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Curso Técnico em Biotecnologia 
Processos Bioquímicos
NOTA 8,4
	
Titulação de aminoácidos
Gabriele Mentz
Mara Iara Pedroso
Nathalia Gonçalves
Pâmela Stradolini
Profº. Dra. Alessandra Nejar Bruno e Dr. Leonardo da Silva Bittencourt
Porto Alegre, 06 de Setembro de 2019
INTRODUÇÃO	Comment by Leonardo: Introdução muito bem embasada! Sugestão: certos pontos desta introdução poderiam ser utilizados na discussão, pois estão bem completos no tocante a mecanismo. Sabe a ultima etapa da introdução onde consta a equação e a figura de uma titulação? Seria perfeito para embasar mais ainda a discussão! Ficaria muito elegante e ainda vocês poderiam utilizar o mesmo expediente para o gráfico de titulação obtido por vocês.
AMINOÁCIDOS
Proteínas são polímeros de aminoácidos responsáveis por controlar praticamente todos os processos que ocorrem dentro de uma célula. As proteínas de cada organismo, da mais simples das bactérias aos seres humanos, são construídas a partir do mesmo conjunto onipresente de 20 aminoácidos (Nelson e Cox, 2014). 
O fígado os utiliza para a síntese de proteínas séricas, bem como de suas próprias proteínas, e para a biossíntese de compostos nitrogenados que necessitam de aminoácidos precursores. Ele também pode oxidar aminoácidos ou convertê-los em glicose ou corpos cetônicos e desfazer-se do nitrogênio na forma de um composto não-tóxico, a uréia. (Smith e Colleen, 2007)
Cada um dos 20 aminoácidos possui um grupo amino e um grupo carboxila ligados ao mesmo átomo de carbono, o que os diferencia são suas cadeias laterais.
Figure 1 - estrutura geral dos aminoácidos - Fonte: Princípios de Bioquímica de Lehninger.
Em pH fisiológico (aproximadamente 7,4), o grupo carboxila encontra-se dissociado, formando o íon carboxilato, carregado negativamente (-COO-), e o grupo amino encontra-se protonado (-NH3+) (Harvey e Ferrier, 2012).
TITULAÇÃO
Titulação corresponde a um grupo de técnicas que são empregadas para a determinação quantitativa de múltiplas amostras. A titulação tem sido empregada para a determinação de constantes de equilíbrio, avaliação de processos de adsorção, quantificação de medicamentos, determinação de proteínas, avaliação de acidez, entre outros (Morales-Erazo et al. 2019).
A titulação de aminoácidos determina o pH onde ocorre a desprotonação dos grupos amino e carboxila. Ao adicionar ácido ao aminoácido, há o aumento do número de prótons e uma diminuição no pH. Assim, ao adicionar base ao aminoácido ocorre a diminuição do número de prótons e o pH aumenta.
A força de um ácido depende, na definição de Brönsted, da sua constante de equilíbrio ácido base em água, ou seja do seu valor de pKa. Ácidos mais fracos têm valores superiores de pKa. Nos aminoácidos, o grupo carboxíla é o representante ácido. A constante de equilíbrio é determinada pela estabilidade relativa do ácido e da base conjugada (Rosalin et al. 2016):
Figure 2 - Constante de equilíbrio e pKa - fonte: Vollhardt, Química Orgânica - Estrutura e função
Análogo ao pKa de ácidos, pode-se definir a constante de associação de uma base com um próton, o pKb. Nos aminoácidos, o grupo com caráter básico é o amino. Vale ressaltar que quanto menor o Kb – mais fraca é a base e seu pKb será maior.
Figure 3 - Equação pkb e relação pKa x pKb - Volhardt, Química Orgânica - Estrutura e função.
O pK corresponde ao pH em que há 50% de dissociação do ácido ou da base. Ponto isoelétrico, ponto isoeléctrico ou pI, é o valor de pH onde uma molécula, no caso, um aminoácido qualquer, apresenta carga elétrica líquida igual a zero. O pI é o pH no qual há equilíbrio entre as cargas negativas e positivas dos grupamentos iônicos de um aminoácido ou de uma proteína. (Volhardt et al. 2004).
Para calcular o pI, basta somar os pKs e dividi-los por 2 (fazer uma média aritmética simples).
Ao adicionar gradativamente quantidades pequenas de base sobre uma solução de alanina, medindo a cada adição o pH, obtém-se um gráfico relacionando o pH da solução em função do número de equivalente de OH adicionado, com uma curva com três regiões definidas: AB, BC e CD, conforme demonstrado na figura 4. Essas regiões representam as transformações iônicas que a molécula de alanina pode sofrer pela alteração do pH a que são submetidas a partir da adição de equivalentes em OH adicionados a um meio extremamente ácido.
Figure 4 - curva de titulação da alanina - bioquímica I Universidade Estadual de São Paulo
A região AB apresenta uma região de tamponamento e um ponto de inflexão onde encontra-se 50% da alanina totalmente protonada e 50% de alanina sem o próton do grupo carboxila, o pH nesse ponto representa o pK1 do aminoácido. Na região BC observa-se o ponto de inflexão em pH = 6,02 que representa o ponto isoelétrico (pI) do aminoácido. Nesse ponto 100% das moléculas de alanina encontram-se sem o próton da carboxila, portanto pI é o pH onde a carga elétrica da molécula é nula. A região CD é uma área de inflexão (pK2), onde 50% da alanina encontram-se sem o próton do grupo carboxila e sem o próton do grupo amina, portanto na forma aniônica, com carga elétrica negativa. A titulação é finalizada quando toda a alanina (100%) se encontra totalmente sem próton nos dois grupamentos ionizáveis da molécula (amina e carboxila).
A titulação de um aminoácido permite encontrar os pKa’s e o seu ponto isoelétrico, o que é característico de cada molécula. A determinação da forma iônica dos aminoácidos é importante em processos técnicos de separação e purificação dessas moléculas. Além disso, a forma iônica de um aminoácido é fundamental para a estrutura e atividade biológica das proteínas. Desta maneira, foi realizada a titulação de um aminoácido a fim de identificá-lo a partir de seus valores de pK’s.
OBJETIVO
Identificar aminoácidos utilizando os valores de pKs obtidos a partir de uma curva de titulação. 
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. MATERIAIS
- (20mL) Solução de aminoácidos desconhecido a 0,02M (preparados em água acidificada- 2 gotas de HCl conc). 
- (20mL) Hidróxido de sódio (NaOH) a 0,1 M 
- Soluções padrão para calibração dos potenciômetros
- Bureta com suporte
- Béquer de 100 mL
- Potenciômetro
3.2. MÉTODOS
Em um bécker de 100 mL foram adicionados 40 mL da solução de aminoácido desconhecido, pois 20 mL foram insuficientes para fazer a verificação do pH inicial. No potenciômetro previamente calibrado foi determinado o valor de pH 1,73 para esta solução.
Após, foi feita a ambientação da bureta de 50 mL com NaOH 0,1 por 3 vezes e ao final da ambientação foram transferidos 50 mL da solução titulante para a bureta e ajustado o menisco no zero para prosseguir com a titulação. Na titulação da solução de aminoácido foram adicionados de 0,5 a 0,5 mL de NaOH e a cada incremento de NaOH foi determinado e anotado na tabela o pH da solução até atingir o valor aproximado de 12,0.
Os valores obtidos na tabela foram inseridos no Excel para que fosse gerado o gráfico do comportamento da curva de pH em relação ao volume de NaOH. Em seguida, foram feitos os cálculos de pK e pI para entender o mecanismo dos aminoácidos quando o pH sofre alteração.
RESULTADOS E DISCUSSÃO	Comment by Leonardo: Discussão muito boa, senti falta da citação das figuras ao longo do texto para situar o leito, que parte do texto é ilustrada com a figura, entendem? 
Conforme os valores obtidos através dos cálculos de pK e pI, podemos chegar num valor de pI aproximado ao do aminoácido Glicina, pI 5,97 conforme a tabela.
A glicina tem a estrutura mais simples. Embora seja mais facilmente agrupada junto com os aminoácidos apolares, sua cadeia lateral muito pequena não contribui efetivamente para interações hidrofóbicas (Nelson & Cox, 2019).
A titulação ácido-base envolve a adição ou remoção gradual de prótons. Os dois grupos ionizáveis de glicina, o grupo carboxila e o grupo amino, foram titulados com uma base forte, o NaOH 0,1M (Nelson & Cox, 2019).
O gráfico tem duas fases distintas, que correspondem à desprotonação de dois grupos diferentesda glicina. Em pH muito baixo, a forma predominante da glicina é a forma totalmente protonada, +H3N－CH2－COOH. No primeiro estágio da titulação, o grupo －COOH da glicina perde o próton. No ponto médio desse estágio estão presentes concentrações equimoleculares do doador de próton (+H3N－CH2－COOH) e do aceptor de próton (+H3N－CH2－COO-) (Nelson & Cox, 2019). 
Para a glicina, o pH no ponto médio é 2,34, portanto seu grupo －COOH tem um pKa de 2,34. À medida que a titulação da glicina prossegue, outro ponto de inflexão é obtido, alcançando o pH 5,97, no qual a remoção do primeiro próton está completa e a remoção do segundo apenas começou. Neste pH, a maior parte da glicina está presente com um íon dipolar +H3N－CH2－COO- (Nelson & Cox, 2019).
O segundo estágio da titulação corresponde à remoção de um próton do grupo －NH3+ da glicina. O pH no ponto médio dessa fase é 9,60. A titulação fica completa em um pH de cerca de 12, no ponto em que a forma predominate de glicina é H2N－CH2－COO- (Nelson & Cox, 2019).
A partir da curva de titulação da glicina, é possível obter várias informações importantes. Em primeiro lugar, a glicina fornece uma medida quantitativa do pKa de cada um dos dois grupos: 2,34 para o grupo －COOH e 9,60 para o grupo －NH3+, sendo assim o grupo carboxila da glicina mais facilmente ionizado. Essa discrepância no pKa da glicina é causada principalmente pela proximidade da carga positiva do grupo amino do carbono alfa, um grupo eletronegativo que tende a atrair elétrons em sua direção. As cargas opostas estão estabilizadas, o pKa do grupo amino da glicina diminui em relação ao pKa médio de um grupo amino. O pKa de qualquer grupo funcional é muito afetado pelo ambiente químico em que se encontra. Esse fenômeno é explorado nos sítios ativos de algumas enzimas para proporcionar mecanismos de reação extraordinariamente adaptados. Esses mecanismos dependem da alteração de pKa de grupos doadores/aceptores de prótons de resíduos específicos (Nelson & Cox, 2019).
Outra informação importante que podemos obter através da curva de titulação da glicina é que esse aminoácido tem duas regiões com poder de tamponamento. Uma delas está na parte achatada da curva, estendendo-se por aproximadamente 1 unidade de pH de cada lado do primeiro pKa de 2,34, indicando assim o seu poder tamponante próximo desse pH. A outra zona de tamponamento está centrada em volta do pH 9,60 (Nelson & Cox, 2019).
Figura 5. Gráfico da curva de titulação do aminoácido glicina em relação ao volume de NaOH 0,1M (mL)	Comment by Leonardo: Não há necessidade deste título. A legenda já mostra o que o gráfico significa.	Comment by Leonardo: A legenda já está descrita.
Legenda:
Eixo Y: valores de pH do aminoácido titulado	Comment by Leonardo: Esta parte deve ser colocada no gráfico como título de cada eixo.
Eixo X: volume do titulante NaOH 0,1M
	Titulação de um aminoácido com NaOH a 0,1M
	Volume de NaOH (mL)
	pH 
	Volume de NaOH (mL) 
	pH 
	0
	1,73
	10,5
	4,96
	0,5
	1,76
	11,0
	7,93
	1,0
	1,79
	11,5
	8,78
	1,5
	1,82
	12,0
	9,16
	2,0
	1,88
	12,5
	9,39
	2,5
	1,92
	13,0
	9,53
	3,0
	1,96
	13,5
	9,65
	3,5
	2,02
	14,0
	9,77
	4,0
	2,04
	14,5
	9,87
	4,5
	2,12
	15,0
	9,98
	5,0
	2,13
	15,5
	10,08
	5,5
	2,14
	16,0
	10,16
	6,0
	2,45
	16,5
	10,29
	6,5
	2,35
	17,0
	10,40
	7,0
	2,50
	17,5
	10,53
	7,5
	2,63
	18,0
	10,66
	8,0
	2,71
	18,5
	10,71
	8,5
	2,83
	19,0
	11,01
	9,0
	3,01
	19,5
	11,17
	9,5
	3,22
	20,0
	11,37
	10,0
	3,55
	20,5
	11,57
Tabela 1. Tabela dos valores de pH do aminoácido glicina em relação ao volume de NaOH 0,1M	Comment by Leonardo: Legenda desta tabela na parte superior
Cálculo: 
	Comment by Leonardo: Sugestão: utilizem o recurso de equação do word. Ficaria bem elegante.
	Comment by Leonardo: Fiz ali para vocês terem uma idéia de como proceder.
CONCLUSÃO
No experimento foi utilizado o aminoácido glicina, a fim de saber qual sua curva de titulação, a partir da curva determinar em qual ph ocorreria o maior grau de tamponamento e onde estaria seu ponto isoelétrico.
Como a glicina é um aminoácido apolar, o pl está na zona de tamponamento, visto no gráfico que está em resultados e discussões. A partir dessa curva foi possível obter valores para os diversos pK e também aos pontos isoelétricos mostrando o quão importante se torna a analise destes gráficos. 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
MORALES-ERAZO, Laura V.; GONZALEZ-CARDENAS, Ivonne A.; ABELLA-GAMBA, Johanna P.  and  AHUMADA-FORIGUA, Diego A.. Técnicas de titulación ácido-base: consideraciones metrológicas. Rev.Colomb.Quim. [online]. 2019, vol.48, n.1, pp.26-34. ISSN 0120- 2804.  http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.quim.v48n1.72401.
ROSALIN, C. et al. Aminoácidos: estrutura e propriedades. Faculdade de ciências farmacêuticas. USP São Paulo, 2016.
Nelson, L.. Cox, M; Princípios de Bioquímica de Lehninger - 6. ed. – Porto Alegre : Artmed, 2014.
NELSON, David L.; COX, Michael M.; Princípios de Bioquímica de Lehninger - 7. ed. pg 79; 81 a 83 - Porto Alegre : Artmed, 2019.
Harvey, A., Ferrier, D; Bioquímica ilustrada - 5. ed. - Porto Alegre : Artmed, 2012.
Volhardt, K. et al; Química Orgânica – Estrutura e Função 6ª edição; 6ª edição, 2013.
Aula Prática – titulação de aminoácidos – Bioquímica I; Universidade Estadual de São Paulo.