CRIOPRESERVAÇÃO DE SEMEN BOVINO E EQUINO AULA 1

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CRIOPRESERVAÇÃO DE SEMEN BOVINO E EQUINO
A criopreservação envolve tanto o congelação (mais usada para sêmen da espécie bovina) quanto a refrigeração (mais para equinos e suínos).
Histórico:
1949 = Polge e colaboradores congelaram sêmen de galo glicerol como crioprotetor.
1954 = Mies e Filho e Rosa --> 54,2% de prenhez sêmen congelado de bovino
1957 = primeira gestação equina sêmen criopreservado
Muitos experimentos biotecnica de criopreservação.
Introdução:
Estudamos a criopreservação de sêmen para o melhoramento genético, amento do ganho genético, otimizar outras biotecnicas principalmente a IA, conseguimos fazer animais melhoradores.
Vantagens:
Com um único ejaculado posso inseminar inúmeras femeas;
Otimização de reprodutores de alto potencial genético;
Previne acidentes decorrentes da MN e transporte;
Diminui os riscos de transmissão de doenças;
Comercio global;
Desenvolvimento de biotécnicas = IA, TE, PIV
Seguro biológico = banco genético (para animais em extinção por ex..)
Limitações:
Mão de obra especializada; (em bovinos apenas med veterinário faz criopreservação; e em suínos os funcionários da granja fazem);
Estrutura física e equipamentos específicos; 
Diminuição da fertilidade espermática danos causados pela redução da temperatura ( o sêmen congelado tem menor fertilidade pq o processo de criopreservação diminui a integridade da membrana plasmática do espermatozoide, diminui as chances de fecundar o oocito).
Colheita e avaliação de sêmen
BOVINO:
- vagina artificial (em centrais de sêmen)
- eletroejaculação (em propriedades normais)
- manipulação de glândulas acessórias transretal ( não se usa)
- preciso treinar o touro por um período de tempo para que ele suba na vagina artificial.
EQUINO:
- vagina artificial apenas
- farmacológica ( animal ejacula em estação xilazina + imipramina sucesso de 20%)
Analise do sêmen:
* Exames imediatos:
- macroscópicos: volume, cor, aspecto, odor
- microscópicos: turbilhonamento( rum 1 a 5), motilidade( qtos estão nadando e qtos estão parados 0-100%), vigor (1 a 5), concentração e morfologia espermática.
* Exames mediatos:
- concentração espermática; eq 1/20 bov 1/200 e peq rum 1/400
Toda vez que a diluição for 1/20 faço a media dos dois lados vezes 10 a 6/ml.
Toda vez que a diluição for 2/200 eu faço a media dos dois lados vezes 10 a 4/ml
Toda vez que a diluição for 1/400 eu faço a media dos dois lados x 2 x 10 a 7/ml
- morfologia espermática;
Analise do sêmen equino:
Antes de qq analise fazemos:
- filtração do sêmen antes de avaliar (para remover a fração gel que é espermicida);
- exames imediatos
- no sêmen de equino não fazemos turbilhonamento
- avaliamos motilidade e vigor apenas. 
- centrifugação do sêmen antes de diluir para concentrar os sptz
PROVA DIFERENÇAS DE BOVINO E EQUINO E ETAPAS! Quais são as etapas de congelação
Etapas:
- centrifugação do sêmen ( equino)
- diluição: diluente da escolha
- envase: palheta de 0,25 ou 0,5 ml
- refrigeração 5º C – 1 a 4 hrs bovino e 20 min no equino
- vapor de nitrogênio liquido
- armazenamento em botijão criogênico. 
Congelação do sêmen
- Armazenamento em N2 liquido;
- Preservação espermática por tempo indeterminado, desde que permaneça em contato com o N;
- parada total do metabolismo espermático;( o sptz fica dormindo quiescente, sem gasto de energia)
- viabilidade espermática reduzida em até 50%
1. Crioprotetores e diluentes:
- o diluidor ou meio diluente usado para expandir o volume e para evitar o choque térmico é composto por:
* fonte de energia (açúcar)
* tampão (para manter ph cte, semelhante ao plasma)
* antibiótico
* aminoácidos e antioxidantes
* crioprotetores 
 - intracelulares ( passam a memb espermática e adentram o sptz. Ex: glicerol ( mais usado), etilenoglicol, dmso, metilformamidas.
 - extracelulares: aumentam a osmoloridade externa do meio, desidratam o sptz para impedir a formação de cristais de gelo (osmose), são macromoléculas q não adentram o sptz, apenas tiram agua de dentro dele e levam para fora. Ex: sacarose e trelose.
Slide:
- Servem para proteger os esptz do choque térmico e osmótico que ocorrem durante o processo de refrigeração, congelação e descongelação.
- impedir que ocorra a formação de cristais de gelo intracelular, que afetam a estrutura físico química da célula, causando danos a membrana do espermatozoide. Se formar cristal de gelo dentro do sptz rompe a membrana espermática, e impede a fecundação do oocito.
- crioprotetores: glicerol, etilenoglicol, dmso, dimetilformamidas.
- métodos convencionais de congelação tem utilizado quantidades de 7% de glicerol para diluidores á base de gema de ovo = melhores resultados. 
- diluentes: tris-gema-frutose; botu –bov; botu – crio; triladyl...etc
Tudo isso serve para expandir o volume de ejaculado para encher as palhetas e proteger dos efeitos deletérios da congelação. 
CONTA PROVA
Ex: equino
Foda
Depois da conta
Etapas da congelação convencional ( sem a maquina de congelação): prova!
- centrifugação do sêmen ( equino)
- diluição: diluente da escolha
- envase: palheta de 0,25 ou 0,5 ml
- refrigeração 5º C – 1 a 4 hrs bovino e 20 min no equino
- vapor de nitrogênio liquido
- armazenamento em botijão criogênico. 
1. centrifugação:
Em sêmen de equino
Max sêmen
Red cushion
Botu sêmen ( a base de leite)
Diluição 1:1 ( meio e ejaculado)
Desprezar sobrenadante
2. diluição
Descongelar em banho maria 35-37graus
Botu bov
Botu crio
Diluição do sêmen
Bovinos: diluente com crioprotetor 30x 10*6 viaveis/palheta/0,5 ml 
Equinos: 
3. envase do sêmen
Palhetas de 0,25 ou 0,5 ml
Previamente identificadas ( qm envasa, nome do animal , raça registro, central, partida
Manual ou maquinas
Fechar a palheta com seladoras 
4. estabilização
Refrigeração a 5 graus celcius
Bovino 1 a 4 hrs
Equino 5 a 20 min
5. vapor de nitrogênio liquido 
Bovino e equino = 20 min
Ou se tiver maquina de congelação
Escolha da curva de acordo com a espécie.
6. descongelação
Avaliar se deu certo ou não
Analisar o sêmen pos descongelação
37 graus por 30 segundos para palheta de 0,5 para evitar a formação dos cristais durante o processo de descongelação.
Isopor + garrafa térmica; banho maria; descongeladores automáticos. 
7. analise pos descongelamento
Fluorescência
8. Avaliação pos descongelamento:
Analise de uma palheta por lote, por ex um ejaculado produziu 150 palhetas descongelar 1 delas.
Motilidade: maior que 30
Vigor: maior igual a 3
Numero de sptz por palheta: 10x10*6 moveis
Esptz normais: maior igual a 70
Defeitos maiores individuais: 5
Defeitos menores individuais: 10
Defeitos maiores totais: menor igual a 10%
Defeitos menores totais: 30
AULA 2 05/08/2019
 CONTINUAÇÃO SEMEN CONGELADO – 
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Manejo do botijão criogênico
- transportar em uma caixa de madeira
- pq nitrogênio sobre pressão explode
- manusear com cuidado
- o botijão tem 6 canecos, cada caneco identificado por cor e número na borda.
- o ideal é não expor todas as palhetas a temp ambiente durante o manuseio.
- remover com a pinça a palheta da raque já identificada. Não expor todas as raques e palhetas.
- jamais tirar todo o caneco pra fora, apenas ate o limite. 
- a exposição das palhetas leva a danos espermáticos.
- danos na descongelação, aquecimento lento, requistraliza, e lesa a membrana plasmática.
REFRIGERAÇÃO SÊMEN EQUINO
PROVA DIFERENÇA ENTRE CONGELAMENTO E REFRIGERAÇÃO DE SEMEN EQUINO!!!!!!!!!
Principio da refrigeração:
- 5ºC até 48 hrs
-15º C até 24 hrs
- meio diluente a base de leite SEM crioprotetores ( pq não vamos congelar vamos apenas refrigerar. Crioprotetores intracel: glicerol, dmso..)
- a refrigeração somente diminui o metabolismo espermático, na congelação para totalmente.
- o principio da refrigeração é a diminuição do metabolismo espermático.
- preservação eficiente das células;
- diminuição da dose inseminante
 Meio diluente:
- lipídeos( vindo do leite, para estabilizar a membrana)
- antibióticos ( para manter controle das bcterias pq o materiais não são estéreis)
- açucares : aux na manutenção da osmolaridade do meio semelhante ao plasma pra que o sptz não sofra danos molares c relação a concentração.
Etapas da refrigeração de sêmen equino:
- colheita com vagina artf ( garanhoes treinados manequim estático e garanhoes destreinados precisamos de uma femea no cio junto)
- avaliação do sêmen 
- calculo do volume de diluente = 50 a 100 x 10 elevado a 6 sptz/ml
- escolha do meio diluente de acordo com caract espermática
- uso de caixas de refrigeração = 15ºC ou 5ºC
- sêmen refrigerados são enviados para áreas próximas a central de refrigeração de sêmen, pois duram um período menor.
- ex de algns meios diluentes no mercado a base de leite: botusemen, botuturbo..
- envase não é em palhetas e sim em tubos/ frascos apropriados ( botula) NÃO ESCREVER PALHETA NA PROVA!
- acondicionar em caixas de transporte a 15ºC viabilidade por até 24 hrs
- após diluir e colocar no frasco, colocamos na caixa de transporte como botuflex, permite manter a temp entre 5 graus por um período máximo de 48 hrs. ( local mais distante). Ou a 15 graus por 24 hrs, locais mais próximos.
Considerações finais sobre criopreservação:
- VANTAGENS: maior facilidade de transporte e armazenamento do material genético de reprodutores por longo período de tempo;
- melhor aproveitamento genético de animais de grandes valores econômicos e zootécnicos;
- associada a outras biotecnicas como ia, iatf,te, piv ( prod in vitro)