AULA PRÁTICA SOBRE ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO UV DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
DISCIPLINA CBS 01021 – QUÍMICA DE PROTEÍNAS
	
		
	AULA PRÁTICA Nº 1
ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO UV
DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS
MARIA MANOELA REZENDE SEVERO
(00314741)
PORTO ALEGRE, 22 DE AGOSTO DE 2019
INTRODUÇÃO
 Os aminoácidos são agrupados em cinco classes, de acordo com as propriedades dos seus grupos laterais, ou grupos R, como são conhecidos. Nessa aula trabalhamos com a classe dos aromáticos, mais especificamente com o triptofano, tirosina e fenilalanina. 
 
 
 Fig. 1: Triptofano Fig. 2: Tirosina Fig. 3: Fenilalanina
Os aminoácidos aromáticos têm como característica absorver muito bem a luz ultravioleta, por isso utilizamos a técnica de espectroscopia de absorção no UV desses aminoácidos.
 Espectroscopia é a designação para toda técnica de levantamento de dados físico-químicos obtidos através da transmissão, absorção ou reflexão da energia radiante incidente em uma amostra. Através do espectro de absorção de um composto, obtido com o uso do espectrofotômetro (instrumento capaz de medir e comparar a quantidade de luz - UV, visível ou IV - absorvida, transmitida ou refletida por uma determinada amostra), é possível saber a sua concentração em uma amostra, e isso pode ser obtido pela quantidade de luz que o composto absorve em um determinado comprimento de onda desse espectro. 
 Essa determinação é de acordo com a Lei de Lambert-Beer, a qual estabelece que “a intensidade de um feixe de luz monocromático decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente aumente aritmeticamente”. Ou seja, uma certa solução absorve a luz proporcionalmente à concentração molecular do soluto contido nela. 
OBJETIVO
 A aula prática de número 1 teve como objetivo identificar quais aminoácidos aromáticos estavam contidos nos tubos 6, 7 e 8, através da comparação dos espectros de absorção de luz desses aminoácidos no ultravioleta com o uso do espectrofotômetro.
METODOLOGIA
 Primeiramente, foram identificados três eppendorfs com os números 6, 7 e 8. Após, recebemos os seguintes tubos com as soluções dos três aminoácidos, já diluídos anteriormente à aula:
- TUBO 6 (aminoácido 10mM): Diluído 20x (50μL AA + 950μL água)
- TUBO 7 (aminoácido 50mM): Diluído 10x (100μL AA + 900μL água)
- TUBO 8 (aminoácido 50mM): Diluído 10x (100μL AA + 900μL água)
 Em seguida, foram pipetadas as amostras diluídas diretamente na placa de 96 poços, conforme os volumes indicados na tabela abaixo, seguindo as coordenadas da placa de 96 poços indicada:
	
Poço
	Tubo 6
diluído
	H2O destilada
	A1
	-
	200 μL
	A2
	25 μL
	175 μL
	A3
	50 μL
	150 μL
	A4
	100 μL
	100 μL
	A5
	200 μL
	-
	
Poço
	Tubo 8
diluído
	H2O destilada
	C1
	-
	200 μL
	C2
	25 μL
	175 μL
	C3
	50 μL
	150 μL
	C4
	100 μL
	100 μL
	C5
	200 μL
	-
	
Poço
	Tubo 7
diluído
	H2O destilada
	B1
	-
	200 μL
	B2
	25 μL
	175 μL
	B3
	50 μL
	150 μL
	B4
	100 μL
	100 μL
	B5
	200 μL
	-
 
 Após isso, foi realizada a varredura, no espectrofotômetro, do espectro na faixa ultravioleta iniciando em 250nm e terminando em 310nm, com intervalos de 1nm. 
 RESULTADOS
 A realização da varredura do espectro na faixa ultravioleta (250nm – 310nm) determinou resultados os quais nos permitiram caracterizar os aminoácidos contidos nos tubos 6, 7 e 8. 
 A solução do tubo 6 apresenta um pico de absorção na faixa do comprimento de onda de 278nm, permitindo a interpretação de que o aminoácido contido nela seria o triptofano. Isto porque seu pico de absorção está na casa dos 280 nm, e ele apresenta absorção em comprimentos de onda maiores que 300nm, como aparece na figura 4.
 
 
Fig. 4: Gráfico dos comprimentos de onda absorvidos pelos poços A1, A2, A3, A4 e A5, do tubo 6.
 
 Seguindo na análise, a varredura dos cinco poços que continham a solução do tubo 7 nos permitiu concluir que o aminoácido presente nele deveria ser a tirosina, visto que a solução apresenta pico de absorção na faixa de 275nm e não absorve comprimentos de onda maiores que 300nm. Essa conclusão pode ser observada na figura 5.
Fig. 5: Gráfico dos comprimentos de onda absorvidos pelos poços B1, B2, B3, B4 e B5, do tubo 7.
 
 Por fim, a análise da solução contida no tubo 8 mostrou que o aminoácido presente nele era a fenilalanina, pois apresenta pico de absorção na faixa de 257nm, como mostra a figura 6.
Fig. 6: Gráfico dos comprimentos de onda absorvidos pelos poços C1, C2, C3, C4 e C5, do tubo 8.
 Após a leitura das três soluções contendo os aminoácidos aromáticos, percebemos que houve diferenças de absorbância entre eles. Isso se deve ao fato da presença de ligações duplas em seus anéis aromáticos, pois elas aumentam a superfície de contato entre os fótons e os átomos que os absorveram. Então, os aminoácidos que possuem um maior número de anéis anormáticos, apresentaram maior absorbância.
 No entanto, a tirosina mostrou ter a maior absorbância entre os três aminoácidos analisados nesse caso, mesmo não possuindo o maior número de anéis aromáticos dentre os três. Isso ocorre porque a solução de triptofano está 10x mais diluída que as demais soluções.
 Diante dos valores obtidos na análise, calculamos as concentrações dos aminoácidos nas soluções da seguinte forma:
Tubo 6 :
10mM inicial. Diluição de 50μL em 950μL de água destilada. 
10mM * (50 μL*10^-6) = Cf * 10^-3mL
(50*10^-2)mM = 0,5 mM = Concentração de AA no tubo 6
Tubo 7:
50mM inicial. Diluição de 100μL em 900μL de água destilada.
50mM * (100 μL*10^-6) = Cf* 10^-3mL
5mM = Concentração de AA no tubo 7
Tubo 8:
50mM inicial. Diluição de 100μL em 900μL de água destilada.
50mM * (100 μL*10^-6) = Cf* 10^-3mL
5mM = Concentração de AA no tubo 8
Para os cálculos de diluição dos poços foi utilizado o seguinte método:
Ci * Vp = Cf * Vf
Ci = concentração inicial do AA no tubo (Tubo 6 = (50*10^-2)mM / Tubo 7 e 8 = 5mM)
Vp = volume de AA pipetados no poço em L (1μL/10^6)
Cf = concentração final de AA no poço
Vf = volume da solução final no poço que sempre será 1 mL; portanto, 10^-3 L
 
 Fig. 7: Cálculos de diluição dos poços correspondentes ao tubo 6.
 
 Fig. 8: Cálculos de diluição dos poços correspondentes ao tubo 7.
 
 Fig. 9: Cálculos de diluição dos poços correspondentes ao tubo 8.
 Com o resultado dos cálculos, foi possível construir o gráfico da variação da absorbância pela concentração de cada tubo, como está mostrado nas figuras a seguir.
 
Fig. 10: Gráfico absorbância x [ ] dos Fig. 11: Gráfico absorbância x [ ] dos
poços referentes à solução do tubo 6. poços referentes à solução do tubo 7.
 
 Fig. 12: Gráfico absorbância x [ ] dos 
 poços referentes à solução do tubo 8. 
 
 Ao analisar os gráficos, é possível confirmar os princípios da Lei de Lambert-Beer, pois verificamos a absorbância (eixo y) e a concentração (eixo x) formando uma tendência linear. Este resultado era esperado, pois de acordo com a lei em questão, a absorbância de uma espécie é diretamente proporcional à sua concentração molar, à distância percorrida pela radiação (caminho óptico) e ao coeficiente de absorção molar da espécie. Portanto, como em cada linha horizontal da placa de 96 poços está contido o mesmo aminoácido e o mesmo volume, podemos afirmar que a absorbância será diretamente proporcional à concentração.
 Entretanto, nota-se que existemvariações nas extremidades dos gráficos, as quais saíram do padrão de reta esperado. A causa para isso deve ser os limites que a técnica de espectroscopia possui para a análise exata de certas concentrações.
CONCLUSÃO
 
 Através dos experimentos e os seus respectivos resultados, podemos alcançar o objetivo previsto. Foi possível confirmar a presença de triptofano no tubo 6, tirosina no tubo 7 e fenilalanina no tubo 8. Além disso, pudemos confirmar a lei de Lambert-Beer quando, após os cálculos e a construção dos gráficos, a relação das concentrações e absorbâncias resultantes manteve-se proporcionalmente em todos os poços.
REFERÊNCIAS
 Nelson, David L. Princípios de Bioquímica de Lehninger/David L. Nelson, Michael M. Cox. 6ª Ed. Porto Alegre: Artmed, 2014.