relatório: Técnicas de conservação e coloração de amostras biológicas

Prévia do material em texto

Universidade Federal Fluminense 
Fundamentos Da Diversidade Biológica e Protistas 
Aluno: Jorge Luiz De Lima Vaccari 
Turma AB – Ciências Biológicas – Bacharelado 2019.2 
Relatório de aula prática 
Data: 05/09/2019 
Técnicas de conservação e coloração de amostras biológicas 
 
 
 
Introdução: 
Após a coleta de amostras, é necessário que haja conservação das mesmas, pois geralmente 
a análise é feita algum tempo depois da coleta e sofre decomposição devido a ação de 
microrganismos. Uma das vantagens das técnicas de conservação é o menor esforço 
necessário se comparada ao cultivo de seres, tornando-a uma alternativa mais viável. 
Muitas vezes a aplicação de corantes é necessária pois algumas amostras só podem ser 
observadas nessas condições. 
 
Conservação de amostras biológicas 
Qualquer amostra biológica está sujeita a decomposição e isso pode acarretar na perda 
dessas amostras devido a atividade microbiana. Partindo desse contexto, o que é 
conservação? Conservação é qualquer procedimento que impede ou retarda esse processo 
de decomposição e nos permite fazer a análise dessas amostras. Podemos dividir esses 
procedimentos em dois tipos: Físicos e Químicos. 
 
Métodos Físicos 
 Esse tipo de procedimento trabalha com a temperatura no desaceleramento ou 
interrupção da atividade metabólica dos microrganismos. É possível utilizar métodos de 
redução ou aumento de temperatura, levando a secura. Essas alterações podem ser leves, 
intensas ou extremamente intensas, que conforme aumenta-se o grau de alteração, 
consequentemente, seu grau de eficácia de eliminação de microrganismos é maior. 
 
 
1) Refrigeração - É um método físico mais prático e natural, onde geralmente as amostras 
são liquidas, e essas amostras possuem uma perspectiva de analise a curto prazo. Neste 
método trabalham-se temperaturas bem baixas (em torno de 5°C) e não há destruição de 
microrganismos, mas sim uma desaceleração de sua atividade metabólica, ou seja, ela 
retardada o processo de decomposição das amostras. Por outro lado, esse método só é 
eficiente por pouco tempo, sendo necessário que a análise seja feita rapidamente. 
 
2) Congelação - É um método onde o material permanece praticamente intacto. Nele 
trabalham-se temperaturas em torno dos -20°C, onde os microrganismos são mortos, 
porém a estrutura básica da amostra fica intacta. Nesse método não há a necessidade de 
analisar a amostra rapidamente. Mas esta técnica possui algumas falhas, o congelamento 
leva a formação de cristais de gelo dentro das células da amostra fazendo com que haja 
uma expansão e consequentemente rupturas que ocasionam em alterações morfológicas e 
químicas na amostra biológica. Por isso vale ressaltar que os métodos de conservação 
devem ser escolhidos de acordo com o que será analisado. 
 
3) Criopreservação ou criogenia - É um método onde se utilizam temperaturas 
extremamente baixas (algo em torno de -150°C). Existem dois recursos importantes na 
utilização desta técnica, o primeiro é o uso de freezers científicos, que podem alcançar 
temperaturas baixíssimas e o prazo de conservação é indeterminado. Como a qualidade da 
conservação de amostras depende de uma fonte de energia eficaz, são instalados geradores 
como forma de precaução a possíveis casos de perda de energia. 
 O segundo recurso é o uso de botijões criogênicos, que usam nitrogênio líquido, chegando 
a -196°C. Esse recurso não danifica as amostras, deixando as mesmas vivas e viáveis para 
utilização, se seguirmos os procedimentos corretamente. 
 
 
 
 
Fotos de um botijão criogênico cedidas pelo professor Sérgio O. Lourenço 
Um importante detalhe para esse recurso de conservação em especifico é a disponibilidade 
de nitrogênio. O nível de nitrogênio no botijão tem que estar cobrindo as amostras para 
total conservação das amostras. 
Para a utilização desse método devem ser seguidos vários procedimentos protocolares: 
- As amostras devem ser colocadas em recipientes especiais que suportem essa 
temperatura, por isso são utilizados o s tubos criogênicos, que são feitos de um material 
plástico nobre chamado de polipropileno; 
- Além disso elas devem estar em pequenos volumes, (células em suspensão, fragmentos de 
tecido); 
- Há também a utilização de crio protetores, que é uma substância utilizada para proteger o 
tecido biológico de danos de congelamento. Podem ser usados metanol, sais de manganês 
ou glicerol, para a extração do excesso de água nas células, por exemplo 
-Nesse processo é preciso adicionar substancias que irão desidratar as células, em seguida 
diminuir a temperatura em níveis consideráveis para aí então serem levadas para dentro do 
botijão criogênico. E Depois de retiradas dessas conservas, deverão ser reidratadas. 
Esses protocolos são muitos específicos e devem ser feitos cuidadosamente, variando de 
acordo com a natureza das amostras. 
 
 
 
 
 
4) A vitrificação - é um método utilizado em que o citoplasma da célula fica no estado 
sólido, contribuindo assim para sua conservação. Vale a pena destacar que isso só acontece 
se a célula for desidratada e depois levada a temperaturas ultrabaixas. Ela fica em um 
estado de extrema rigidez, mas não é danificada, suas funções vitais ficam intactas. Como se 
o tempo e seu metabolismo “parassem” 
5) Secagem em estufa – Se resume a elevar a temperatura das amostras em uma estufa, em 
cerca de 50°C para a retirada da umidade, tendo em vista que esse método não retira 100% 
da umidade. Usando a estufa para secar o material, ocorre uma alteração da textura, 
morfologia e química da amostra, além de matá-la. O tempo de preservação desse método 
é longo, podendo chegar a 3 anos. 
6) Liofilização - É um método que retira 100% da umidade da amostra não alterando-a 
quimicamente. O processo consiste em submeter a amostra a uma temperatura entre -50°C 
e -60°C, congelando-a e puxar o ar do compartimento criando um vácuo, assim toda a água 
é retirada, pois ocorre a sublimação (passa do estado sólido diretamente para o gasoso) e 
fica retida no outro compartimento. O processo requer mais tempo para ser realizado e 
pode durar até 24h, matando a amostra, porém o tempo de conservação é indeterminado. 
A liofilização é muito utilizada nos dias atuais para produzir alimentos liofilizados, tendo 
valor comercial. 
 
Foto da imagem de um liofilizador tirada durante a aula prática ministrada pelo professor Sérgio O. Lourenço 
 
 
 
 
 
7) Exsicatas – A herborização de exsicatas é um método que consiste na retirada da umidade 
em estufas, geralmente é usada uma amostra maior, presa em uma folha de papel contendo 
suas informações. Essa exsicata deve ficar na horizontal e tem seu tempo de conservação 
indeterminado. A escrita deve ser feita a lápis ou com uma caneta especial. Já que o papel 
terá contato direto com a água, ficando submerso, podendo borrar algo se escrito com 
caneta esferográfica. 
 
Exsicata sendo preparada durante a aula prática. Imagem cedida pelo professor Sérgio O. Loureço 
 
Depois das amostras serem devidamente coletadas, devemos seguir para o processo de 
herborização, que é uma técnica extremamente especial em que fazemos uma peça do 
material coletado ser aderida e prensada numa peça de papel. Feito isso, o material deve 
passar por uma secagem, para só assim serem incorporadas nos acervos dos herbários 
(ambientes com temperatura extremamente controladas para a preservação e conservação 
de exsicatas) 
 
Métodos Químicos 
Já os métodos químicos são aqueles em que há adição de substâncias que vão inibir o 
crescimento e o desenvolvimento de microrganismos. Nesses processos, a decomposição 
fica muitalenta ou até mesmo é interrompida. 
 
 
 
Formaldeído - Uma forma de conservação química é a utilização de um formaldeído, mais 
conhecido popularmente como formol (CH2O). Ele consiste em um gás extremamente 
volátil e ativo, produzido a partir do metanol, que é comercializado em forma líquida 
(misturado à água e álcool) para tornar seu manuseio mais prático. Seu preço é bem mais 
barato em comparação aos outros materiais, mas um contato constante pode causar danos 
à saúde, doenças cardiorrespiratórias ou até mesmo câncer. 
 
Foto de um vidro contendo formaldeído, cedida pelo professor Sérgio Lourenço, 2019 
 
A aplicação d esses produtos também variam de acordo com a natureza das amostras. 
Amostras menores precisam de concentrações mais baixas, enquanto as maiores 
necessitam de concentrações mais altas. 
O tempo de conservação é indeterminado, dependendo apenas de algumas variáveis, como 
a abertura dos frascos onde se encontram as amostras, renovação de substancias, etc. 
Quando falamos de substancias químicas, existe também o fator de fragilidade. Algumas 
amostras não combinam com determinados elementos, e podem acabar levando a 
danificação das mesmas. Amostras com carbonato de cálcio por exemplo reagem 
diretamente com o formol 
Cloreto de Mercúrio (HgCL2) - É um conservante extremamente eficiente, porém muito 
tóxico e perigoso, devido a sua solubilidade em água, sendo ainda um material caro 
 
 
 
Imagem de um recipiente contendo cloreto de mercúrio, retirada da internet 
 
Lugol - É uma solução conservante que possui variações em sua formula e não é toxico para 
o manipulador. Essa solução também age como corante, realçando cores e é considerado 
caro. O lugol é volátil, sublimando quando deixado aberto, e mata as amostras. Lugol é uma 
mistura envolvendo iodo, iodeto de potássio e água destilada 
 
Foto de um recipiente contendo lugol, cedida pelo professor Sérgio Lourenço 
 
 
 
 
O Glutaraldeído - É uma substancia usada na conservação química de amostras, sendo ela 
volátil, podendo causar danos à saúde devido a sua toxicidade, sendo necessária proteção 
ao manipular a substancia, evitando contato com a pele e inalar o vapor. O material é 
considerado caro em relação aos outros conservantes e bem parecido com o formaldeído. É 
usado também como desinfetante bactericida contra bactérias gram positivas e gram 
negativas, sendo também eficiente para proteger a amostra de alguns fungos e vírus 
 
Foto de um frasco contendo glutaraldeído, imagem cedida pelo professor Sérgio Lourenço 
 
Glicerina - É um conservante que desidrata as células, dificultando a analise morfológica, e 
tem um preço elevado. Algumas bactérias são capazes de consumir essa substância, 
podendo comprometer a amostra 
 
Imagem de um frasco contendo Glicerina, imagem cedida pelo professor Sérgio Lourenço 
 
 
Técnicas de coloração e uso de corantes 
Uso de corantes 
Algumas amostras são muito pálidas e por isso precisam ser coradas para uma melhor 
análise. Os corantes, são substâncias que absorvem certos comprimentos de onda da luz 
visível e têm afinidade por determinados constituintes celulares. Esses corantes atuam 
fixando-se eletiva ou seletivamente em determinadas estruturas celulares, ligando-se com o 
peptidoglicano, reagindo com carboidratos, interagindo com substâncias ácidas da célula, 
conferindo a elas diferentes graus de absorção de luz incidente. Esses corantes utilizados 
podem ser divididos em Vitais e Não-vitais. 
 
Os corantes vitais normalmente são aplicados em materiais vivos e não matam os 
organismos, pois se ligam a eles quimicamente durante apenas um certo período de tempo. 
Temos como exemplo o azul de metileno, que normalmente é utilizado para observação de 
protozoários. Já os corantes não-vitais fazem essas ligações químicas permanentemente, 
levando assim à morte do material biológico. A utilização desses corantes deve ser feita em 
lâminas permanentes. 
Existem diversas técnicas que podem ser utilizadas para a confecção dessas lâminas e estas 
diferem principalmente na escolha da substância utilizada na infiltração e suas 
particularidades. Depois do material ser coletado, ele deverá ser fixado, usualmente em 
soluções de FAA 70º ou glutaraldeído, e desidratado. Depois disso passará por processos de 
infiltração e inclusão, que tornarão a amostra resistente para suportar os impactos 
provenientes do processo de seccionamento. Para seccionar o material no micrótomo é 
preciso unir o material a um bloco de madeira que servira de apoio. Depois de todas essas 
etapas, a amostra irá para o micrótomo, equipamento essencial para a montagem de 
lâminas, que secciona as amostras nas espessuras corretas. Depois e seccionadas as 
amostras estão prontas para coloração e montagem nas lâminas. (UFSC, 2015) É importante 
ressaltar que elas devem ser preparadas previamente e só depois de o material estar 
completamente aderido à lâmina adiciona-se os corantes. Foi apresentada uma lâmina 
contendo uma amostra de sangue corado para ver um protozoário incolor. Além disso o 
professor e plicou que existem técnicas para a preparação dessas lâminas, tais como: 
 
 
1) O Espalhamento - Erroneamente chamado de esfregaço, consiste em promover uma 
raspagem das camadas superficiais de membranas mucosas com uma pequena espátula ou 
palitos e, posteriormente deslizar esse material raspado sobre a superfície limpa de uma 
lâmina. 
 
 Exemplo de técnica de esfregaço 
 
2) Imprint - Técnica consiste em pegar uma goto do material, e com o auxílio de um bastão 
dar leves batidas na lâmina. 
3) Corte Histológico - Essa técnica consiste em cortar um pedaço pequeno geralmente de 
algo muito maior. O corte é feito em fatias extremamente finas para que seja melhor 
analisado no microscópio. Para que o corte seja possível, o material é submetido a um 
tratamento que torna essas células mais rígidas, normalmente é utilizada a parafina que 
endurece, servindo de apoio para o corte nos micrótomos. 
 
 
Alguns dos corantes citados na aula prática apresentados a turma. Da esquerda pra direta 
temos o Rosa de bengala, Fucsina e Eosina com azul de metileno 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Referências bibliográficas 
BEATRIZ, A., ARAÚJO, Y., & DE LIMA, D. (2011). Glicerol: um breve histórico e aplicação em sínteses 
estereosseletivas. Química Nova, vol. 34, nº2. 
CAPUTO, L., MOTA, E., & GITIRANA, L. (s.d.). FIOCRUZ. Fonte: 
http://www.epsjv.fiocruz.br/sites/default/files/capitulo_4_vol2.pdf 
GONÇALVES, R. (10 de março de 2011). Biomedicina Brasil . Fonte: 
http://www.biomedicinabrasil.com/2011/03/esfregaco-sanguineo.html 
INCA. (s.d.). INCA. Fonte: http://www1.inca.gov.br/conteudo_view.asp?ID=795 
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - USP. (s.d.). Introdução aos métodos de estudo da célula. 
Fonte: BIO-0206 - Biologia Celular: http://dreyfus.ib.usp.br/bio206/Apostila%20Pratica%20BioCel.pdf 
FIDALGO, O. & BONONI, V. L. R. Técnica de coleta, preservação e herborização de material 
botânico. Capítulo 1 (Série Documentos) São Paulo. 62p. 1989 
MARTINS, M. I., & JUSTINO, R. (janeiro/março de 2015). Colégio Brasileiro de Reprodução 
Animal. Fonte: CBRA: http://www.cbra.org.br/pages/publicacoes/rbra/v39n1/pag136-140%20(RB563).pdf 
TOBOGA, S., & VILAMAIOR, P. (2007). A célula (2 ed.). Brasil: Manole. Acesso em 17 de maio de 2016 
UFSC. (25 de janeiro de 2015). Laboratório de Anatomia Vegetal. Fonte: Universidade Federal de Santa 
Catarina: http://laveg.paginas.ufsc.br/roteiro-ilustrado/material-e-metod