Manual Semen equino

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PPRROOFF.. AASSSS.. DDRR.. MMAARRCCOO AANNTTOONNIIOO AALLVVAARREENNGGAA 
DDRR.. JJOOSSÉÉ AANNTTOONNIIOO DDEELLLL’’AAQQUUAA JJRR.. 
2007 
 2
ÍNDICE 
 
 
1. ANATOMIA DO SISTEMA GENITAL MASCULINO EQÜINO...................... 03 
 
2. ENDOCRINOLOGIA DA REPRODUÇÃO DO MACHO................................... 04 
 
3. PATOLOGIAS DO SISTEMA REPRODUTIVO DO GARANHÃO.................... 06 
3.1. PÊNIS E PREPÚCIO....................................................................................................... 06 
3.2. TESTÍCULOS................................................................................................................... 08 
3.3. EPIDÍDIMO, GLÂDULAS ANEXAS E CONDUTOS ESPERMÁTICOS................ 09 
 
4. EXAME ANDROLÓGICO........................................................................................ 11 
4.1. INTRODUÇÃO................................................................................................................. 11 
4.2. MATERIAL NECESSÁRIO............................................................................................ 12 
4.3. SEQUÊNCIA DO EXAME.............................................................................................. 12 
4.4. COLHEITA DO SÊMEN................................................................................................. 13 
4.5. ANÁLISE DO SÊMEN..................................................................................................... 13 
4.5.1. EXAMES IMEDIATOS..................................................................................................... 13 
4.5.2. EXAMES MEDIATOS...................................................................................................... 14 
4.6. MODELO DE LAUDO DE EXAME ANDROLÓGICO............................................. 22 
4.7. PADRÕES DE PATOLOGIAS ESPERMÁTICAS..................................................... 24 
 
5. METODOLOGIA BÁSICA PARA REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN.................. 25 
5.1. DILUIÇÃO....................................................................................................................... 25 
5.2. REFRIGERAÇÃO............................................................................................................ 25 
5.3. INSEMINAÇÃO............................................................................................................... 25 
 
6. CONGELAÇÃO DE SÊMEN................................................................................... 26 
6.1. INTRODUÇÃO............................................................................................................... 26 
6.2. MATERIAL NECESSÁRIO............................................................................... .......... 26 
6.3. SEQUÊNCIA PARA CONGELAÇÃO.......................................................................... 26 
6.4. LAUDO PARA SÊMEN CONGELADO........................................................... ........... 26 
6.5. PROVAS LABORATORIAIS DE INTEGRIDADE DA MEMBRANA 
PLASMÁTICA................................................................................................................. 30 
 
 
 
 
 
 
 
 3
 
1. ANATOMIA DO SISTEMA GENITAL MASCULINO 
GARANHÃO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 4
 
2. ENDOCRINOLOGIA DA REPRODUÇÃO DO 
MACHO 
 
Para que os testículos possam produzir espermatozóides de maneira contínua é 
necessário que o eixo hipotálamo – hipófise – gônadas, esteja em sincronia, de tal forma 
que os hormônios envolvidos para esta finalidade sejam liberados em quantidades 
adequadas. 
O hipotálamo é uma região cerebral localizada no diencéfalo, responsável pela 
liberação de GnRH. Este hormônio peptídico via sistema porta hiposisário vai até a 
hipófise, onde é reconhecido pelas células lá presentes desencadeando a secreção das 
gonadotrofinas (FSH e LH) que através corrente da sangüínea se dirigem até os testículos, 
resultando na produção de esteróides (estrógeno e testosterona), que participam da 
formação dos espermatozóides. 
Os hormônios envolvidos na reprodução são liberados através de retroalimentação 
positiva ou negativa, conforme a necessidade. Sua produção é estimulada ou inibida, de 
maneira a se manter concentrações adequadas para a plena produção espermática. 
Nos testículos há a presença de dois tipos de células. As células de Leydig que 
produzem testosterona pelo estímulo do LH, testosterona esta que é “ligada” por uma 
proteína ligadora de andrógenos (ABP) a luz das células de Sértoli (estimulada pelo FSH) 
produtoras da ABP e responsáveis pelo controle da espermatogênese. 
Conforme há um aumento das concentrações de testosterona circulante, ocorre 
uma retroalimentação negativa a nível do hipotálamo resultando numa diminuição dos 
pulsos de liberação de GnRH desencadeando uma menor liberação de gonadotrofina (LH) 
que diminui a produção de testosterona pelos testículos. Quando existe a necessidade de 
uma maior produção deste hormônio ocorre uma retroalimentação positiva e os níveis 
testosterona são novamente restabelecidos. 
Outro hormônio que participa dos processos de regulação da secreção de GnRH é 
a inibina produzida pelas células de Sértoli, ela promove uma maior ou menor liberação dos 
pulsos de GnRH que diminuem ou aumentam a secreção do FSH afetando a produção da 
ABP e da própria inibina. 
É de grande importância o conhecimento deste mecanismo para um bom 
diagnóstico de alterações reprodutivas que possam vir a afetar o macho prejudicando sua 
função reprodutiva e qualidade espermática. 
Segue abaixo o esquema do eixo hipotálamo - hipófise – gônadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 5
 
 
 
 
 
 6
 
 
 
 
3. PRINCIPAIS PATOLOGIAS DO SISTEMA 
REPRODUTIVO DO GARANHÃO 
 
3.1. PÊNIS E PREPÚCIO 
 
Fimose 
 
Incapacidade de expor o pênis comumente, podendo ser congênito ou adquirida, por 
traumas ou infecções. Tratamento: cirúrgico. 
 
 7
Parafimose 
 
Dificuldade de retração do pênis, principalmente devido a lesões de medula, lesões 
do músculo retrator do pênis, estenose. Tratamento: limpeza de lesões no pênis, compressas 
de água fria, aumento do diâmetro do óstio prepucial. 
 
 
 
Balanopostite 
 
Inflamação do pênis (balanite) e prepúcio (postite), freqüentemente ocorrem 
simultaneamente balanopostite. Agentes causadores: P. aeroginosa, Klebsiella 
pneumoniae, Streptococcus spp, Staphilococcus spp., B. abortus, Mycoplasma, 
Ureaplasma, Chlamydia, Protozoa , Virus, , Sendo mais comum em garanhões as lesões 
parasitárias causadas por Habronema ou mesmo miíases ou também por traumatismos. 
Tratamento: Retirada da causa, tratamento antibacteriano (infecções secundárias) com 
antibióticos sistêmicos de eliminação pela urina, ivermectina (infecções parasitárias), 
organofosforado (habronemose). 
 
Hematoma peniano 
 
Geralmente devido a ruptura da túnica albugínea, por traumas no momento da 
cópula, freqüentemente o hematoma ocorre no dorso do pênis, a identificação da patologia 
é dada pela inspeção e palpação. Tratamento: o tempo de recuperação esta diretamente 
envolvido com a evolução do quadro, hidroterapia (ducha 3 x ao dia), punção se necessário, 
colocar suspensório, anti-inflamatórios não esteróide, antibióticoterapia 
 
 
 
Edema prepucial 
 
Traumatismos, picada de insetos ou ofídios. Tratamento: baseado nos agentes 
causadores. 
 
 
Laceração prepucial 
 
Lesões traumáticas no prepúcio, dependendo da extensão e tempo de evolução 
sutura com plastia local almejando evitar alterações no óstio prepucial,se o tempo de 
evolução for maior que 24hs ferida já contaminada tratamento tópico (limpeza, agentes 
desinfetantes, ducha e repelentes), cicatrização por segunda intenção. 
 
 
 
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3.2. TESTÍCULOS 
 
Degeneração testicular 
 
Condição adquirida decorrente de fatores que afetam a homeostase testicular. 
Muitos deles envolvendo alterações da termorregulação testicular como piques febris , o 
processo de degeneração é classificado em graus I, II e III, quanto maior o grau maior a 
severidade da patologia. Podem também ser de origem medicamentosa ( Anabolizantes e 
corticoesteróides ). O prognóstico é bom a não ser nos casos onde já houve perda de massa 
testicular e formação de tecido conjuntivo. Tratamento: retirada da causa e tempo mínimo 
de 60 dias. 
 
Hipoplasia e aplasia testicular 
 
 A aplasia testicular é a ausência de um ou dos dois testículos é de rara incidência. 
Já a hipoplasia (diminuição do tamanho testicular) uni ou bilateral é mais comumente 
encontrada, ambas patologias são de origem genética causadas por um gene recessivo de 
penetrância incompleta. Tratamento: por se tratar de uma patologia de origem genética 
deve-se afastar o animal da reprodução. 
Para se diferenciar um quadro de hipoplasia testicular de uma degeneração 
necessita-se de uma anamnese bem detalhada. Nos casos de degeneração os testículos 
tinham tamanho normais, nas hipoplasias sempre foram pequenos e as alterações do 
ejaculado não se alteram como no caso da Degeneração Testicular, 
 
Orquite 
 
Freqüentemente causada por uma infecção ou traumatismo e associada a 
epididimite. 
Aguda: aparecimento súbito, presença de aumento de temperatura local, dor, 
aumento de volume, perda da função, animal se locomove pouco. Causas infecciosas mais 
comuns nos equinos são: P. aeroginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus spp, 
Staphilococcus spp., B. abortus, E. coli, Mycoplasma , Ureaplasma , Chlamydia, 
Protozoa, Virus. Tratamento: Ducha, antiinflamatório sistêmico (Sulfa +Trimetropin, 
Enrofloxacina). 
Crônica: aumento de volume, alteração da consistência e perda da sensibilidade 
dolorosa acentuada. 
 
 
 
Neoplasias testiculares 
 
Os tumores testiculares são raros, os mais comumente diagnosticados em 
garanhões são os seminomas (de células germinativas), sendo encontrados também os 
tumores das células intersticiais (células de Leydig) e os tumores das células de Sertoli. 
 9
Diagnóstico: Acomete idosos, superfície dura e irregular, lesões circulares a Ultra-
sonografia. Tratamento: retirada cirúrgica do testículo afetado. 
 
Hérnia inguino-escrotal 
 
Presença de conteúdo abdominal na bolsa escrotal, pode haver presença de alças 
sem prejuízo do trânsito intestinal, entretanto pode ocorrer o encarceramento das alças com 
parada do trânsito intestinal. Testículo aumentado e frio dor aguda e intensa, Tratamento: 
cirúrgico com retirada do testículo do lado acometido e fechamento do anel. 
 
Rotação testicular 
 
O testículo afetado mantém seu posicionamento horizontal em relação ao eixo 
cranio-caudal do animal, porém com giro de 180o observado pela alteração de localização 
da cauda do epidídimo em relação à parede abdominal. Tratamento: depende do grau de 
rotação, podendo dispensar intervenção desde que não haja interferência na qualidade 
seminal do garanhão ou exigir o reposicionamento do testículo com utilização de sedação 
ou até procedimento cirúrgico. 
 
Torção Testicular 
 
No testículo afetado, observa-se um giro no eixo longitudinal de modo que nos 
casos de torção de 90° a cauda do epidídimo estará em posição lateral ou medial e nos 
casos de torção de 180° a cauda do epidídimo estará em posição cranial. Dependendo do 
grau de torção pode haver comprometimento circulatório e, nesses casos, o tratamento é 
cirúrgico com a retirada do testículo afetado. 
 
3.3.EPIDÍDIMO, GLÂNDULAS ANEXAS E CONDUTOS 
ESPERMÁTICOS 
 
EPIDÍDIMO: 
 
a)Defeitos congênitos: 
• Aplasia Segmentar: todo ou parte do epidídimo, vasos deferentes ou vesículas 
seminais podem estar ausentes. 
• Hipoplasia : geralmente acompanha a hipoplasia testicular. 
 
b)Granuloma Espermático: obstruções congênitas dos ductos e se encontram na 
cabeça do epidídimo. Os granulomas podem alcançar tamanho suficiente para obstruir 
outros tubos eferentes. 
 
c)Espermatocele: Dilatação cística do condutodo epidídimo, com acúmulo de 
espermatozóides. Oclusão congênita ou adquirida. As espermatoceles progridem para 
 10
granulomas. O esperma condensado na espermatocele ou no granuloma tem uma cor 
amarela e de consistência caseosa como pus na infecção por Corinebacterium spp. 
 
d)Epididimite: Esta afecção às vezes coexiste com a orquite .A fibrose inflamatória 
produz na fase crônica endurecimento e aumento de volume do epidídimo, sobretudo do 
corpo. Pode haver aderência entre as capas parietal e visceral da túnica vaginal com 
obliteração parcial ou total. Epididimites: mais freqüente na cauda . 
Infecções do epidídimo pelos agentes=> Strep Beta Hemolítico,P. aeroginosa, Klebsiella 
pneumoniae, Streptococcus spp, Staphilococcus spp., B. abortus, Mycoplasma , 
Ureaplasma , Chlamydia, Protozoa , Virus. 
Sintomas: podem ser agudos ou crônicos como dor, temperatura elevada, sensibilidade, 
tumefação da cauda do epidídimo. Nódulos no conduto deferente facilmente perceptíveis à 
palpação=>obliteração=>azoospermia, 
quando os dois condutos estiverem afetados. 
Geralmente a infecção atinge=>testículos e as vesículas seminais. Diminui a libido pelo 
componente Dor ,podendo haver piospermia. 
Diagnóstico: exame bacteriológico, Ultra-sonografia alterações a palpação. 
Prognóstico: grave por agentes específicos , reservado devido obliteração dos condutos e 
aspermia. 
Tratamento: Específicos: sulfa+ trimetropin , Cloranfenicol . 
 
CONDUTOS ESPERMÁTICOS: 
 
a) Espermiostasia: Azoospermia de origem excretora devido obliteração total ou 
parcial da vias espermáticas, cuja etiologia pode ser: 
traumática, infecciosa e hereditária. 
Lesões: cabeça epidídimo bastante espessa e saliente , corpo é duro e com 
superfície irregular, cauda distendida e saliente na base do testículo. Ao corte estas 
estruturas apresentam material caseoso, seco, branco, aglomerado celular denso: numerosos 
espermatozóides alterados e ou anormais, restos células epiteliais e grandes células 
macrófagas. 
Patogenia: Com o estreitamento das vias , congênito ou adquirida, o sêmen não pode ser 
expulso e se acumula nos segmentos do epidídimo e depois nos tubos seminíferos inclusive 
provocando alteração na espermatogenese. Geralmente ocorre espermofagia . 
Sintomas: fertilidade baixa em 1 ou 2 anos , instalando-se a seguir a esterilidade. A libido é 
mantido , a ejaculação é mínima e constituida por secreções vesico uretrais 
Prognóstico: negativo. Os de origem hereditária devem ser descartados. Unilaterais de 
outras origens devem sofrer castração do testículo afetado. 
 
b) Fístula Uretral: Traumas na porção do pênis=>hemospermia grave. 
Diagnóstico: Exame de sêmen e Endoscopia. 
Tratamento: Cauterização, Cirurgia e Tratamento com antibióticos e sulfas. 
 
 
 
 11
GLÂNDULAS ANEXAS: 
 
a) Vesiculite: Inflamação aguda e crônica. 
Causa de perda econômica prematura em touros: redução da qualidade do sêmen e da 
motilidade pós-descongelação. 
Idade pode ser fator predisponente . 
Causa: Bactérias, Vírus, Chlamydia, Fungos e Protozoários., Staphilococcus spp., 
Streptococcus spp., Escherichia coli, Leptospira interrogans , Proteus mirabilis , Clamydia 
psittaci, Candida guilliermondii ,Pseudomonas aeroginosa, Klebsiella pneumoniae, 
Ureaplasma. 
Em geral não apresenta dor (micção, defecação e ejaculação). Sêmen: piospermia, sem 
alteração da motilidade imediata, havendo diminuição da viabilidade após algum tempo. 
Palpação: difícil diagnósticode vesiculite, abscedação: rara, Ultrasom: dificil diagnóstico 
pelas características da vesícula seminal => antes da cobertura repleta (anecóica), após 
ejaculação => vazia. 
Tratamento clínico: antibioticoterapia sistêmica após antibiograma, muitos antibióticos não 
conseguem penetrar na luz da glândula em concentração terapêutica. Antibióticos precisam 
ter alta solubilidade em lipídeos, baixo peso molecular, afinidade por proteínas plasmáticas, 
pKa alto, pH alto (Sulfa +Trimetropin, Enrofloxacina, Cloranfenicol). 
Endoscopia: lavagem (5x) da glândula com solução salina e antibióticos (ticarcilina sódica 
ou ampicilina sódica). 
Remoção Cirúrgica: não é usada rotineiramente, podendo apresentar complicações pós-
operatórias como: hemorragias, infecções e lesões nos nervos pélvicos (ligados à ejaculação). 
 
 
 
4. EXAME ANDROLÓGICO 
 
4.1. INTRODUÇÃO 
 
O exame andrológico reflete as atuais condições reprodutivas de um macho. O 
potencial reprodutivo do animal deve ser verificado sempre quando este for para 
exposições, iniciar uma estação de monta, diagnostico de sub ou infertilidade, ocorrência da 
puberdade, destinado a criopreservação de sêmen, etc. 
A avaliação destina-se a observação das condições semiológicas, bem como as 
condições de sanidade, alterações genéticas, saúde geral, deficiências na cópula por 
alterações locomotoras ou alterações do sistema genital (impotência coeundi) e problemas 
espermáticos (impotência generandi). 
O laudo de um exame andrológico nunca é definitivo (para o resto da vida 
reprodutiva), sempre deve-se levar em consideração que o animal logo após o exame pode 
vir a sofrer de alguma patologia que leve-o a depreciações em sua qualidade espermática, 
por isso o laudo não deve ser emitido com uma validade superior a 60 dias (tempo em que 
ocorre a espermatogênese mais o trânsito epididimário). 
 
 
 12
4.2. MATERIAL NECESSÁRIO 
 
A) ficha para anotações + caneta 
B) paquímetro 
C) fita métrica 
D) luva de palpação 
E) vagina artificial 
F) copo coletor 
G) microscópio 
H) mesa aquecedora (37°C) 
I) lâminas e lamínulas 
J) câmara de Neubauer 
K) vidraria (proveta de 100ml, tubo de ensaio, becker) 
L) pipeta de Sahli ou micropipeta de 20µl ou palheta de 0,5ml 
M) corantes para patologia espermática 
 
 
4.3. SEQÜÊNCIA DO EXAME 
 
A) Identificação do animal: 
• Nome, registro, idade, raça 
 
B) Identificação do proprietário: 
• Nome, endereço, telefone, nome da propriedade 
 
C) Exame do animal: 
 
• Anamnese (animal estabulado ou a campo, quanto tempo se cobrir, doenças 
anteriores, medicamentos aplicados) 
• Exame clínico geral (verificação dos parâmetros respiratório, cardíaco, digestivo, 
aprumos, sensibilidade na coluna) 
• Exame clínico específico do aparelho reprodutivo (padrões normais) 
 
Prepúcio – sem nenhuma alteração, edema, lesões etc. 
 
Pênis – sem nenhuma alteração, escaras, edema, hematoma, forma. 
 
Glândulas anexas – Palpação retal (somente deverá ser realizada a palpação retal se ficar 
constatado quadro de piospermia ou hemospermia). 
 
Testículos e Bolsa escrotal – Observa-se bem o escroto, se não há feridas, bernes, edema, 
varicocele (dilatações vasculares), então palpa-se os testículos que no eqüino têm a 
forma ovóide e posicionamento horizontal em relação ao animal. Devem ter mobilidade 
dentro da bolsa, ausência de dor a palpação, simetria, consistência fibroelástica. Devem 
ser feitas mensurações individuais de cada testículo, que demonstram com maior 
 13
exatidão a verdadeira massa testicular, devendo ser realizadas com o auxílio de um 
paquímetro. Comprimento 5 a 12cm (do polo proximal até o polo distal do testículo), 
largura 4 a 8 cm (medida latero-madial, na porção média do testículo), altura 4 a 8 cm 
(medida infero-superior, na porção média do testículo). 
 
 Epidídimos – Devem ser palpados verificando sua presença, sensibilidade, forma e 
localização (cabeça acoplada ao polo cranial, corpo localizado na face medial dos 
testículos e cauda geralmente bem definida na região caudal dos testículos, apresentado 
consistência fibro-eslástica de tamanho variando de 1x1 a 3x3, conforme idade do 
animal e freqüência de ejaculados). 
 
 
4.4. COLHEITA DO SÊMEN 
 
A colheita do sêmen é efetuada por auxílio de vagina artificial, onde o animal deve 
ter um condicionamento prévio para que este monte em uma égua em cio ou em manequim. 
 
• Colheita com vagina artificial: a vagina artificial modelo Botucatu é composta de um 
tubo rígido, uma mucosa de látex, um copo coletor protegido de luz e alterações de 
temperatura. (Anexo1). A vagina deve preenchida com água quente, para permanecer 
com temperatura de 42-45°C para colheita. O animal condicionado saltando sobre o 
manequim, deve ter o pênis desviado e introduzido na vagina artificial. A constatação 
da ejaculação pode ser verificada com as seguintes características: 
• Movimento da cauda para cima e para baixo/ contração dos músculos perianais/ 
sapatear/ fluxo pulsátil uretral da ejaculação. 
 
 
4.5. ANÁLISE DO SÊMEN 
 
4.5.1. EXAMES IMEDIATOS 
 
Logo após a colheita o sêmen deve ser analisado segundo suas características 
macro e microscópicas. 
 
• Volume = Podendo variar de 20 á 100ml 
• Cor = desde branco acizentado até um branco leitoso. 
• Densidade = Varia do tipo aquoso até leitoso – diretamente relacionado com a 
concentração espermática 
• Odor = “Suis-genesis” 
• Motilidade espermática = Se faz uma pequena gota de sêmen entre lâmina e 
lamínula aquecidas a 37°C e realiza-se a visualização em microscópio com 
aumento de 200 vezes. A motilidade espermática é analisada segundo uma 
escala de porcentagem variando de 0 a 100% (Motilidade Total=MT, 
porcentagem de células móveis). Caso a amostra esteja muito concentrada 
 14
deve-se realizar uma diluição em meio diluidor (por ex. Kenney), esta diluição 
pode ser 1:1 ( Motilidade ideal ≥ 70%) 
• Vigor espermático = Concomitantemente com a motilidade espermática se 
avalia o vigor espermático na escala de 0 a 5 (velocidade com que o 
espermatozóide se desloca, quanto maior a velocidade maior o valor). 
(Vigor ideal ≥ 3) 
 
4.5.2. EXAMES MEDIATOS 
 
São realizados no momento da colheita, entretanto podem ser analisados 
posteriormente. 
 
• Concentração espermática = Retira-se do volume ejaculado uma 
alíquota de 20µl utilizando-se uma pipeta de Sahli ou micropipeta e coloca-se 
em um tubo de ensaio contendo 1ml de água destilada aquecida ou 1 gota de 
sêmen em 19 gotas de água destilada. Após boa homogeneização, monta-se 
uma Câmara de Neubauer (ver esquemas), preenchendo seus 2 retículos, 
conta-se todos os espermatozóides presentes em 5 quadrados de cada retículo 
(vide exemplo), sendo que a variação entre cada uma dos lados da câmara 
(retículos) não pode ser mais que 10% (se for maior repete-se a operação). 
Após a operação calcula-se a média aritmética, o valor encontrado é 
representado pela letra (n). 
 
 
 
 15
 
 
 
A concentração espermática média para um garanhão adulto colhido na vagina 
artificial é de 0,1-0,2x109 espermatozóides por ml. (100 a 200 milhões/ml) 
 
Ex:. De um dos lados da Câmara de Neubauer=Retículo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Neste exemplo temos 12 espermatozóides azuis que deverão ser contados para 
efeito de calculo, os mesmos localizam-se nos quadrados cinzas e sobre as linhas azuis, 
relativos ao cinco quadrados representados, levando-se em consideração o posicionamento 
da cabeça. Espermatozóides que apresentam apenas a cauda dentro do quadrado não são 
contados. 
4
3
2
=
 16
Após a contagem das células espermáticas (n),utilizamos a seguinte fórmula para 
cálculo da concentração espermática. 
 
 Concentração espermática = espermatozóides/mm3n = Número médio de células contadas nos dois lados da Câmara de Neubauer 
 
 = Altura entre a lamínula e a Câmara de Neubauer em mm 
 
5 x = 5 quadrados contados X a área do quadrado mm2 
 
 = Diluição realizada (1 gota de sêmen em 19 gotas de água dest. ou 20µl de 
sêmen em 1ml de água dest.) 
 
O resultado encontrado é referente a concentração de espermatozóides no 
ejaculado por mm3, para converter esse dado para ml, basta multiplicá-lo por 103 (1000). 
 
Ex:. Foram contadas 100 células de um lado câmara (em cinco quadrados) e 104 
células do outro lado (variação entre os lados menor que 10%), tira-se a média aritmética, o 
n = 102 (espermatozóides), colocando-se na fórmula, adotando a diluição de 1/20, temos: 
 
 
Concentração espermática = , resolvendo a equação 
 
 
 
 
 
Concentração espermática = 102 x 103 espermatozóides por mm3, convertendo 
para ml (x103), a concentração espermática desse touro foi de 102 x 106 espermatozóides 
por ml. 
“Dica” Sempre que a diluição efetuada for de 1/20, basta multiplicar o n (número 
médio contado nos retículos) por milhão (106 )e tem-se direto a concentração por ml. No 
exemplo passado n = (102) multiplicado por 106, tem-se 102 x 106 espermatozóides por 
ml. (102 milhões/ml) 
 
 
 
• Patologia espermática = Coloca-se uma gota de sêmen em uma lâmina e 
realiza-se um esfregaço, fixa-se o esfregaço em metanol e cora-se a lâmina 
com corantes Ex:. Karras modificado por Papa et al (1998) (1 min Rosa 
Bengala lava-se a lâmina em água corrente fraca, então põe-se 1 min no 
Tanino lava-se novamente e 30 segundos no Azul Vitória, lava-se a lâmina, 
1 
10 
x 
5 
25 
x 1 
20 ou 50 
n
1 
10 
1 
20 ou 50 
1 
10
x 
5 
25 
x 1 
20 
102
1 
25 
1 
25 
 17
deixa secar, observa-se em microscopia óptica aumento de 1000x). Conta-se 
200 células, percorrendo a lâmina de forma homogênea como mostra o 
esquema abaixo e classificando os espermatozóides conforme suas patologias, 
obtendo no final as porcentagens de espermatozóides normais e de cada 
patologia. 
 
 Esquema de como se deve percorrer a lâmina para leitura de patologia 
espermática. 
 
 
 
 
 
 
 
 
As patologias espermáticas são divididas em Defeitos Maiores, relacionados com a 
infertilidade e Defeitos Menores não interferem diretamente sobre a fertilidade. 
 
• Defeitos Maiores 
 
1. Acrossomo: 
2. Patologia da cabeça: 
Subdesenvolvida .............................................................. 
Isolada patológica ............................................................ 
Estreita na base................................................................ 
Piriforme.......................................................................... 
Pequena anormal ............................................................. 
Contorno anormal ............................................................ 
“Pouch formation” ........................................................... 
3. Gota proximal: 
4. Formas teratológicas: 
5. Defeito de peça intermediária: 
(Desfibrilação, fratura, edema, pseudogota) ........................ 
6. Patologia da cauda: 
 Fortemente dobrada ou enrolada......................................... 
 Dobrada com gota.............................................................. 
 Enrolada na cabeça............................................................ 
7. Formas duplas: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 18
• Defeito Menores 
 
1. Patologia da cabeça: 
 Delgada ............................................................................ 
 Gigante, curta, larga, peq. normal.................................... 
 Isolada normal................................................................... 
2. Patologia da cauda e implantação: 
 Retro e abaxial, oblíquo..................................................... 
 Dobrada ou enrolada......................................................... 
3. Gota Citop. Distal: 
 
 
Esquema das patologias espermáticas encontradas: 
 
 
 
A = Patologias de Acrossomo 
 
 
B = Patologias de Cabeça 
 
 
 
C = Patologias de Inserção de 
 Cauda 
 
 
 
 
D = Patologias de Peça 
 Intermediária 
 
 
 
E = Patologias de Cauda 
 
 
 
 
 
F = Formas Teratológicas 
 
 
 
 
 
 
 19
Descrição das patologias do quadro anterior: 
 
A) = Acrossomo 
A1 = normal 
A2 = grande 
A3 = com grânulos 
A4 = oblíquo 
A5 = pequeno 
A6a = sptz s/ acrossomo 
A6b = solto 
A7a e b = deformações 
B) = Cabeça 
B1a, b e c = normal 
B2 = estreita 
B3 = piriforme 
B4 = lanciforme 
B5 = raquetiforme 
B6 = globuliforme 
B7 = gigante 
B8 = anã 
C) = Inserção 
C1 = normal 
C2 = reta 
C3 = invertida 
C4 = estreita 
C5 = larga 
C6 = simétrica 
C7 = excêntrica (abaxial) 
C8 = paraxial 
C9 = retroaxial 
C10 = rutura do colo 
C11 = ausência genética 
da cabeça 
D) = Peça Intermediária (PI) 
D1 = normal 
D2 = curta 
D3 = comprida 
D4 = estreita 
D5 = disforme 
D6a e b = ruturada 
D7 = repregueada 
D8 = tipo axial 
D9a e b = tipo fibrilar 
E) = Cauda 
E1 = gota proximal 
E2 = gota distal 
E3 = gota presa na cauda 
E4 = gota presa na PI 
E5 = fortemente dobrada 
E6 = espiraliforme 
E7 = enrolada cabeça 
E8 = rudimentar 
F) = formas duplas 
Elementos figurados do sêmen 
(Modificado de Mies Filho,1982). 
 
a) espermatozóides normais 
b) gotas livres 
c) anormalidades primárias 
d a h) anormalidades secundárias 
d) cabeças isoladas 
e) gotas proximais 
f) gotas distais 
g) cauda dobrada com gota 
h) acrossomas livres 
i) formações ciliares (medusas) 
k) células epiteliais de descamação 
l) células linhagem espermática = 
casos de degeneração testicular 
m) hemácias 
n) piócitos 
 
• Principais causas das patologias espermáticas 
 
A) Cabeça 
Acrossomo = As alterações no acrossomo como: forma irregular, enrugado ou 
destacado, podem ser devido ao choque térmico, manipulação indevida ou senilidade. 
 20
A presença de um grânulo no acrossomo, o denominado Knobbed sperm, pode 
ser origem hereditária ou relacionado a degeneração testicular e está ligado diretamente 
com a infertilidade do animal quando encontrado em grande quantidade. 
O Pouch formation, (diadema defect) caracterizado pela presença de vacúolos na 
região equatorial da cabeça não mais no acrossomo, formando um colar na cabeça do 
espermatozóide são invaginações da membrana nuclear devido a rarefação da cromatina, 
apresentam relação direta com a presença de hipoplasia ou degeneração testicular. 
Alterações na forma da cabeça como: estreita na base, piriforme, lanciforme, 
anã, são patologias de origem testicular podendo ser oriundas de hipoplasia ou degeneração 
testicular. Sendo mais comum em cavalos as cabeças sub-desenvolvidas nos casos de 
Degeneração Testicular, 
 
B) Colo 
Defeitos de inserção como: Abaxial, paraxial e retroaxial, são devido a presença 
de “goteira”, falha na formação do espermatozóide. A localização da “goteira” definirá o 
tipo da inserção. A inserção abaxial (mais encontrada nos eqüinos e considerada como 
normal para cavalos), pode não afetar a fertilidade, pois o espermatozóide tende a se 
adaptar com o movimento e conseguir um deslocamento compatível com a fertilização. As 
inserções paraxial e retroaxial apresentam uma maior relação com a infertilidade pois 
impossibilitam o deslocamento necessário do espermatozóide para a fecundação. 
Gotas citoplasmáticas proximais ou distais são restos de citoplasma que são o 
nutriente do espermatozóide durante o trânsito epididimário. O espermatozóide durante sua 
maturação pelo epidídimo permanece três dias na cabeça do epidídimo ainda com a 
presença da gota,posteriormente fica um dia no corpo e finalmente seis dias na cauda onde 
deve se desprender desta gota; teorias afirmam que existem enzimas ativadoras no 
epidídimo, que dissolveriam a gota. A presença de gotas em grades quantidades podem ser 
devido: 1) animal imaturo, que começou a produção a pouco tempo, nestes casos colheitas 
seriadas resolvem, um animal que está há muito tempo em descanso sexual também pode 
vir a apresentar gotas, devido a um diminuição no trânsito epididimário, da mesma forma 
colheitas periódicas levam ao desaparecimento da patologia; 2) disfunção epididimária 
devido a alterações de temperatura (deficiência na termorregulação) levando a um 
desequilíbrio iônico Na+ e K+, causando alterações no ciclo de maturação; 3) degeneração 
testicular, levando a disfunção epididimária; 4) hipoplasia testicular, por se tratar de uma 
patologia hereditária a gota sempre irá aparecer no ejaculado. 
 
C) Peça Intermediária 
Corkscrew defect (defeito em saca rolha), devido a degeneração do plasmalema, 
afetando a região das mitocôndrias que fica com aspecto rugoso, podendo dificultar a saída 
da gota e mais grave afetando a conformação das microfibrilas que podem se soltar 
patologia vista em animais idosos. 
Cabeça destacada (isolada), “goteira” rasa quando se forma podendo ser 
decorrente de problema de inserção paraxial ou de origem genética. 
Forma duplas da PI e/ou cauda, origem hereditária. 
 
 
 
 21
D) Cauda 
Enrolada, fortemente enrolada, dobrada e fortemente dobrada, são devidas a 
uma diminuição no número de microfibrilas 3 ou 4 (Dag defect) neste caso sendo de caráter 
hereditário, estes animais apresentam elevado nível de Zn no sêmen. Outra causa da 
apresentação de defeitos de cauda no espermatozóides pode ser devido a choque osmótico 
ou térmico e disfunções de epidídimo. 
E) Outras anormalidades 
Aglutinação de cabeça (head aglutination), os espermatozóides chegam em 
blocos ao epidídimo, e neste local há presença de antiaglutininas que promovem a 
separação das células, uma disfunção epididimária pode levar ao desenvolvimento desta 
patologia. 
Espermatozóides subdesenvolvidos, animais imaturos ou processos interferindo 
na espermatogênese (de animais maduros) havendo a liberação no ejaculado de células 
primordiais espermatócitos, espermatogônias, espermátides. 
Medusa, restos ciliares do epidídimo por disfunção epididimária, geralmente nos 
casos de recuperação de degeneração testicular. 
Pseudogota, semelhante a gota citoplasmática, porém situada na porção média da 
PI, e apresentando tamanho maior que a gota tradicional devido ao envolvimento de 1 ou 2 
camadas de mitocôndrias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 22
 
 
4.6. MODELO DO LAUDO DE EXAME ANDROLÓGICO 
 
 
 
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - 
BOTUCATU 
Dep. de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária 
18618 - 000 - Botucatu/ SP - Rubião Junior - Fone/FAX (14)6802 6249/6326 
 
 CERTIFICADO ANDROLÓGICO 
A.) IDENTIFICAÇÃO DO REPRODUTOR 
Nome: Raça: Idade: Registro: 
Proprietário: Propriedade: 
Endereço: 
B.) EXAME CLÍNICO 
1. Histórico: 
2. Geral: 
3. Sistema Genital - Prepúcio: Pênis: 
Testículos: Esquerdo Direito 
Dimensões (comp., larg. alt.)cm 
Simetria 
Forma 
Posição 
Consistência 
Sensibilidade Dolorosa 
Mobilidade 
Epidídimo 
Genitália interna: 
4. Comportamento sexual (libido): 
C.) ESPERMIOGRAMA 
I. Método de coleta: Vagina Artificial Data: Horário: 
II. Características do ejaculado: 
1. Volume ejaculado : ml 5. Motilidade : 
2. Cor : 6. Vigor (0-5) : 
3. Aspecto : 7. Concentr. (x106/mm3) : 
4. Turbilhonamento : - 8. Total esperm. (x109) : 
III. Características morfológicas (anexo I): 
a. Defeitos maiores: % b. Defeitos menores: % Total: % 
IV. Outros elementos: 
 Não detectados 
(1. Medusa, 2. Células primordiais, 3. Células gigantes, 4. Leucócitos, 5. Hemácias, 6. 
Células epiteliais, 7. Cristais de urina, 8. Bactérias.) 
 
D.) OBSERVAÇÃO: 
E.) CONCLUSÃO: 
 ----------------------------------- 
fmvz-unesp
 
 23
Local, ........... Data, .../..../...... Méd. Veterinário Responsável 
 CRMV 
 24
 
 
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU 
Dep. de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária 
18618 - 000 - Botucatu/SP - Rubião Junior - Fone/FAX (014) 821.2121 - Ramal 2249/2326 
 
 
CERTIFICADO DE EXAME ANDROLÓGICO - (ANEXO I) 
 
NOME: REGISTRO: 
 
I.) MORFOLOGIA ESPERMÁTICA (KARRAS Mod. PAPA et alii,1987) 
 
 
A.- TOTAL DE DEFEITOS MAIORES: % 
 
1. Patologia da cabeça: 4. Formas teratológicas : 
 Subdesenvolvida : 
 Isolada patológica : 5. Defeito de peça intermediária (Desfibrilação, 
 Estreita na base : fratura, edema, pseudogota) : 
 Piriforme : 
 Pequena anormal : 6. Patologia da cauda : 
 Contorno anormal : Fortemente dobrada ou enrolada: 
 “Pouch formation” : Dobrada com gota : 
2. Acrossomo : Enrolada na cabeça : 
3. Gota proximal : 7. Formas duplas : 
 
 
B.-TOTAL DOS DEFEITOS MENORES: % 
 
 
1. Patologia da cabeça: 2. Patologia da cauda e implantação: 
 Delgada : Retro e abaxial, oblíquo : 
 Gigante, curta, larga, peq. anormal: Dobrada ou enrolada : 
 Isolada normal : 3. Gota Citop. Distal : 
 
C - TOTAL DE FORMAS ANORMAIS: % 
II.) OUTROS ELEMENTOS: 
 
1. Medusa : 5. Hemácias : 
2.Células primordiais: 6. Células epiteliais: 
3. Células gigantes : 7. Cristais : 
4. Leucócitos : 8. Bactérias : 
 
III.) EXAMES COMPLEMENTARES (Termoresistência, espermocultura, outros): 
 
 ----------------------------------- 
Local, ........... Data, .../..../...... Med. Veterinário Responsável 
 CRMV 
fmvz-unesp
 25
4.7. PADRÕES DE PATOLOGIAS ESPERMÁTICAS 
 
 
Médias de características morfológicas de sêmen de garanhões descritos em vários 
estudos 
Características Dowsett and Pattle Pickett et al Jasko et al 
Espermatozóides 
normais (%) 
Não relatado 51 ( 15 ) 52.5 (20.1 ) 
Cabeças anornais 7.1 (5.9 ) 9 ( 8 ) 6.4 ( 6.9 ) 
Cabeças destacadas 2.6 ( 4.8 ) 5 ( 6 ) 1.3 ( 1.7 ) 
Gota citoplasmatica 
proximal 
13.1 ( 10.3 ) 3 ( 5 ) 15.5 ( 11 ) 
Gota citoplasmatica 
distal 
8.1 ( 11.7 ) 3 ( 4 ) 13.5 ( 11.4 ) 
Peça intermediária 
anormal 
Não relatado 11 (11) 7.4 ( 7.1 ) 
Cauda anormal 10.9 ( 9.2 ) 20 (13 ) 2.4 ( 3.9 ) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 26
5. METODOLOGIA BÁSICA PARA REFRIGERAÇÃO DE 
SÊMEN 
 
 
5.1 Diluição: 
 
• Diluir sêmen com meio á base de Leite (Botu-Sêmen), contendo como antibióticos de 
preferência uma associação de Amikacina e Penicilina cristalina, podendo ser utilizada 
a gentamicina. 
• Diluir no mínimo o sêmen fresco com 2 partes demeio (Ideal 3:1 Meio: Sêmen). 
• Utilizar dose inseminante com 1 bilhão de espermatozóides viáveis. 
• Não diluir a uma concentração entre 20 e 50 de milhões de espermatozóides por ml.. 
• Envasar em recipiente plástico com a menor quantidade de ar possível. 
• OBS: Para garanhões que não refrigeram bem a utilização do diluente Botu-Turbo é 
uma opção adequada, devendo com este diluente o transporte ser realizado a 5°C. 
 
 
5.2 Refrigeração: 
 
• Colocar em recipiente adequado. Lembrando-se que quando do resfriamento até 5°C 
deve-se utilizar Containers adequados como o Equitainer ou seu similar nacional 
Botutainer (Anexo2),seguindo regras indicadas pelo fabricante para montar o sistema. 
Este sistema permite manter a temperatura de 5°C por um período máximo de 48 horas 
• Para resfriamento entre 15 e 20°C podemos utilizar a Botu-Box (Anexo3). 
• Manter fonte de gelo biológica congelada por pelo menos 24 horas em Freezer (-10°C). 
• Não manter o sêmen por um período de tempo superior a 24 horas quando refrigerado a 
15°C. 
 
5.3 Inseminação: 
 
• De preferência inseminar antes de 24 horas de refrigeração, queda de fertilidade é 
esperada quando da refrigeração por mais que 24 hs. 
• Inseminar a cada 24 horas. 
• Aplicar HCG ou GnRH(deslorelina) para induzir ovulação e garantir só uma IA. 
• Não é necessário aquecer em banho-maria . Insemine o sêmen resfriado utilizando o 
Botu-IA® (Anexo4). 
• Para a avaliação é necessário aquecer por pelo menos 5 minutos a 37°C 
 
 
 
 
 
 
 
 
 27
 CONGELAÇÃO DE SÊMEN 
 
INTRODUÇÃO 
 
A congelação do sêmen trouxe vários benefícios ao sistema de produção dos 
eqüinos, facilitando o armazenamento por período indeterminado e a comercialização deste 
material genético, controlando doenças sexualmente transmissíveis e principalmente 
acelerando o ganho genético. 
Nos eqüinos esta técnica vem sendo aperfeiçoada, e já apresenta resultados 
satisfatórios de fertilidade com novos diluentes e crioprotetores. 
 
 
MATERIAL NECESSÁRIO 
 
A) vagina artificial 
B) microscópio 
C) mesa aquecedora 
D) vidraria (proveta de 100ml, tubo de ensaio, becker) 
E) lâmina e lamínula 
F) palhetas de 0,25 ou 0,5ml (identificadas) 
G) Câmara de Neubauer 
H) pipeta de Sahli ou micropipeta de 20µl 
I) álcool polivinílico ou bolinhas para lacrar palhetas 
J) diluente para congelação (BOTU-CRIO®) 
K) uma geladeira (no local) a 5°C para estabilização 
L) termômetro 
M) caixa de isopor 37 a 45L (45cm Comprimento x 36cm Largurax 38cm Altura) 
N) grade para as palhetas (local onde são colocadas as palhetas p/ estabilização) 
O) suporte para manter a grade de palhetas acima do nível do N2 
P) botijão de N2 (no local) 
Q) Banho-Maria 
 
SEQUÊNCIA PARA CONGELAÇÃO 
 
a) Preparo do laboratório 
 
Antes de iniciar a colheita do sêmen para congelação, preparar os materiais no 
laboratório ou sala onde será realizada a congelação. Aferir a geladeira se está entre 4 e 
6°C, podendo também utilizar o sistema (Botutainer para refrigeração). Descongelar os 
diluentes e colocá-los no banho Maria a 37°C, separar um tubo de ensaio com 19 gotas de 
água destilada para a concentração espermática. 
 
 
 
 28
 
b) Colheita do Semên 
 
O sêmen pode ser colhido com a vagina artificial, modelo Botucatu. 
- Análise dos parâmetros macro e microscópicos do sêmen. 
 
- Cálculo do número de palhetas a serem congeladas: Cada palheta deve conter 100 
milhões de espermatozóides viáveis. Desta forma para o cálculo do número de 
palhetas basta dividir por 100 o número total de espermatozóides viáveis do 
ejaculado. 
 
- Ex: Um ejaculado de 50 mL com motilidade total de 80% e concentração 
espermática de 100 milhões por mL. Total de espermatozóides viáveis neste 
ejaculado: 50 mL x 100 milhões x 80% = 4 bilhões de espermatozóides viáveis 
dividido por 100 milhões = 40 palhetas 
 
 
- Centrifugação: deve ser feita para eliminar o plasma seminal, com sêmen diluído 
na proporção de 1:1 com Botu-Semen (Biotech–Botucatu) 600xg ou 2200 rpm por 
10 minutos (Ex. centrífuga da Fanem/Baby/n°2 por 10 minutos). 
 
- Cálculo do volume final de ressuspensão: cada palheta contém 0,5mL, ou seja, 
multiplicar o número de palhetas por 0,5 que é o volume final da suspensão com o 
diluente de congelação. 
 
- Ressuspensão: Após a parada da centrífuga, o sobrenadante de cada frasco deve ser 
imediatamente desprezado e os “pellets” devem ser ressuspendidos no diluidor de 
congelamento Botu-Crio®, previamente aquecido e calculado. 
 
- Envasamento: Deve ser feito em palhetas de 0,5mL. 
 
- Estabilização: 20 minutos em refrigerador a 5oC. 
 
- Resfriamento rápido: 15 a 20 minutos em vapor de nitrogênio, mantendo entre 3 e 
6 cm acima do nível do nitrogênio líquido, em caixa isopor térmica tampada (37 a 
45 litros). 
 
- Congelação: imersão das doses no nitrogênio líquido. 
 
- Descongelação: Sempre retira-se uma palheta da partida congelada para avaliação 
do procedimento. Esta palheta pode ser descongelada em Banho-maria a 46°C por 
20 segundos e em seguida imergir a 37ºC. Aguardar 10 minutos pós descongelação 
a temperatura de 37ºC para avaliação definitiva. 
 
- Análise do sêmen pós-descongelação: Retirando-se a palheta do Banho-maria, 
deve-se secá-la bem com uma pano ou toalha de papel, para evitar que alguma gota 
 29
de água entre em contato com o sêmen, posiciona-se a bolha para ponta da palheta e 
corta-se com uma tesoura na porção onde se localiza o lacre (álcool polivinílico). 
Verifica-se a motilidade, vigor, a concentração e faz-se um esfregaço, para análise 
da patologia espermática ou utiliza-se uma preparação com 40µl de solução de 
trabalho para fluorescência com 10µl de sêmen. Caso não possua microscópio de 
epi-fluorescência, a amostra congelada poderá ser enviada a faculdade Para análise. 
 
 
Recomenda-se os seguintes requisitos para que uma dose congelada esteja 
apta inseminação artificial. 
 
Motilidade total ≥ 50% Vigor ≥ 3 
Porcentagem de patologia espermática aceita: 
Defeitos menores ≤ 20% Defeitos maiores ≤ 20% 
Defeitos Totais ≤ 40% 
 
 
 
Cuidados na Inseminação 
 
Programe o momento da ovulação com HCG e ou GnRH(deslorelina). 
 
Inseminar entre 12 horas antes até 6 horas após a ovulação. 
 
Não diluir a dose inseminante,pois isto pode ser altamente lesivo e provocar 
dano osmótico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 30
LAUDO UTILIZADO PARA SÊMEN CONGELADO 
 
 
 FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU 
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária 
18618 - 000 - Botucatu/SP - Rubião Junior - Fone/FAX (014) 6802-6.249//6326 
 
LAUDO DE ANÁLISE FISCAL DO SÊMEN CONGELADO DE EQUINO 
 
I.-) IDENTIFICAÇÃO 
 ESTABELECIMENTO : 
 PROPRIETÁRIO: 
 NOME DO REPRODUTOR: RAÇA: EMBALAGEM: 
 PARTIDA: Data: 
II.-) EXAME FÍSICO PÓS-DESCONGELAÇÃO: 
 MÉTODO DE DESCONGELAÇÃO: 
VOLUME DA DOSE: 
TOTAL DE ESPERMATOZÓIDES DA DOSE: 
ANÁLISE SUBJETIVA DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA : 
 VIGOR (0-5): 
 ANÁLISE COMPUTADORIZADA ( HTM-IVOS 10) 
 ANÁLISE DA INTEGRIDADE DA MEMBRANA PELA FLUORESCÊNCIA: 
V.-) OBSERVAÇÃO: 
VI.-) CONCLUSÕES: 
Local, ...............Data............... Med. Veterinário Responsável 
 CRMV 
 
 
 
 
 
 
fmvz-unesp 
 31
6.5 PROVAS LABORATORIAIS DE INTEGRIDADE DA 
MEMBRANA PLAMÁTICA 
 
Atualmente, um fator de grande importância pesquisado pela sociedade científica, 
é a integridade da membrana plasmática (IMP) do espermatozóide na pós-descongelação. 
As colorações simples como o Karras por exemplonão conseguem identificar se a 
membrana plasmática esta integra ou não. Assim sendo foram desenvolvidas provas que 
possibilitam identificar essa integridade como: 
 
1. Coloração supra-vital utilizando eosina 
 
É uma prova simples onde se coloca uma gota de sêmen na extremidade de 
uma lâmina + uma gota deste corante, homogeneiza-se bem as gotas e se realiza 
um esfregaço. Após a secagem da lâmina leva-se ao microscópio em aumento de 
400 vezes e conta-se 200 células, sendo que os espermatozóides que estiverem 
com a coloração vermelha estavam com a membrana lesada e permitiram a entrada 
do corante os demais que não se coraram são classificados como íntegros e o valor 
é expresso em porcentagem. 
 
2. Choque osmótico (Dell'Aqua Jr., et al, 2002) 
Outra prova bem simples de ser realizada, submete-se o espermatozóide a 
um estresse osmótico utilizando água destilada aquecida a 37°C, coloca-se uma 
gota de sêmen em 19 gotas desta água destilada e conta-se também 200 células, 
sendo que as que apresentarem dobramento de cauda são consideradas íntegras e 
as que permanecerem retas lesadas. A fisiologia do processo é que as membranas 
íntegras começam a receber um grande influxo de água pois a água vai do meio 
menos concentrado no caso a água que tem osmolaridade 0, para o gradiente mais 
concentrado no caso a célula espermática com osmolaridade próximo de 
280Mosmol e esse excesso de pressão dentro da célula faz com que esta se 
deforme dobrando a cauda. As células que não tinham a membrana íntegra não 
fazem esta troca osmótica e permanecem esticadas, o resultado é expresso em 
porcentagem, descontando-se os espermatozóides que já apresentavam caudas 
dobradas como patologia espermática. Ex. 60% de células dobraram a cauda após 
o choque osmótico e o touro tinha 5% de caudas dobradas ou enroladas como 
patologia espermática, logo concluímos que este animal tem 55% de células com 
integridade de membrana plasmática. 
 
3. Sondas fluorescentes 
 
É uma técnica mais refinada, que necessita de um microscópio de 
epifluorescência, cujo o custo é elevado, porém pode-se destinar a dose a um 
centro que possua esse equipamento para realização do exame. São utilizados duas 
sondas fluorescentes (“corantes”), um é um éster de carboxifluoresceína substância 
apolar que penetra em membrana íntegra, ela é metabolizada no citoplasma do 
 32
espermatozóide por esterases lá presentes e transformado em fluoresceína que não 
consegue sair da célula e emite uma coloração verde. O outro corante é uma 
substância polar que não consegue penetrar em membrana íntegra. Só o faz 
quando ela está lesada ao penetrá-la atinge o núcleo do espermatozóide e libera um 
RNAm que codificará as organelas a produzirem uma fluorescência vermelha. 
Então as células que se coram de verde são as com membrana íntegra e as que 
expressarem cor vermelha apresentam algum tipo de lesão em sua membrana. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AUTORES 
 
Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa - Professor Titular do 
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da 
FMVZ, UNESP Botucatu - SP- PhD e Pós-Doutorado em 
Reprodução Animal - Hannover- Alemanha. 
Email: papa@fmvz.unesp.br 
Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga - Professor Adjunto do 
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da 
FMVZ, UNESP Botucatu - SP PhD em Reprodução Animal - Pós -
Doutorado-Universidade do Colorado - USA 
Email: malvarenga@fmvz.unesp.br 
 
Dr. José Antonio Dell'Aqua Junior - Médico Veterinário, 
Mestrado, Doutorando e Pós-Doutorando na área de Reprodução 
Animal FMVZ, UNESP Botucatu - SP 
Email: dellaquajunior@uol.com.br