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Universidade Federal do Ceará
Centro de Ciências Agrárias
Departamento de Engenharia de Pesca
Laboratório de Química e Proteínas
Relatório:
Prospecção de moléculas
Aluno: Mateus Silva Ribeiro
Matrícula: 493914
Professor: Rômulo Farias Carneiro
Fortaleza, 06 de Junho de 2022
1
Sumário
Introdução…………………………………………………………………………………………
……………………………………02
Objetivo……………………………………………………………………………………………
…………………………………….03
Metodologia………………………………………………………………………………………
…………………………………..03
Material……………………………………………………………………………………………
…………………………………….05
Procedimento
experimental………………………………………………………………………………………
……………06
Resultado e
Discussão…………………………………………………………………………………………
………………….09
Conclusão…………………………………………………………………………………………
…………………………………….13
2
1 - Introdução
Em nossa costa litorânea brasileira, encontramos uma biodiversidade aquática com
ricos compostos bioativos de grande potencial biológico, dentre elas as algas macroscópicas
que servem de abrigo e alimento para diversos animais além da produção de grande parte do
oxigênio que respiramos. Em busca de novos recursos com potencial biotecnológico tem-se
direcionado estudos para os habitats marinhos isolando seus compostos a fim de identificar
sua variabilidade biológica. Para O’SULLIVAN et al, 2010, as algas marinhas representam um
dos recursos com maior potencial biologicamente ativo da natureza, com grande riqueza de
compostos bioativos. Estudos de detecção e isolamento de substâncias ativas presentes em
algas,sobretudo as de estruturas protéicas têm se intensificado nos últimos anos em
decorrência da diversidade de seus compostos e comprovada aplicabilidade em diferentes
áreas de pesquisa. Sua variabilidade biológica demonstrou grandes atividades no tocante aos
seus efeitos: antibacteriana, anti inflamatória, antinociceptiva, anti oxidantes, anti coagulante,
apoptótica, além de sua aplicabilidade nos processos industriais como; alimentos,
farmacêuticos, biomédicos e cosméticos. Mesmo levando em consideração a presença desses
compostos bioativos, pode ocorrer diferenciação nas respostas conforme o método aplicado,
dosagem e período (estação do ano, localização geográfica dentre outros fatores). As lectinas
desempenham a função de ligar mono ou oligossacarídeos de forma específica e reversível,
mas destituída da atividade catalítica não sendo produtos de uma resposta imune. Apresentam
variedade em tamanho, estrutura e organização molecular sendo encontradas em muitos
organismos como vírus, bactérias, plantas e animais. O relato sobre a ocorrência da lectina em
algas marinhas registrado pela primeira vez foi feito por Boyd et al. (1966) estudando algas
tropicais detectaram então a presença de atividade hemaglutinante em extratos de 24 espécies
estudadas.
Um campo que vem sendo objeto de pesquisa e estudo por pesquisadores vincula-se a
abordagens voltadas às esponjas marinhas que encontra-se cada vez mais crescente devido a
diversidade de metabólitos primários e secundários como também a sua capacidade de
sintetização de substâncias de classes diferentes. Nos últimos tempos compostos
biologicamente ativos têm sido isolados de poríferos onde destaca-se a lectina. O isolamento e
caracterização bioquimicamente de uma lectina presente em esponja a partir de extrato
aquoso por meio de combinações pode determinar o grau de avaliação de sua atividade
hemaglutinante a partir de uma nova lectina, onde seu processo isolador pode determinar seu
grau de purificação. Métodos aplicados em dosagem de proteína como o de Bradford foi
utilizado em uma amostra de sangue de coelho como reagente permitindo leitura de diferentes
concentrações como da BSA que elabora a curva padrão, com base no cálculo da quantidade
de proteína presente determinando sua concentração.
Distinguindo-se dos demais grupos de algas, por apresentar características
ultra-estruturais, químicas e reprodutivas, as algas vermelhas têm representando maior
3
diversidade das espécies dentro das macroalgas marinhas. As gracilarióides raramente são
expostas durante as marés baixas, supõe-se a baixa tolerância a longos períodos de dessecação
e exposição ao ar. Podem apresentar limitação em relação aos caracteres informativos na
identificação das espécies.
O interesse pelo conhecimento biológico do grupo devido aos fatores econômicos
estimulou pesquisas de conhecimento mais íntegro das espécies Gracilaria com propósito de
saber qual a mais produtiva. As algas marinhas são potenciais fontes de agentes antibióticos,
pois apresentam compostos bioativos para diferentes cepas de bactérias e fungos.
Em estudos realizados revelou-se importante bioatividade dos compostos do gênero Gracilaria,
indicando forte atividade antioxidante, antibiótica, ação de extratos etanólicos com ação
inibitória contra bactérias.
2 - Objetivo
Prática 01: Extrato aquoso de alga verde
2.1 - Objetivo de solução tampão
> Manusear e compreender o funcionamento de um pHmetro;
> Discutir as reações que ocorrem em uma solução tampão.
2.2 - Objetivo geral
Prática 01: Extrato aquoso de alga verde
Isolar e parcialmente caracterizar uma nova lectina de alga marinha verde Codium
Isthmocladum. Além disso, avaliar a amostra de sangue do coelho pela nova proteína para
verificar a reação pelo reagente de Bradford.
Prática 02: Extrato aquoso de esponja
Purificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar atividade hemaglutinante de uma
nova lectina de Haliclona caerulea.
Prática 03: Extrato aquoso de esponja
Este trabalho tem por objetivo avaliar o potencial biológico do extrato de alga
vermelha do gênero Gracilaria.
2.3 - Objetivos específicos
Prática 01: Extrato aquoso de alga verde
> Construção da curva padrão;
> Realizar a dosagem de proteína de amostra de sangue do coelho;
> Avaliar as concentrações dos extratos de algas verdes dosados pelo método de Bradford.
Prática 02: Extrato aquoso de esponja
Isolar e caracterizar uma nova lectina presente no extrato aquoso de esponja Haliclona
caerulea; avaliar a atividade hemaglutinante sobre amostra do sangue coelho.
Prática 03: Extrato aquoso de esponja
4
Avaliar a centrífuga precipitar a pelete; analisar o agitador magnético no pHmetro pela
concentração na amostra do sulfato de amônia.
3 - Metodologia
Prática 01: Extrato aquoso de alga verde
3.1 - Alga marinha verde
3.1.1 Lectinas de algas verde
Desde as primeiras evidências que indicaram a capacidade de aglutinação das
proteínas encontradas em extratos de plantas da qual foram denominadas de hemaglutininas,
as linhas de pesquisa e de estudos acadêmicos permitiram identificar dados relevantes de
suma importância.
As algas marinhas verdes do codium são basicamente constituídas por talo cenocítico,
filamentos tubulares contínuos sem divisão celular, tendo comportamento de célula gigante
com vários núcleos e cloroplastos. Encontradas nas Américas do sul, central e norte, Europa,
África, em regiões do mesolitoral em zonas de recifes entre marés. Trazem em sua composição
proteica há presença de lectinas sendo de alto potencial biotecnológico devido a capacidade
de reconhecer e se ligar a carboidratos de forma específica e reversível. Tem formação
heterogênea de grupos de proteína apresentando grande variedade em tamanho, estrutura e
organização molecular. Encontradas em muitos organismos desde vírus e bactérias até plantas
e animais. As lectinas diferem em suas propriedades, em geral as lectinas de algas têm massas
moleculares menores que as de vegetais não tendo afinidade por açúcares simples, com
especificidade para oligossacarideos e glicoproteínas.
Muitas lectinas do gênero Codium já foram isoladas e caracterizadas em algum
detalhe. Em termos gerais essas lectinas nas apresentaram características semelhantes entre si,
bem como para as glicoproteínas mucina e fenitoína. Compostas de subunidades pequenas
podendo apresentar ou não formas oligoméricas.
3.1.2 - Alga marinhas verde Codium Isthmocladum
Os estudos que buscam compreender as funções biológicas das algas marinhas não
obtém dados suficientes para umesclarecimento amplo de suas funções fisiológicas de seus
substratos protéicos. No que se refere à atividade hemaglutinante obteve-se resultados
motivadores onde foi detectada inicialmente em espécies coletadas na costa do estado do
Ceará por Ainduz et al. (1991).
Detectou-se atividade hemaglutinante no qual observando-se aglutinação específica
para eritrócitos do coelho. Este animal apresenta uma lectina parcialmente isolada e
caracterizada, possuindo massa molecular, dependente de metais para exibir a sua atividade
hemaglutinante, com especificidade para sangue de coelho.
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3.1.3- As hemaglutininas de alga marinha
A cada nova descoberta sobre os componentes bioativos das algas marinhas tem se
intensificado de forma mais objetiva investigações sobre esses compostos. (RAJA et al.,2008)
afirma que as hemaglutininas possuem atividades que podem vir a sanar necessidades na
saúde pública, como fármacos anti-virais, antimicrobianos e antineoplásicos.
Na diversidade proteica encontram-se as hemaglutininas que são carboidratos de
ligação associadas a proteínas existentes em abundância na natureza sendo observada em
quase todos os organismos vivos, de modo especial em plantas superiores. A maior parte dos
estudos visando a atividade hemaglutinante é correlacionada com a produção de lectinas (VAN
DAMME, 2010; LIS; SHARON, 1998).
Desempenha papel importante na agregação de células e glicoconjugados, onde
hemaglutininas de algas marinhas têm a capacidade de hemaglutinação de forma preferencial
em eritrócitos tratados enzimaticamente de coelho. Vários estudos relatam que
hemaglutininas de algas apresentam atividade imunomoduladora e anti-tumorais em razão da
sua composição química e estrutural sendo promissor ao benefício humano.
Prática 02: Extrato aquoso de esponja
3.2 - Esponja
3.2.1 - Esponja Haliclona Caerulea
A espécie Haliclona caerulea é uma esponja de coloração verde azulada. Ela apresenta
acentuada plasticidade fenotípica, ou seja, uma habilidade de responder, morfologicamente, as
mudanças que ocorrem em seu habitat, o que inclui distribuição de chuvas, variações de
salinidade e temperatura, e inclusão de novas espécies. Esta plasticidade fenotípica permite
que esta esponja seja dominante em termos de biomassa e distribuição no ambiente em que
habita. É comumente encontrada associada a outras algas em determinadas condições
ambientais. Em animais, as lectinas descritas até então haviam sido encontradas em
invertebrados ou vertebrados inferiores e somente três haviam sido isoladas e caracterizadas.
3.2.2 - Lectina da esponja Haliclona
Apesar de serem consideradas animais multicelulares, as esponjas marinhas
constituem um campo recente no que se refere à pesquisa, constituindo diversos tipos de
metabólitos primários e secundários que precisam ainda serem estudados e aprofundados.
Devido a sua prevalência, distribuição e habilidade de sintetizar uma gama de substâncias de
diferentes classes estruturais, esses organismos tornaram-se uma das fontes promissoras para
descobertas de novos compostos com atividade biológica (STEBBINS, 1991; CARTÉ, 1996;
RUPPERT; BARNES, 1996; HENTSCHEL; USHER, TAYLOR, 2006).
Tendo como fonte rica e simples de produtos naturais, estudos revelam uma variedade
de substâncias conhecidas como atividades farmacológicas e toxicológicas.
O gênero Haliclona é conhecido pela produção de um alcalóide tóxico denominado
halitoxina. Porém as lectinas também têm sido alvo de estudos neste gênero, onde a primeira
detecção de atividade hemaglutinante em esponjas do gênero foi realizada em Haliclona sp.
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4.Material
Prática 01: Extrato aquoso de esponja
4.1. MATERIAIS E MÉTODOS
Quantidade Quantidade
Acetato de sódio 20 mM Béquer 1
Cloreto de sódio
(NaCl)
1 M Béquer 1
pH 1 Béquer 1
4.1.1 Material dos reagentes
> Coomassie Brilliant Blue G (95%);
> Álcool etílico de 25 mL;
> Álcool fosfórico que 85% de 50 mL;
> Água destilada de 500 mL.
Prática 02: Extrato aquoso de esponja
4.2 - Material
> Proveta de 250 mL para béquer de 127 g;
> Proveta de 600 mL para béquer de 300 g;
> NaCl 0,15 mL para béquer de 10 mL.
Prática 03: Extrato aquoso de alga vermelha
4.3 - Material
> Proveta de 250 mL para béquer de 127 g;
> Proveta de 600 mL para béquer de 300 g;
> NaCl 0,15 mL para béquer de 10 mL.
7
5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Prática 01: Extrato aquoso de alga verde
5.1.1 - Preparação de um tampão de acetato de sódio e cloreto de sódio com pH = 5
Primeiramente foram feitos os cálculos para poder iniciarmos os experimentos onde foi
calculado a massa do acetato de sódio de 20 mM para 0,02 M e cloreto de sódio de 1M.
Fórmula geral: m = PM x V x M; m = massa, PM = peso molecular, v = volume e M = molaridade
Cálculo: m = 82,03 x 1 x 0,02 = 1,6406 g de acetato de sódio e m = 58,44 x 1 x 1 = 58,44 g de
cloreto de sódio.
Na Balança analítica foi colocado o béquer com acetato de sódio adicionando a água
destilada, em seguida pegou o béquer com cloreto de sódio 300 mL. Agitando o béquer de
cloreto de sódio utilizando o agitador magnético até obter o pHmetro em pH é 4,17 em
temperatura de aproximadamente 25°C.
5.1.2 - Preparo do extrato total e fracionamento com sulfato de amônio.
No processo de extração da alga verde. Elas foram cortadas com uma tesoura até a
atingir umas espessuras equivalente a 0,2 cm de comprimento, tornando consequentemente a
ser sujeita à agitação leve em contato com tampão acetato de sódio de 20 mM, pH 5,0
incluindo NaCl 1M, na proporção 1:2 (m/v) ao longo de 4 horas, nos sentidos de haver a
extração proteica. Logo depois, o material foi filtrado em tecido de nylon, centrifugado a 9000
x g, por 20 minutos, a temperatura de 4°C. A extração total foi sujeita à precipitação com
sulfato de amônia (40-100%) e conservado em repouso por 4 horas. Em seguida, a suspensão
foi centrifugada 9000x g, por 20 minutos, em temperatura de 4°C. O sobrenadante resultante
da precipitação (F 40-100%). Foi necessário retirar os 4 tubos do extrato de alga verde para a
retirada do pélete marrom. No Extrato sem sal fazendo a atividade lectina. No tubo eppendorf
(pequeno tubo) houve a mistura do extrato sem sal e do extrato aquoso de alga verde para a
pequena centrífuga que 900 rpm, por 5 minutos e sem marcar a temperatura.
5.1.3 - Atividade hemaglutinante
Foi realizado teste com atividade hemaglutinante que ocorreu com eritrócitos de
coelho a 3%, com ou sem tratamento enzimático, usando a enzimas papaína e tripsina(
AINOUZ,et.,al.1992). O procedimento de extração do Sangue do coelho sadio foi executado e
mantido no biotério do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Ceará. Foram
realizados ensaios em placa de microtitulação de 96 poços com fundo em “V”.
8
Em cada poço de placas de microtitulação adicionou-se 50 uL de NaCl a 1 M.
Adicionados posteriormente a partir do segundo poço, 50 uL da amostra em diferentes
concentrações procedendo-se às diluições seriadas onde no último 50 uL são desprezadas e
então são colocados 50 uL de sangue de coelho em cada poço. Após 30 minutos em repouso na
temperatura ambiente, são observados os resultados.
Tubos de ensaio Fração de
extrato sem sal
Fração de
extrato de alga
verde
Branco (Sangue
coelho)
1 com lectina com lectina Sem lectina
2 com lectina com lectina
3 sem lectina com lectina
4 sem lectina com lectina
5.1.4 - Preparo do reagente de Bradford, do BSA na curva padrão e ensaio de curva padrão
Todo o procedimento deve ser feito ao abrigo da luz:
Pesar o Coomassie e dissolver em 25 mL de álcool etílico, agitando até completa
dissolução. Em seguida adicione 50 mL de ácido fosfórico que 85%, e complete o volume para
500 mL com água destilada. Filtrar a solução duas vezes em filtro de papel.
Para a preparação da solução estoque de BSA, pesar 10 mg de BSA, dissolver em 1 mL
de água destilada até fazer a centrífuga de 9000 rpm por 10 minutos e preparar as seguintes
diluições.Distribua dez tubos de ensaio em uma estante, numerando-os 1 a 10. Utilizando as
micropipetas deacordo com volume pretendido, adicione água destilada, dissolvida em água
para concentração final de BSA e solução estoque BSA nas proporções sugeridas. Tabela na
proporção de componentes a serem distribuídos em tubos de ensaio para determinação da
curva padrão.
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Solução
estoque de
BSA
50 uL 100
uL
150
uL
200
uL
250
uL
300
uL
350
Ul
400
uL
450
uL
500
uL
Volume de
H2O
950
uL
900
uL
850
uL
800
uL
750
uL
700
uL
650
uL
600
uL
550
uL
500
Ul
Concentração
final de BSA
50 ug
mL
100
ug
mL
150
ug
mL
200
ug
mL
250
ug
mL
300
ug
mL
350
ug
mL
400
ug
mL
450
ug
mL
500
ug
mL
Todos os ensaios devem ser feitos em duplicata:
Adicionar em 100 uL de cada solução dos tubos 1-10 que 2,5 mL do reagente de Bradford, o
branco será 100 uL de água adicionar a 2,5 mL do reagente de Bradford. Realizar a leitura das
soluções em espectrofotômetro a 595 nm. O branco será o valor de referência. O valor final de
leitura será a média das duas absorbâncias para cada solução.
Prática 02: Extrato aquoso de esponja
5.2.1 - Extrato aquoso de esponja
9
Realizou-se o experimento com gral e pistilo, e a esponja usando um volume de água
destilada na proporção de 1:2, 100 g de esponja para 200 mL de água destilada num béquer de
127 gramas e béquer de 300 gramas. Adicionando a proveta de 250 mL e o béquer com extrato
de esponja macerando, então foi adicionado em outro béquer colorido outro componente
ficando uma coloração marrom-esverdeado. utilizando em outros dois tubos centrifugando
por 9000 rpm, de 20 minutos em temperatura de 4°C. em seguida, pegou uma proveta de 600
mL adicionou no béquer com extrato de esponja para fazer a maceração, após feito, foi
adicionado no béquer de 850 mL, finalizando com os quatro tubos de extrato aquoso de
esponja realizando a centrifugação a 9000 rpm, por 20 minutos, na temperatura de 4°C.
5.2.2 - Amostra coleta de sangue do coelho
Adicionar NaCl de 0,15 mL, numa seringa de hemofol para usar no coelho e absorver o
sangue do coelho para béquer de 10 mL para fração de XILOL.
5.2.3 - Dosagem de proteína pelo método de Bradford
No métodos de Bradford é permitido uma certa dosagem de proteínas numa
determinada amostra de sangue do coelho e extrato de algas verdes, sendo importante a
utilização de uma concentração subsequente nessas etapas, o ensaio de bradford tem por base
a cor azul brilhante de coomassie, neste método foi usado nas proteínas totais, o sangue do
coelho como padrão reagente. o reagente azul brilhante altera a absorbância de 280 nm para
595nm, provocando uma aparente mudança na coloração. reagindo do castanha para tons de
azul, de acordo com a concentração de proteínas.a observação da absorbância tem a
percepção a partir de 1 ug de proteínas e é elaborada no espectrofotômetro ou leitor de
microplacas, de forma que a intensidade da coloração seja proporcional à da amostra do
coelho. o mecanismo constitui-se em suceder uma leitura de diferentes concentrações como a
da BSA que elabora a curva padrão, por meio da equação da reta e cálculo da quantidade da
proteína presente. contrapondo o resultado com valores de concentrações distinta da curva
padrão aceita a determinação da concentração da proteína nas amostras em estudo realizado
as principais vantagens desse método são a sua rapidez, simplicidade e o fato de sofrer poucas
interferências.
Prática 03: Extrato aquoso de alga vermelha
4.3.1 - Preparar o extrato total e sulfato de amônia
Utilizou-se uma balança analítica de calibração com um béquer contendo alga
vermelha realizando o cálculo de equilíbrio que foi de 103,850g - 55,500g = 150ml
considerando o béquer de alga vermelha como solução tampão. Com auxílio do gral e pistilo
adicionou-se ao béquer alga vermelha e nitrogênio líquido sendo macerado com erlenmeyer.
Usou-se proveta de 250ml com erlenmeyer de 1 litro agitando a uma temperatura de 25°C
durante 4 horas para avaliar a cor de precipitação se é vermelha ou branca. Com erlenmeyer de
1 litro com alga vermelha adicionar ao béquer por meio de dois tubos levar a balança analítica
fazendo a centrifugação a 9000 rpm, durante 20 minutos em uma temperatura de 4°C.
Ao avaliar a centrífuga em relação a cor de precipitação a cor vermelha é menor
havendo a necessidade de tirar pigmento, adicionando o ácido clorhídrico de 3M, em béquer
com alga vermelha faz-se necessário o uso de pipeta para avaliar recomenda o medidor de pH
aufer a força eletromotriz do eletrodo de vidro combinado com eletrodo de calomelano,
10
através do botão de correção de temperatura e calibração avalia-se o pH que é 1,08 podendo
ser mais baixo. Durante o processo após 4 horas verifica-se o pH que é 1,08.
Ao avaliar o pigmento vermelho perde sua coloração, a coloração precipitada é um
pouco vermelha e branco depois de centrifugada. Adicione dois tubos através do béquer a alga
vermelha para testar na centrífuga a 9000 rpm, durante 20 minutos, em temperatura de 4°C.
Ao avaliar os dois tubos a precipitação do pigmento apresenta coloração rosa e vermelha.
6. Resultado e Discussão
Prática 01: Extrato aquoso de alga verde
6.1.1 - Avaliação dos tubos de ensaio
Muitas pesquisas têm sido reportadas em relação à capacidade de aglutinação de
extratos de algas verdes. Os compostos extraídos da microalga Codium Isthmocladum por
agitação em tampão acetato de sódio não apresentaram atividade hemaglutinante, diferente
daquele observado ao extrair, utilizando o mesmo tampão, aglutininas de diversas espécies de
microalgas. A faixa de aglutinação nos tubos de ensaio foram 2² e 24. Fração de extrato de alga
verde é atividade lectina com base de 24 nas 16 unidades de hemaglutinação, extrato sem sal
de 100 mL + 100 mL com base de 2² nas 4 unidades de hemaglutinação.
6.1.2 - Reação da curva padrão
Adicionar 100 uL da solução de proteína a 2,5 mL do reagente de Bradford, fazer a leitura em
595 nm após adição do reagente de 10 minutos, contra um branco contendo 100 uL do tampão
em que a sua solução proteica foi preparada e 2,5 mL de reagente.
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Fração
de
extrato
sem
sal
0,133 0,237 0,363 0,444 0,509 0,631 0,688 0,756 0,880 0,888
Fração
de
extrato
aquoso
de alga
verde
0,132 0,228 0,355 0,349 0,537 0,605 0,669 0,744 0,852 0,971
Verificou o extrato sem sal tem base de 210 por meio do tubo de ensaio pode ser utilizado a
fórmula de curva padrão sendo de 0,888
No extrato aquoso de alga verde tem base 210 por meio do tubo de ensaio pode ser utilizado a
fórmula de curva padrão sendo de 0,971
Fórmula: y = 0,0017x + 0,0705
> Extrato sem sal pela curva padrão de Bradford é 0,888
11
0,0017x = 0,888 - 0,0705
x = 0,8175 / 0,0017 = 480,88 ug/mL
0,480 mg/mL
> Extrato aquoso de alga verde pela curva padrão de Bradford é 0,971
0,0017x = 0,971 - 0,0705
x = 0,9005 / 0,0017 = 529,71 ug/mL
0,529 mg/mL
Prática 02: Extrato aquoso de esponja
6.2.1- Atividade hemaglutinante
Neste procedimento foi feita uma fração de amostra de extrato aquoso de esponja
levada a centrífuga a 90 rpm por cinco minutos. Com base nos dados da tabela adicionou-se a
pipeta a solução tampão, a fração do extrato aquoso de esponja de 127g e 300g a amostra do
sangue do coelho até completar avaliando por 30 minutos o tubo de ensaio da atividade da
lectina em nova proteína onde atividade hemaglutinante demonstrou a capacidade de
aglutinar os eritrócitos de coelho criando uma nova proteína de lectina com base nos dados da
tabela.
Tubos de ensaio Tampão + extrato
aquoso de esponja
de 300 g + amostra
do sangue
Tampão + extrato
aquoso de esponja
de 127 g + amostra
do sangue
Tampão + Amostra
do sangue
1 Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
Água destinada +
sangue coelho
2 Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
3 Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
Água destinada +
fração de esponja +
fraçãode sangue
coelho
4 Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
5 Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
6 Água destinada +
fração de esponja +
Água destinada +
fração de esponja +
12
fração de sangue
coelho
fração de sangue
coelho
7 Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
8 Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
9 Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
Água destinada +
fração de esponja +
fração de sangue
coelho
Base forte de 2² e Base fraca de 29
Base de 26 pelo 1 até 6 tubos de ensaio adicionar 100 mL + 100 tampão para nova proteína
lectina no extrato aquoso de esponja de 300 gramas.
Base de 26 pelos 1 até 6 tubos de ensaio adicionar 100 mL + 100 tampão para nova proteína
lectina no extrato aquoso de esponja de 127 gramas.
Base de 2³ pelos 7 até 9 tubos de ensaio não tem atividade lectina no extrato aquoso de
esponja de 127 gramas e 300 gramas.
6.2.2 - Reação da curva padrão de Bradford
Durante o procedimento foram utilizados seis tubos de ensaios, sendo 4 divididos com extrato
aquoso de esponja com 127g e 300g respectivamente, contendo extrato com sal e extrato
aquoso de alga verde de acordo com a tabela utilizando pipeta para a adição dos extratos nos
tubos de ensaio.
Tubos de
ensaio
Extrato
aquoso de
esponja de
127 g
Extrato
aquoso de
esponja de
300 g
Extrato
com sal
Extrato
aquoso de
alga verde
Branco
1 Tampão +
fração de
127 g +
Bradford
Tampão +
fração de
300 g +
Bradford
Tampão +
fração de
sal +
Bradford
Tampão +
alga verde
+ Bradford
Tampão +
Bradford
2 Tampão +
fração de
127 g +
Bradford
Tampão +
fração de
300 g +
Bradford
Tampão +
fração de
sal +
Bradford
Tampão +
alga verde
+ Bradford
3 Tampão +
fração de
127 g +
Bradford
Tampão +
fração de
300 g +
Bradford
Tampão +
fração de
sal +
Bradford
Tampão +
alga verde
13
4 Tampão +
fração de
127 g +
Bradford
Tampão +
fração de
300 g +
Bradford
Tampão +
fração de
sal
Tampão +
alga verde
5 Tampão +
fração de
127 g +
Bradford
Tampão +
fração de
300 g +
Bradford
Tampão +
fração de
sal
Tampão +
alga verde
6 Tampão +
fração de
127 g
Tampão +
fração de
300
Tampão +
fração de
sal
Tampão +
alga verde
Para o processo diluiu-se o filtrado da cultura-amostra com água destilada.
Na solução de água destilada de 100ml foi utilizada uma pipeta pequena, enquanto que em
250 ml de reagente de Bradford usou-se uma pipeta grande.
Verificou-se no tubo de ensaio de número 1 base forte de 2¹ com cor precipitada azul por meio
do extrato aquoso de 127g.
Nos tubos de ensaio de número 2 base fraca de 2¹ com cor precipitada verde pelo extrato
aquoso de alga verde.
Absorbância = absorção de luz
Absorvida – 280 nm para escolher com 595 nm
Curva padrão de Bradford pela absorção de luz com 595 nm:
Pequeno
tubo de
quadrado
Extrato
aquoso de
esponja de
127 g
Extrato
aquoso de
esponja de
300 g
Extrato com
sal
Extrato
aquoso de
alga verde
Branco
1 1,447 1,436 0,254 0,031 0
2 1,174 1,122 0,226 0,027
3 1,112 0,848 0,092
4 0,440 0,902
5 0,512 0,802
Observou-se que o extrato aquoso de esponja com 127g com base de 2³ não ocorreu aumento
da curva padrão enquanto base de 25 por meio do tubo de ensaio pode ser utilizado a fórmula
de curva padrão sendo de 0,512
No extrato aquoso de esponja de 300g com base de 2³ não ocorreu aumento da curva padrão
enquanto a base 25 por meio do tubo de ensaio pode ser utilizado a fórmula de curva padrão
sendo de 0,802
Fórmula: y = 0,0017x + 0,0705
> Extrato aquoso de esponja de 127 g pela curva padrão de Bradford é 0,512
0,017x = 0,512 - 0,0705
x = 0,4415 / 0,0017 = 259,71 * 32 = 8.310, 72 ug/mL
14
8,310 mg/mL
> Extrato aquoso de esponja de 300 g pela curva padrão de Bradford é 0,802
0,017x = 0,802 - 0,0705
x = 0,7315 / 0,0017 = 430,29 * 32 = 13.769,28 ug/mL
13,769 mg/mL
> Extrato com sal pela curva padrão de Bradford é 0,254
0,0017x = 0,254 - 0,0705
x = 0,1835 / 0,0017 = 106,18 * 2 = 212,36 ug/mL
0,212 mg/mL
> Extrato aquoso de alga verde pela curva padrão de Bradford é 0,031
0,0017x = 0,031 - 0,0705
x = -0,0395 / 0,0017 = - 23,24 * 2 = -46,48 que não vai ter microorganismo de mL
Não pode permitir a substituição pela curva padrão de Bradford
Prática 03: Extrato aquoso de alga vermelha
Ao usar a centrífuga utilizou dois tubos que foram adicionados alga vermelha do
béquer para realizar a medição do pH com ácido de sulfato de amônia, entrando em processo
de agitação magnética para pH de 7, na proveta de 20 5mL.
Sulfato de amônia com 472 g
472 g —------- 1 L
x g —----------- 205 mL (0,205 L)
x = 96, 76 g
Adicionar na balança analítica o béquer de sulfato de amônia de 96,76 g misturando com alga
vermelha realizando a agitação magnética observando a coloração precipitada que será branca.
15
7 - Conclusão
O referido trabalho em seus dados coletados nos permite relatar que é possível isolar
nova lectina e caracterizar parcialmente da alga marinha verde Codium Isthmocladum, sendo
coletada na costa litorânea do estado do Ceará. Observou-se que a forma metodológica
empregada neste trabalho foi primordial para que todo o procedimento realizado
estabelecesse a purificação e caracterização parcial da lectina presente nas algas Codium
Isthmocladum.
Para a forma experimental realizado em laboratório com extrato aquoso de esponja,
possibilitou compreender o processo experimental com o extrato aquoso utilizando materiais
adequados em laboratório em reação com a amostra do sangue do coelho, usando o método
de Bradford os materiais coletados passaram por um processo de centrifugação onde ocorreu
atividade aglutinante dando origem a uma nova proteína purificada.
No experimento extrato aquoso de alga vermelha possibilitou avaliar sua reação com
sulfato de amônia por meio da agitação magnética em uma centrífuga, utilizando materiais de
laboratório. Foram avaliadas as cores de precipitação dos pigmentos chegando por meio de
medição do medidor de pH em agitação magnética a coloração branca.