AULA PRÁTICA SOBRE TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDOS: DETERMINAÇÃO DO pKa e pl

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
DISCIPLINA CBS 01021 – QUÍMICA DE PROTEÍNAS
	
		
	AULA PRÁTICA Nº 3
TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDOS:
DETERMINAÇÃO DO pKa e pl
MARIA MANOELA REZENDE SEVERO
(00314741)
PORTO ALEGRE, 5 DE SETEMBRO DE 2019
INTRODUÇÃO
 Cada proteína existente, desde em organismos mais complexos até nos mais simples, é formada pela diferente combinação de vinte aminoácidos chamados comuns. Todos esses aminoácidos comuns são os α-aminoácidos, os quais possuem um grupo carboxila e um grupo amino ligados ao mesmo átomo de carbono. As diferenças entre esses vinte tipos estão nas suas cadeias laterais, que variam em tamanho, estrutura e carga elétrica.
 Os grupamentos amino e carboxila de aminoácidos, juntamente com os grupos ionizáveis R de alguns aminoácidos, funcionam como ácidos e bases fracos. Quando um aminoácido sem um grupo R ionizável é dissolvido em água com pH neutro, ele apresenta-se na solução como um íon bipolar, chamado zwitterion (“íon híbrido”), que possui caráter anfótero, podendo agir como ácido ou como base. Entretanto, em faixas extremas de pH, esses aminoácidos representarão espécies iônicas diferentes, o que demonstra que possuem no mínimo dois grupos que podem sofrer protonação (adição de próton) e desprotonação (perda de próton), dependendo do pH da solução em que se encontram. Como mostra a figura abaixo.
 
 Para descobrir a dissociação dos prótons de um aminoácido em solução, é usado o método da curva de titulação. Para construí-la, é necessária a realização da titulação, que nada mais é do que a adição ou remoção gradual de prótons através da adição de um ácido ou uma base, respectivamente. A curva de titulação corresponde ao gráfico dos valores de pH da solução em função do volume de base ou ácido adicionado. 
 A partir da curva de titulação é possível obter não só as constantes de dissociação dos grupos ionizáveis do aminoácido (Ka ou pKa; pKa = -log Ka), mas também o ponto isoelétrico (pI), representado pelo valor de pH onde o aminoácido assume carga líquida igual a zero. 
OBJETIVO
 A aula prática de número 3 teve como objetivo realizar a titulação de aminoácidos não ionizáveis, no caso da Glicina, e ionizáveis, no caso da Histidina e Glutamato.
PROTOCOLO
Cada trio receberá uma das soluções de AA e pipetará 10 mL em um frasco Erlenmeyer: i) Glicina ou ii) Glutamato ou iii) Histidina.
Fazer a primeira medição de pH (utilizando as fitas para medir pH) e anotar na planilha.
	OBSERVAÇÃO: Em cada bancanda, um trio ficará responsável pela titulação com uso da base (NaOH) e o outro trio com o uso de ácido (HCl). Observe na sua bancada se o seu trio utilizará HCl ou NaOH para a titulação.
Adicionar 0,5 mL do ácido OU base no Erlenmeyer contendo solução de Glicina e agitar com cuidado. 
Fazer a medição do pH mergulhando a fita na solução de Glicina e anotar o valor de pH na tabela abaixo.
Repetir passos 3 e 4 e até o volume final de base ou ácido adicionado ser igual a 6 mL.
	OBSERVAÇÃO: Não esqueça de anotar o valor do pH a cada adição de 0,5 mL de base ou ácido.
	
Caso o se trio tenha titulado a solução de Glicina da sua bancada (ou vice-versa).
Repita os passos de 1 a 6 com os aminoácidos Glutamato e Histidina, anotando os dados na tabela abaixo.
RESULTADOS
 Com a realização das titulações e a análise das fitas indicadoras de pH, obteve-se os seguintes resultados:
	 
	Valor de pH da Solução de Glicina:
	Valor de pH da Solução de Glutamato:
	Valor de pH da Solução de Histidina:
	Volume de ácido ou base adicionado (mL)
	Quando adicionar 
	Quando adicionar 
	Quando adicionar 
	Quando adicionar 
	Quando adicionar 
	Quando adicionar 
	
	HCl 0,1 N
	NaOH 0,1 N
	HCl 0,1 N
	NaOH 0,1 N
	HCl 0,1 N
	NaOH 0,1 N
	0 mL (pH inicial)
	5
	5
	3
	3
	5
	5
	0,5 mL
	3
	7
	3
	3
	3
	5
	1 mL
	3
	8
	3
	3
	3
	5
	1,5 mL
	3
	9
	3
	4
	2
	6
	2 mL
	2
	9
	3
	4
	2
	6
	2,5 mL
	2
	9
	2
	4
	2
	6
	3 mL
	2
	9
	2
	4
	2
	6
	3,5 mL
	2
	9
	2
	5
	2
	6
	4 mL
	2
	9
	2
	6
	1
	7
	4,5 mL
	2
	9
	2
	7
	1
	7
	5 mL
	2
	9
	2
	7
	1
	7
	5,5 mL
	1
	10
	2
	8
	1
	9
	6 mL
	1
	10
	2
	9
	1
	9
Fig. 1: Tabela com os resultados das titulações da glicina, do glutamato e da histidina.
 A seguir, estão os resultados obtidos nas fitas indicadoras de pH.
 
 Fig. 2: Fitas indicadoras de pH da Glicina. Fig. 3: Fitas indicadoras de pH da Histidina. 
 
 Fig. 4: Fitas indicadoras de pH do Glutamato.
 A construção de um gráfico (pH x [OH-]) para cada um dos três aminoácidos titulados necessita da realização dos cálculos que determinem qual a concentração do íon hidroxila em cada pH encontrado.
 De acordo com a literatura, o valor do produto iônico da água, obtido através do equilíbrio iônico da água, é: 
Kw = [H+].[OH-] = 1,0 x 10-14
 Assim, o produto [H+].[OH- ] em solução aquosa a 25ºC é sempre igual a 1,0 x 10-14. Quando existem concentrações iguais de H+ e de OH–, como na água pura, diz-se que a solução está em pH neutro. Nesse pH, a concentração de H+ e de OH– pode ser calculada a partir do produto iônico da água como se segue: 
Kw = [H+].[OH-] = 1,0 x 10-14
Kw = 1,0 x 10-14
[H+].[OH-] = 1,0 x 10-14
1,0 x10-7. 1,0 x 10-7 = 1,0 x 10-14
[H+] = [OH-] = 1,0 x 10-7
 Como as potências de 10 são números muito pequenos para se trabalhar, por convenção foi determinado que:
pH + pOH = 14
 Diante disso, a partir dos valores de pH encontrados com as titulações, é possível determinar as concentrações de íons hidroxila. Pois, se:
pH = 1
pOH= 13
pOH = -log [OH-]
13 = -log [OH-]
[OH-] = 10-13
Então:
	pH 
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	9
	10
	pOH 
	13
	12
	11
	10
	9
	8
	7
	6
	5
	4
	[OH-]
	10-13
	10-12
	10-11
	10-10
	10-9
	10-8
	10-7
	10-6
	10-5
	10-4
Fig. 5: Tabela que relaciona os valores de pH, pOH e concentração de OH.-
 Além disso, foram calculados os valores dos pontos isoelétricos (pI) para os três aminoácidos trabalhados, a glicina, a histidina e o glutamato.
 
- Glicina: Por ser um aminoácido com grupos R não ionizáveis, o seu pI é igual à média aritmética dos valores de pKa, encontrados na literatura, do grupo amina e do grupo ácido carboxílico.
pI = (pKa1 + pKa2) / 2
pI = (2,34 + 9,6) / 2
pI = 5,97
- Histidina: Por ser um aminoácido com cadeia lateral carregada positivamente, o seu pI será igual à média aritmética entre o pKa deste grupo e o pKa do grupo amina.
pI = [pKaR + pKa (NH3+)] / 2
pI = [6,0 + 9,17] / 2
pI = 7,59
- Glutamato: Por ser um aminoácido com cadeia lateral carregada negativamente, o seu pI será igual à média aritmética entre o pKa deste grupo e o pKa do ácido carboxílico.
pI = [pKaR + pKa (COO-)] / 2
pI = [4,25 + 2,19] / 2
pI = 3,22
 Com os dados definidos, torna-se possível a construção dos gráficos, como mostram as figuras 6, 7 e 8.
 
 
Fig. 6: Gráfico da titulação do aminoácido glicina. Apresenta zona de tamponamento ácido em rosa e zona de tamponamento básico em azul. Entre as áreas destacadas, está representado o ponto isoelétrico (pI) em preto.
 A partir da curva de titulação da glicina é possível obter algumas informações sobre ela. Primeiramente, pode-se observar os valores de pKa para cada um dos grupos ionizáveis que a compõem; 2,34 para o grupo carboxílico (COO-) e 9,6 para o grupo amino (NH3+). Além disso, essa curva de titulação fornece a informação de que a glicina possui duas regiões com poder de tamponamento. Uma delas, a zona de tamponamento ácido, estende-se por cerca deuma unidade de pH, o que determina que esse aminoácido é um bom tampão próximo a esse pH de 2,34. A outra região caracteriza a zona de tamponamento básico, em torno do pH de 9,6.
 Outra informação fornecida por esse gráfico é o ponto isoelétrico da glicina. No caso desse aminoácido, ele está representado exatamente no ponto de inflexão da curvas, com o valor de 5,97. A glicina tem uma carga final negativa em qualquer pH acima do seu pI e, portanto, irá se deslocar na direção do eletrodo positivo (o ânodo) quando colocada em um campo elétrico.Em qualquer pH abaixo do seu pI, a glicina tem uma carga final positiva e irá se deslocar em direção ao eletrodo negativo (o cátodo). Quanto mais distante for o pH de uma solução de glicina de seu ponto isoelétrico, maior será a carga elétrica final da população de moléculas de glicina.
 
Fig. 7: Gráfico da titulação do aminoácido histidina. Apresenta zona de tamponamento ácido em rosa e zona de tamponamento básico em azul. Entre as áreas destacadas, está representado o ponto isoelétrico (pI) em preto.
 A histidina é um aminoácido que apresenta grupo R ionizável, por isso a sua curva de titulação é mais complexa do que a da glicina, por exemplo. Ela possui três valores de pKa, correspondendo às três etapas possíveis de ionização. Por representar um maior número de zonas de tamponamento, na região do pH 2, pH 6 e 7, trata-se provavelmente de um aminoácido com características de um bom tampão ácido. O pKR considerado no gráfico, nada mais é do que o valor de pK desse grupo R ionizável. 
 O ponto isoelétrico da histidina, com dois grupos positivamente carregados quando protonados é de 7,59. 
	 
Fig. 8: Gráfico da titulação do aminoácido glutamato. Apresenta zona de tamponamento ácido em rosa e zona de tamponamento básico em azul. Entre 
as áreas destacadas, está representado o ponto isoelétrico (pI) em preto.
 Assim como a histidina, o glutamato apresenta grupo R ionizável, por isso a sua curva de titulação é mais complexa, com três valores de pka. Lembrando que o pK2 foi obtido através da literatura, pois nos experimentos realizados não foi alcançado esse valor. Por possuir três zonas de tamponamento, o glutamato representa um bom tampão básico.
 Referente ao ponto isoelétrico, representado entre os valores de pK1 e pKR, o glutamato possui um pI de 3,22, muito inferior ao da glicina. Isso ocorre devido à presença de dois grupos carboxila, que, na média de seus valores de pKa, contribuem para uma carga final de -1 que equilibra o +1 proveniente do grupo amina.
CONCLUSÃO
 A partir da aula prática de número 3, foi possível realizar a titulação dos aminoácidos glicina (não ionizável), glutamato e histidina (ionizáveis), e entender os seus funcionamentos quando em soluções ácidas ou básicas. O que consta na literatura sobre o caráter tamponante de aminoácidos foi confirmado, juntamente com os pontos isoelétricos quando se trata de aminoácidos ionizáveis ou não.
 REFERÊNCIAS
Nelson, David L. Princípios de Bioquímica de Lehninger/David L. Nelson, Michael M. Cox. 6ª Ed. Porto Alegre: Artmed, 2014.
Pamela C. Champe, Richard A. Harvey, Denise R. Ferrier Bioquímica Ilustrada 3ª Ed. Porto Alegre: Artmet, 2006.