina de vidro para microscopia; 3) Com o auxílio de uma pinça, colocar o fragmento de jornal sobre a gota de água e aguardar alguns segundos; 4) Colocar sobre o fragmento uma lamínula de vidro. Caso fiquem bolhas, pressionar levemente a lamínula com a pinça; 5) Posicionar a lâmina no microscópio para observação. Para transportar um microscópio, qual a melhor maneira de segurá-lo? Que peça é movimentada quando giramos o parafuso macrométrico? Para que serve o parafuso micrométrico? O que ocorre quando o giramos? O movimento é tão nítido quanto o do parafuso macrométrico? Eleve o canhão girando o macrométrico e observe as objetivas. São todas iguais e do mesmo tamanho? Verifique os números dos aumentos gravados nas objetivas. Como calcular o aumento que o microscópio fornece? Qual a função do espelho? Onde deve ser colocada a lâmina contendo a preparação para observação? Qual objetiva deve ser inicialmente usada para o procedimento de focalização? A que distância da lâmina deve ser colocada a objetiva antes de ser focalizado o material desejado? Qual parafuso deve ser usado inicialmente para focalizar o material? Quais outras partes do microscópio devem ser controladas para obtenção de maiores aumentos? Para ter certeza de que a preparação está em cima do foco de luz você olha por fora do microscópio ou diretamente através da ocular? Acoplado ao condensador existe um diafragma. Mover a alavanca do diafragma e descrever o que ocorre. Girar o tambor de forma a colocar a objetiva de menor aumento em cima da lâmina com preparação. Abaixar o canhão girando o macrométrico. Mexendo o espelho, colocá-lo na posição capaz de iluminar o interior do tubo. Tanto melhor será a focalização quanto mais claro estiver o círculo que você está vendo. Este círculo é o campo do microscópio. A preparação a ser observada deve estar no centro geométrico do campo iluminado. Na objetiva ocular há uma pestana(que funciona como uma seta). Girando-se a ocular a pestana se move e você pode usá-la para indicar uma estrutura que esteja querendo mostrar para alguém. Como exercício, focalizar um material e colocar a seta na região que deve ser observada. Esquematizar abaixo a observação feita em cada aumento sobre os fragmentos de jornal: Aumento de 40x Aumento de 100x Aumento de 400x