cinética enzimática

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CinCinéética Enzimtica Enzimááticatica
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Cinética das Reações Bioquímicas
As células vivas dos organismos heterotróficos e dos organismos autotróficos (na ausência 
de luz) obtêm a energia de que necessitam a partir da oxidação dos poliosídios de reserva a 
CO2 e água.
Esse conjunto de reações, assim como, as reações de síntese das macromoléculas, só é
possível devido à intervenção dos catalisadores bioquímicos � as enzimasas enzimas.
Todas as enzimas são proteínas globulares e catalisadores eficientes.
Catalisadores
� Energia de ativação necessária para iniciar um processo químico pode ser fornecida 
pela elevação da temperatura que aumente a agitação molecular.
� Em Bioquímica, a temperatura dos sistemas não pode ultrapassar os valores
compatíveis com a vida dos organismos (aquecimento ⇒ desnaturação das 
proteínas).
� Catalisadores bioquímicos ⇒ função de baixar a energia de ativação necessária à
reação e permitir que a reação ocorra em velocidade muito mais elevada.
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Centro ativo ou sítio ativo
� É constituído pelo conjunto de aminoácidos que entram em contato com o substrato.
� Compreende o local de fixação: que se combina com o substrato por ligações fracas; 
e o centro catalítico: que atua sobre o substrato levando-o a sofrer a reação 
química.
� A conformação do local e fixação se modifica em conseqüência da ligação ao 
substrato ⇒ substrato induz a alteração da conformação.
� Nas enzimas que atuam através de um cofator (metal; grupo prostético ou 
coenzima), essa estrutura se encontra ligada na vizinhança do centro catalítico.
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� A determinação experimental da velocidade da reação é feita recolhendo do meio 
reacional, a intervalos regulares de tempo, alíquotas da solução.
Velocidade da Reação enzimática
A velocidade de uma reação enzimática é, em geral, obtida pela medida da quantidade de 
produto (ou produtos) formado (s) por unidade de tempo.
S = substrato; E = enzima; P = produto
A velocidade de reação num tempo (t) é: 
td
[ ]Pd
v =
EPES ++
A velocidade pode ser medida, também, a partir do decréscimo da concentração de 
substrato: [ ]Sd
tdv
=
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Representação gráfica:
� Até certo ponto da reação, a variação é linear.
� É vantajoso medir a velocidade no início da reação, quando pouco substrato foi 
transformado e a velocidade inversa é desprezível.
� A inclinação é então máxima, o que permite ter a velocidade inicial da reação (v0).
vo = tg ααααo velocidade inicial de uma reação
enzimática
velocidade num instante tt11= tg αααα1 v1 
Tempot1
Q
u
a
n
t
i
d
a
d
e
 
d
e
 
p
r
o
d
u
t
o
 
f
o
r
m
a
d
o
αο
α1
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A velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima
� A velocidade de 
formação de produto 
(dp/dt) é constante 
para E1 e E2 até o 
tempo t1
� Na determinação de 
produto formado em 
intervalo de tempo 
mais longo, a resposta 
não será linear em 
todas as faixas de [E]
Velocidade de uma reação enzimática 
em presença de quantidades crescentes 
de enzima
(E2 = 2E1; E3 = 3E1; etc..)
t2t1 Tempo
E3
E2
E13 x
2 x
1 x
[P]
E4
4 x
Variação linear de velocidade inicial 
de uma reação enzimática com a 
concentração de enzima
[E]
v
E4
E3
E2
E1






=
1t
[ ]P
v
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Fatores que Influenciam a Atividade Enzimática
Vários fatores influenciam a atividade de uma enzima. Os mais importantes são a 
temperatura, pH, concentração de substrato e a presença ou ausência de inibidores.
� Temperatura
A velocidade da maioria das reações químicas aumenta 
quando a temperatura aumenta. Moléculas se movem 
mais lentamente a baixas temperaturas do que a altas 
temperaturas e, portanto, muitas podem não ter 
energia suficiente para promover a reação química. 
Para as reações enzimáticas, entretanto, elevações 
além de certa temperatura reduz drasticamente a 
velocidade de reação. A temperatura ótima para a 
maioria das enzimas se situa entre 35 e 40ºC. 
A redução da velocidade de reação acima da 
temperatura ótima é devida à desnaturação das 
enzimas, ou seja, a perda de sua estrutura 
tridimensional característica. A desnaturação de uma 
proteína envolve o rompimento de ligações de 
hidrogênio e outras ligações não covalentes.
V
e
l
o
c
i
d
a
d
e
 
d
a
 
r
e
a
ç
ã
o
Temperatura (ºC)
0 10 20 30 40 50 60
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� pH
A maioria das enzimas tem um pH ótimo no qual sua atividade é máxima. Acima ou abaixo 
deste valor de pH a atividade enzimática, e portanto a velocidade de reação, diminui. 
Quando a concentração de H+ (pH) no meio é drasticamente alterada, a estrutura 
tridimensional da proteína também é alterada. Mudanças extremas na concentração de 
ácidos (ou bases) modificam a estrutura tridimensional de proteínas porque o H+ (ou OH-) 
compete com o hidrogênio nas pontes de hidrogênio e ligações iônicas presentes na 
estrutura da enzima, resultando na sua desnaturação.
pH
4 6 8 10
A
t
i
v
i
d
a
d
e
E
n
z
i
m
á
t
i
c
a
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� Concentração de Substrato
Existe uma taxa máxima na qual certa quantidade de enzima pode catalisar uma reação 
específica. Apenas quando a concentração de substrato é extremamente alta, esta taxa 
máxima pode ser alcançada. 
Sob condições de alta concentração de substrato, a enzima está em saturação, isto é, seus 
sítios ativos estão todos ocupados por moléculas de substrato ou produto. Nesta condição, 
um aumento na concentração de substrato não afetará a taxa de reação porque todos os 
sítios ativos já estarão sendo utilizados. Em condições celulares normais, as enzimas não 
estão saturadas com o substrato. Em um determinado tempo, algumas das moléculas de 
enzima poderão estar inoperantes por falta de substrato, assim, a velocidade de reação é
influenciada pela concentração de substrato.
� Inibidores
Uma forma efetiva de controlar o crescimento de um microrganismo, por exemplo, é
controlar suas enzimas. 
Qualquer substância que reduza a velocidade de uma reação enzimática pode ser 
considerada como inibidor. 
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Cinética Enzimática
Na reação enzimática se forma um complexo transitório entre enzima e substrato.
O estudo das reações enzimáticas se baseia em medidas de velocidade da reação catalisada.
Velocidade de uma reação ⇒ quantidade de produto formado em um tempo determinado.
Velocidade inicial de uma reação ⇒ medida em tempos suficientemente curtos para que no 
máximo 5% do substrato sejam transformados em produto.
Em uma reação enzimática típica, a 1ª fase ocorre a velocidades muito maiores do que a 
2ª fase. Equações de velocidade para estas fases são: 
[ ]
[ ]ESkv
[ ]SEkv
33
11
=
=
PEES k +→ 3
k2
ESSE
k
+
1
PEESSE k
k
+→+ 3
1
k 2
A reação catalisada enzimaticamente se processa 
em duas etapas:
� A enzima se liga reversivelmente ao substrato 
formando um complexo enzima-substrato (ES)
� O produto é liberado e a enzima volta à forma 
livre podendo, então, se ligar a outra molécula 
de substrato.
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� A medida real da velocidade da reação, ou seja, a medida da velocidade de formação do 
produto é igual a v3, que é a etapa mais lenta e limitante do processo.
� Nas reações enzimáticas, a concentração de enzima é, normalmente, muito menor que a 
concentração de substrato.
Um equilíbrio entre E, S e ES (com concentraçõesdefinidas e constantes de cada espécie) 
se estabelece muito rapidamente.
� Tendo ocorrido a formação de ES, se inicia a segunda parte da reação enzimática, aquela 
que efetivamente forma o produto, com uma velocidade proporcional à concentração de 
ES.
� O fato de ES estar sendo consumido na formação do produto não provoca diminuição da 
sua concentração, uma vez que há excesso de substrato para se combinar com a enzima 
liberada quando se forma o produto.
� Esta situação se mantém por algum tempo (tempo inicial): contínua formação do produto e 
concentrações estáveis de ES e S. 
A pequena e contínua diminuição da concentração de S não é significativa, face ao seu 
grande excesso.
 PEESSE
k
k
++
k31
2
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� Existirá uma determinada concentração de substrato que provocará a formação de uma 
concentração de ES igual à metade da máxima possível. Nestas condições, a velocidade 
será, naturalmente, a metade da maior velocidade possível.
Esta concentração definida de substrato é igual à Constante de Michaelis-Menten ou Km.
a – cinética de 1ª ordem (velocidade proporcional à concentração de substrato)
b – cinética de ordem zero (velocidade independente da concentração de substrato)
� À medida que se aumenta a concentração inicial do substrato, as velocidades de 
formação do produto se tornarão cada vez maiores. No equilíbrio da 1ª etapa 
existirá cada vez mais complexo ES. Nestas condições haverá a maior concentração 
possível do complexo ES; a reação será processada na máxima velocidade possível.
Km [S]
v
Vmax
½ Vmax
a
b
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Variação de velocidade da reação com a concentração de substrato
Teoria de Michaelis-Menten (com um único substrato)
E = Enzima 
S = Substrato 
ES = Complexo enzima-substrato 
P = Produto
� Propostas
� A enzima e o substrato reagem rapidamente para formar o complexo enzima-substrato 
(ES)
� A fase mais lenta é a formação de produto (P)
� Há excesso de substrato (S)
� Todas as determinações de produto (P) são feitas no início da reação quando a 
velocidade de formação do complexo enzima-substrato (ES) a partir de enzima (E) + 
produto (P) é muito pequena e pode ser desprezada ⇒ velocidades iniciais
PEESSE
k
k
k
k
++
3
4
1
2
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� Dedução
[ ] [ ] [ ]
[ ]
[ ]
t
t
EkV
ESkv
ESEE
3max
3
=
=
+=
Qual a velocidade de formação de [ES] ? ⇒ [ ][ ]SEk1
Qual a velocidade de decomposição de [ES] ? ⇒ [ ] [ ]ESkESk 32 +
Variação de [ES] com o tempo: [ ] [ ][ ] [ ] [ ]ESkESkSEk
td
ESd
321 −−=
Como no estado estacionário [ES] não varia ⇒ [ ] 0=
td
ESd
[ ][ ] ( )[ ]
[ ][ ] [ ]
[ ][ ] [ ]ESKmSE
ES
k
kkSE
ESkkSEk
=
+
=
+=
1
32
321
KmKm = Constante de MichaelisConstante de Michaelis ou 
Constante de dissociação do complexo ES (Ks)
32
1k
kk + = Km
PEESSE ++
k 3k 1
k 2
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É muito difícil quantificar [ES], porém, se sabe que: [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]
tt EESEESEE +−=⇒+=
Substituindo em : [ ][ ] [ ]ESKmSE =
[ ] [ ] [ ]( ) [ ]
[ ] [ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ] [ ]
[ ] vS
KmV
ESkESk
S
KmEk
ES
S
Km
ESE
ESKmESES
t
t
t






+=
+=
=−
=−
1max
333
k× 3
[ ]
[ ]
SV
v
SKm +
.
=
max Equação de Michaelis-Menten
v = velocidade observada na reação quando a concentração de substrato é [S]
Km = Constante de Michaelis-Menten
Vmax = velocidade máxima da reação. Ocorre quando o substrato está presente em 
concentrações de saturação.
� A equação de Michaelis e Menten permite, após a determinação experimental das 
variáveis v em função de [S], obter o valor de Vmax e calcular Km.
Em geral, os valores de Km estão compreendidos entre 10-2 e 10-8 M. 
Atribui-se a Km unidades de concentração.
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a
b
c
Vmax
[S]
v
Km
½ Vmax
Curva de Michaelis-Mentem
� Variação da velocidade de reação em função da concentração do substrato
Equação de Michaelis-Mentem:
[ ]
[ ]
SV
v
SKm +
.
=
max
Analisando a curva:
b. Quando v = ½ Vmax
][
][2][
SKm
SSKm
=
=+ � Km tem dimensões de
concentração][
][
2
1 max
max SKm
SVV
+
⋅
=
c. Quando [S] >> Km ][
][max
SKm
SV
v
+
⋅
=
maxVv =
� negligenciável
� não depende da [S]
� Ordem zero
][
][max
SKm
SV
v
+
⋅
=
⋅ ][S
Km
maxVv ⋅=
� desprezado 
� 1ª ordema. Quando [S] << Km
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Substrato 1
Substrato 2
Vmax
[S]
v
½ Vmax
Km1 Km2
Por que determinar Km ?
� Km estabelece o valor aproximado para o nível de substrato intracelular.
[S]intracelular << Km ⇒ v seria muito sensível a variações de S (1ª ordem) e o poder catalítico da enzima 
seria desperdiçado, pois v << Vmax.
[S]intracelular >> Km ⇒ não há sentido fisiológico pois v não pode exceder Vmax. Quando [S] >> Km; v se 
torna insensível a variações de S.
� Km é específico para uma dada enzima.
Serve de meio de comparação entre enzimas extraídas de diferentes fontes, mas que catalisam a 
mesma reação.
Pode-se determinar se duas enzimas são idênticas ou se são proteínas diferentes que catalisam a 
mesma reação.
� Conhecendo-se o valor de Km pode-se determinar Vmax
que é função da [E]total
Utilizando [S] >> Km determina-se Vmax.
� Km indica a adequacidade relativa de substratos a uma 
enzima.
Quando mais baixo o valor de Km maior a afinidade do 
substrato com a enzima.
� Variação no valor de Km induzida por um ligante é uma maneira de regular a atividade de uma enzima. 
Se Km determinada “in vitro” for diferente da determinada em condições fisiológicas, isto pode 
indicar a falta de um efetor. Vários efetores podem ser testados para a identificação de quais atuam 
como inibidores ou ativadores.
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Método gráfico para determinação das constantes cinéticas
Em virtude da curva v versus [S] ser uma hipérbole é muito difícil determinar Vmax com 
precisão e, portanto, a [S] que fornece ½ Vmax ou o Km.
Para facilitar a determinação das constantes cinéticas, os dados são lançados em gráfico 
utilizando um dos métodos gráficos disponíveis.
Gráfico dos recíprocos de Lineweaver-Burk: 

1
[ 



]
1
S
versus
v
Rearranjo da equação de Michaelis-Menten numa forma linear � baxy +=
][
][
max S
SKm
V
v +
=Invertendo:
Multiplicando os dois termos: ][
][1
max SV
SKm
v ⋅
+
=
Separando os termos: ][
][1
maxmax
SV
S
V
Km
v ⋅
+=
][
][
max
SKm
S
V
v
+
=
�][
][
SKm
SmaxV
v
+
⋅
=
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Michaelis-Menten
[S]
v
Vmax
½ Vmax
Km
][
][
SKm
SmaxV
v
+
⋅
=
Onde: a = inclinação da reta
b = interseção da reta em y
1/[S]
1/Vmax
-1/Km
1/v
tg = Km/Vmax
Lineweaver-Burk
maxmax
1
][
11
VSV
Km
v
+





×=
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Questão de cinética enzimática
Os seguintes dados foram obtidos para a reação enzimática de transformação de um 
substrato (S) em produto (P):
a) Calcule Vmax e Km.
b) Qual seria v com [S] = 2,5 x 10-5M e com [S] = 5,0 x 10-5M?
c) Qual seria a v com [S] = 5,0 x 10-5M, se a concentração de enzima fosse o dobro?
d) A v dada na tabela a lado foi determinada pela medida da concentração de produto que 
se acumulou por um período de 10 minutos. Veja se v representa uma velocidade inicial 
verdadeira.
75,00
74,90
60,00
56,25
15,00
V (nmoles x litro-1x min-1)
1,00 x 10-2
1,00 x 10-3
1,00 x 10-4
7,50 x 10-5
6,25 x 10-6
[S] (M)
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a) v se torna insensível a mudanças da [S] acimade 10-3M. Portanto, na faixa de [S] de 10-3 a 
10-2, v deve ser próximo a Vmax
Para calcular Km ⇒ escolha qualquer valor de v e a correspondente [S] 
1
max
min75 −1− ××= litronmolesV
Resposta da questão
Km
4
1025,0
60
1015 4−
−
×=
×
= ∴Km 1060601075 4−4− ×+=×
4−
Km 410
10
75
60
−+
=∴
[ ]SKm
[ ]S
V
v
max +
=
MKm 105,2 5−×=
∴
max5,0= Vve= Km105,2 5−×= M[ ]Sb) min 1−××= 1−litro5,37 nmolesv
∴
( ) ( )
5,7
755
=v5,7
5105
75
5−
=( )5105 −×+( )5105,2 −×
×
=
v
100,5 5−×= M[ ]S 50 min 1−××= 1−litronmolesv
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e
t
[ ]Ek[ ]SKm
[ ]S
v 3+
=∴
t
[ ]EkV 3max=[ ]SKm
[ ]S
V
v
max
+
=c)
v é diretamente proporcional à concentração de enzima, para todas as concentrações de 
substrato. Portanto, dobrando-se [E]t para a [S] = 5 x 10-5M ⇒ v dobra 
∴ min100 1−1− ××= litronmolesv
d) Vamos utilizar os valores mais baixos de [S].
∴ 1150min10 −×⇒ litronmolesEm1 min15 1−− ××= litronmolesve1025,6 6−×= M[ ]S
ou %4,2024,0==
1025,6
10150,0
×
×
6−
6−
M ( )litropresententeoriginalmeSde /1025,6 6× −
M ( utilizadoSde )litro/10150× 9−
SubstratodeutilizadosForam %4,2∴