CONGELAMENTO DE SÊMEN EQUINO

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CONGELAÇÃO DE SÊMEN EQUINO – 
Por Lilian Ferrari 
 
COLHEITA E AVALIAÇÃO DO SÊMEN: 
 
• Preparação do laboratório 
• Aquecer diluentes a 37oC – banho maria 
• Montagem da vagina artificial 
• Lavagem do pênis e secagem 
• Colheita do sêmen 
• Manipulação no laboratório 
• Aspecto e volume 
• Diluição do sêmen 
 
- Quando fazemos o congelamento de sêmen o ideal 
é usar o ejaculado todo para fazer um nenhuma de 
palhetas que compensa o gasto do congelamento. 
 
Análise física: 
 
•Aspecto 
•Volume – medir na proveta 
•Motilidade 
•Vigor 
•Concentração 
 
Motilidade e vigor 
Concentração: 
• Diluição 1 : 20 (1 gota sêmen : 19 gotas de 
água) 
Concentração espermática 
 
- Se não conhecer o sêmen tirar uma amostra para 
avaliar patologia. 
- Portanto, separa amostra para concentração, separa 
amostra para patologia e o mais rápido possível 
acrescentar diluente no sêmen (1:1) – assim os sptz 
estão protegidos por uma hora para que seja possível 
ser feita as contas. 
- Saber o volume para saber o quanto de diluente 
colocar. 
- Avaliar volume, motilidade, vigor. 
E da amostra que diluímos 1:20, 1:100 ou 1:200 
dependendo da espécie, vamos contar na camara de 
neubauer e saber a concentração. 
- A partir disso, já temos todos os dados para ser feito 
os cálculos. 
- Sabemos que vamos congelar o sêmen e o padrão 
de congelamento de sêmen é 100 milhões de 
espermatozóides por palheta 
 
CÁLCULO DOS SPTZ MÓVEIS: 
 
DOSE / PALHETA: 100 X 10 6 SPTZ 
 
VOLUME: 50 ML 
 
CONCENTRAÇÃO: 100 x 10 6 sptz/ml 
 
MOTILIDADE: 80% 
 
SPTZ TOTAIS: 50X100= 5.000 x 106 
 
NÚMERO DE PALHETAS: 5.000 x 106 
/ 100 x 106 = 50 PALHETAS 
 
- Primeiro passo: chegar em um número total de 
espermatozóides – VOLUME X CONCENTRAÇÃO 
Lembrando – sêmen fresco e refrigerado fazemos a 
dose em cima de espermatozóides moveis. No caso 
do congelamento de sêmen, se a qualidade do sêmen 
for boa vamos congelar da forma que ele se encontra, 
ou seja, tudo será congelado, até a porcentagem de 
mortos (por isto o calculo é feito em cima de 
espermatozóides totais) – porque em cima de moveis 
não terá padrão por palheta por causa da motilidade. 
 
- Segundo passo: se tem a quantidade total de 
espermatozóides, dividir pela quantidade que vai em 
cada palheta, e temos o total de quantidade de 
palhetas (com 100 milhões de espermatozóides por 
palheta). 
 
NA LOUSA – PARA CADA ESPÉCIE: 
 
CÃO, EQUINO, SUÍNO E PEQUENOS 
RUMINANTES – Congelar sêmen com 100x10 6 
sptz/palheta. 
 
TOURO – 50 x 10 6 sptz/palheta 
 
 
- A fertilidade da vaca em relação a outras espécies, 
então a quantidade de espermatozóides totais na 
palheta para inseminá-la é muito menor também. 
 
- Quanto mais mexemos no espermatozóide, mais 
lesionamos ele. 
- o SÊMEN CONGELADO nunca será igual o fresco e 
o refrigerado. 
 
- Terceiro passo: chegar no número de palhetas 
(depende da espécie em que se esta congelando). 
Por exemplo, se no calculo anterior se a espécie 
fosse um touro, quantas palhetas seriam possível 
fazer? 5.000 x 106 / 50 x 106 = 100 palhetas 
 
 
Análise morfológica: 
 
Técnicas de Preparação úmida: 
• Contraste de Fase 
• DIC (Microscopia de Contraste de 
Interferência Diferencial 
 
Esfregaço Corado: 
•Eosina-Nigrosina 
•Rosa Bengala 
•TripanBlue / Giemsa 
•Willian’s, Panótico, Karras modificado, Ceroviski 
 
- Analise morfológica: se anteriormente foi feito o 
andrológico do animal não é necessário fazer 
novamente, mas se não foi feito é necessário fazer. 
 
CONGELAÇÃO DE SÊMEN 
 
INTRODUÇÃO: 
 
VANTAGENS: 
-Facilidade de comercialização – além de poder 
armazenar, pode importar ou exportar o sêmen para 
outros países, pode usar sêmen de reprodutores de 
outros países. 
-Agilidade no transporte/ baixo custo 
-Previne possíveis acidentes 
-Banco genético para proprietário – uma das 
principais vantagens do sêmen congelado, guardar 
sêmen de reprodutores de boa genética. 
-Ganho genético para a raça 
-Estação de monta (hemisférios / provas) 
-Maior controle da transmissão de doenças 
 
Quantas palhetas??? 
 
Calcular: 
•Total sptz 
•Número de palhetas – bovinos (divide por 50 
milhões) e outras espécies (divide por 100 milhões); 
•Volume de sptz + Meio de Congelação – calcular o 
volume que vamos acrescentar no meio de 
congelação dos espermatozóides para encher as 
palhetas. 
 
EXEMPLO LOUSA: 
- No exemplo anterior calculamos: 
 
DOSE / PALHETA: 100 X 10 6 SPTZ 
 
VOLUME: 50 ML 
 
CONCENTRAÇÃO: 100 x 10 6 sptz/ml 
 
MOTILIDADE: 80% 
 
SPTZ TOTAIS: 50X100= 5.000 x 106 
 
NÚMERO DE PALHETAS: 5.000 x 106 
/ 100 x 106 = 50 PALHETAS 
 
Como calcular o volume para encher as palhetas? 
 
- Em cada palheta (exceção bovinos) vamos utilizar 
palhetas de 0,50 (meio/ 0,5 ml) – lembrando que há 
dois tipos de palhetas (0,5 e 0,25 ml). 
 
- Todas as espécies de formos congelar com 100 
x 106 (100 milhões) = usa palheta de 0,5 ml. 
 
- Calculo, se precisamos de 0,5 ml para encher cada 
palheta, se for fazer 50 palhetas = 50 palhetas x 0,50 
ml. Mas quando vamos envasar estas palhetas tem 
uma quantidade de liquido que vai a mais para 
embeber a bucha de algodão que vai no fundo da 
palheta e o gel para lacrar a palheta e o sêmen ficar 
preso (isto da uma quantidade de 10% a mais – de 
sêmen que será perdido). Assim, quando formos 
calcular o volume para ser feito 50 paletas por 
exemplo, acrescenta ao calculo os 10% de perda. 
Assim o calculo vai ser : 50 palhetas x 0,55 ml 
(acrescentado 10% de 0,5 de perdas) = 27,5 ml 
(solução de 0,5 de congelação + espermatozoide até 
chegar a um volume de 27,5 ml e encher 50 
palhetas). 
 
- Este calculo pode ser feito de forma diferente: 50 
palhetas x 0,5 ml = 25 ml + 2,5 ml (10% de 25 ml) = 
27,5 ml. 
 
- Vamos pegar o sêmen nessas espécies (exceção 
pequenos ruminantes), no cão e suíno que tem 
volume de ejaculado alto porque tem bastante liquido 
seminal (cão ejacula em torno de 10-15 ml; cavalo 
ejacula em torno de 30-100 ml; suíno 200- 300 ml). 
Assim este plasma seminal não vai no congelamento, 
nessas espécies – cão, suíno e equino é necessário 
centrifugar o sêmen, jogar o plasma seminal fora e o 
diluente que usamos para avaliar o semen, para 
depois acrescentar o meio de congelação. 
 
- Cão, eqüino, suíno, coloca o diluente (1:1), faz todas 
as analises, fazer cálculos, centrifugar o sêmen e tirar 
plasma seminal e diluente de manutenção e 
refrigeração. Sobra no fundo um pelet com 5 bilhões 
de espermatozóides (como no exemplo usado), então 
pegamos o meio de congelação que calculamos o 
volume e vamos acrescentar este meio nos 
espermatozoides até chegar ao volume de 27,5 ml 
(VOLUME TOTAL DE ESPERMATOZOIDES + MEIO 
DE CONGELAÇÃO = 27,5 ml). 
 
- Em caso de ruminantes não é necessário centrifugar 
o ejaculado porque não tem plasma seminal. Aquele 
primeiro diluente de conservação, se for congelar o 
sêmen, já adiciona 1:1 o meio de congelação para 
não precisar centrifugar e jogar o meio fora. 
 
EXEMPLO LOUSA – EJACULADO DE TOURO 
(BOVINO): 
 
VOLUME: 8 ml 
- Acrescentar 8ml de meio de congelação (1:1) 
- Volume = 16 ml 
- Fazer a avaliação 
- Total de espermatozoides = 5.000 x 106 
- Bovinos = 50 x 10 6 sptz/palheta 
- Palheta de 0,25 ml + 10% de perda 
- Calculo: 5.000 x 106 / 50 x 10 6 = 100 palhetas 
- 100 palhetas x 0,25 ml + 10% de 0,25 ml 
- 100 palhetas x 0,025 = 27,5 ml 
- 27,5 ml – 16 ml = 11, 5 ml acrescentar de meio de 
congelação 
- Total de 27,5 ml para preencher 100 palhetas de 
0,25 ml cada. 
 
Palhetas: 
 
•Tipos:0,50 
•Descrição: deve ser feito antes de encher as 
palhetas: 
•Nome do animal 
•Raça 
•Número de registro 
•Partida – consegue diferenciar o ejaculado do animal 
pela partida, cada ejaculado congelado será uma 
partida diferente e no final do congelamento, vamos 
descongelar uma palheta e fazer a analise dela e ela 
vai ser a analise dessa partida especifica. Fazemos 
isto porque o animal pode ter uma variação enorme, 
pode ter animais que tem sêmen congelado de 10 
anos atrás, portanto, devemos avaliar o sêmen atual 
para avaliar se houve modificações.Pela analise da 
partida vamos saber se devemos usar um numero 
menor ou maior de palhetas. 
A partir do momento que descongelamos uma partida 
para analisar, não é necessário descongelar outras 
para analisar, pois as demais estarão iguais. 
- Cada ejaculado é uma partida diferente. 
 
➢ Teste com diluentes – cada animal tem um 
diferente, é individual. Para o processo de 
congelamento é interessante saber qual o 
diluente de manutenção para o individuo, pois 
se usar o diluente que o sêmen fica melhor, 
com toda certeza ele vai ir melhor para ser 
congelado depois. O meio de congelação é 
definido, não tem que testar, o que precisa 
testar é o meio que coloca antes pois este 
pode fazer a diferença. 
O tempo que o diluente fica em contato com o 
sêmen, se ele tiver uma composição que 
melhora algumas deficiências da membrana 
do espermatozoide, ele vai melhorar e 
proteger a membrana dos espermatozóides 
no processo de congelação. 
 
➢ Centrifugação do sêmen – nas espécies com 
exceção dos ruminantes, depois que fizermos 
as contas e chegarmos no total de palhetas, 
volume de meio de congelação para adicionar 
no sêmen. Vamos centrifugar o sêmen, jogar 
o sobrenadante fora e acrescentar o meio de 
congelação. Lembrando que ruminantes esta 
etapa não vai ter – que ele já tem dose 
pequena então só vamos acrescentar o meio 
de congelação. 
 
➢ Uso do sperm filter – sempre usamos quando 
não puder centrifugar, como por exemplo se 
for um animal que quando centrifugamos o 
sêmen lesiona. 
 
➢ Pellet de espermatozóides – o que sobra de 
espermatozóides após centrifugação. 
 
Próximas Etapas 
 
•Adicionar o Meio de congelação no pellet até 
chegar no volume calculado. 
•Análise do sêmen pós-centrifugação – uso de 1 
gota no preparado, olhar no microscópio para ver se a 
centrifugação não lesionou o sêmen. 
•Envasamento das palhetas – encher as palhetas 
•Confecção da bolha de ar na palheta – toda 
palheta esta cheia, precisamos fazer uma bolha de ar 
de meio centímetro aproximadamente, porque 
quando formos congelar, todo liquido quando 
congelamos expande, se não deixar a bolha de ar a 
palheta estoura na hora de congelar ou na hora de 
descongelar. 
•Fechamento das palhetas – com esfera de metal 
ou álcool polivinílico (onde encosta no sêmen o 
mata), máquina que lacra. 
 
➢ Adicionando Meio de Congelação 
 
➢ Análise da Motilidade e Vigor 
 
➢ Envasando as palhetas 
 
➢ Confecção da bolha de ar 
 
➢ Lacrando as palhetas 
 
➢ Congelamento de Sêmen – pode ser feito em 
dois sistemas – ou na máquina digital ou no 
isopor (artesanal). 
- Primeiro passo: 
- Vai precisar ser feito 3 curvas: uma CURVA DE 
REFRIGERAÇÃO (palhetas vão sair de uma 
temperatura ambiente e vão até 5Oc), uma CURVA 
DE ESTABILIZAÇÃO (elas vão ficar por um período 
de tempo a 5oC) e uma CURVA DE CONGELAÇÃO 
(que vai de 5oc até 126 Oc). 
 
• Desenho da curva: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
- Todo congelamento, em qualquer espécie tem que 
passar por estas 3 curvas. 
- Quando iniciamos a refrigeração, o laboratório já 
esta com ar condicionado ligado, pois quanto menor a 
temperatura ambiente que as palhetas se encontram, 
melhor a refrigeração. 
- Na curva de congelação, quando o sêmen chega a 
temperatura de – 30 graus percebemos que o sêmen 
começa borbulhar e ocorre a cristalização e 
vaporização do nitrogênio, ou seja, o sêmen passa do 
estado liquido para o estado sólido. 
- (-126 graus é a temperatura para congelamento). 
 
- Segundo passo: quando o semen chegar a -126 
graus, nos vamos mergulhar essas palhetas no 
botijão de nitrogênio liquido e tampar. No botijão 
dentro do nitrogênio liquido o sêmen vai ficar em uma 
temperatura entre (-190 a – 196 graus) – que é a 
temperatura de armazenamento congelado. 
 
- Essa curva vai depender muito do sistema que 
vamos utilizar: se utilizarmos o sistema da maquina 
digital (o melhor) – porque a maquina já é 
programada (tem varias curvas) – essa maquina tem 
curva para bovino, eqüino, ovino, caprino e cachorro. 
Quando a maquina chegar a 5 graus ela apita um 
alarme e para nos 5 graus – assim anotamos com 
quanto tempo esta (temperatura não abaixa – fica 
estabilizado nos 5 graus). Assim vamos contar no 
relógio e deixar o tempo de estabilização necessária 
em 5 graus. 
- Tempo de estabilização varia entre os animais: 
no eqüino deixamos aproximadamente 10-15 minutos 
estabilizando, porque o meio de congelação que 
colocamos para o eqüino, se deixar mais de 20 
minutos começa ser prejudicial para os 
espermatozóides. O cachorro devemos deixar 1 hora 
estabilizando. E o bovino devemos deixar 4 horas 
estabilizando. 
 
- Quem não tem maquina digital pode fazer o 
mesmo congelamento no isopor: neste caso , a 
curva de refrigeração vamos fazer na geladeira 
convencional que esteja com temperatura interna de 
5 graus (utilizar a geladeira somente para isso). Ou 
usar a caixa de transporte de sêmen preparar antes 
com 2 gelos por 3 horas. Depois colocar as palhetas 
num recipiente cilíndrico, abrir a caixa rapidamente 
colocar o recipientes com as palhetas onde vai o 
sêmen e fechar a caixa e deixar 20 minutos para 
fazer a curva de refrigeração e o sêmen chega a 5 
graus. Depois tem o tempo de estabilização para 
cada espécie, então no eqüino deixar mais 15 
minutos por exemplo. Depois vamos fazer a curva de 
congelação – assim, vamos preparar outro isopor, 
vamos colocar um suporte de metal com uma bandeja 
em cima onde vão as palhetas, que vai ficar a 5 cm 
acima do nitrogênio liquido. Ou seja, colocamos 
nitrogênio liquido na caixa de isopor de 45 litros, 
coloca uma quantidade de 3 cm de nitrogênio, coloca 
o suporte que vai manter a bandeja a 5 cm acima do 
nitrogênio. Depois abrimos a botuflex ou a geladeira 
dependendo onde esta o sêmen, retiramos a bandeja 
com sêmen e colocamos na bandeja a 5 cm do 
nitrogênio, tampamos a caixa e ela vai fazer a curva 
de congelação. 
- Essas palhetas a 5 cm do nitrogênio com a caixa de 
isopor tampada, vai mais 20 minutos para fazer a 
congelação. Passando este tempo, abrimos a caixa, 
retiramos o suporte embaixo da bandeja e 
mergulhamos as palhetas no nitrogênio e esta 
concluído o congelamento. 
 
➢ Enracando as palhetas – guardar as palhetas 
nas raques de armazenamento. 
 
➢ Armazenamento do Sêmen – em todas as 
espécies é da mesma maneira, mesmo tipo 
de botijão. Estar sempre repondo nitrogênio. 
 
➢ Análise do Sêmen Pós- congelação – pegar 
uma e descongelar para fazer analise da 
partida. Colocar o sêmen a 37 graus em 
banho Maria – deixar 11 minutos porque o 
sêmen esta com metabolismo totalmente 
parado (diferente do refrigerado que 
deixamos 5 minutos) – para ele voltar ao 
metabolismo normal. O tempo de 1 minuto é 
de descongelação e 10 minutos é o tempo 
para os espermatozóides voltarem a seu 
metabolismo real para analisarmos. No dia a 
dia que formos usar o sêmen congelado e já 
sabermos como ele esta não precisa deixar 
10 minutos, assim deixamos só 1 min em 37 
graus para descongelar, e ele vai atingir 
metabolismo dentro do útero da fêmea. 
ANÁLISE DO SÊMEN PÓS-DESCONGELAÇÃO 
 
✓ MOTILIDADE TOTAL E PROGRESSIVA 
✓ VIGOR 
✓ CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA 
✓ MORFOLOGIA ESPERMÁTICA 
✓ INTEGRIDADE DE MEMBRANA 
 
CRITÉRIOS PARA AVALIAÇÃO DO SÊMEN 
DESCONGELADO 
 
DOSE DE SÊMEN CONGELADO APTA PARA I.A. 
(maior ou igual) – pós descongelação 
 
MOTILIDADE TOTAL ≥ 50 % 
VIGOR ≥ 3 
PORCENTAGEM DE PATOLOGIA ESPERMÁTICA 
 
-DEFEITOS MAIORES ≤ 20 % 
-DEFEITOS MENORES ≤ 20 % - pode aumentar pela 
congelação 
-DEFEITOS TOTAIS ≤ 40 % 
 
INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL 
INSEMINAÇÃO NA EXTREMIDADE DO CORNO 
 
 
INSEMINAÇÃO COM DESVIO DE PIPETA CORNO 
UTERINO 
 
INSEMINAÇÃO COM SÊMEN CONGELADO 
 
•Dose inseminante: 100 a 400 milhões sptz viáveis 
 
•Monitoramento da égua de 6 em 6 horas: IA pré e 
pós ovulação 
 
•Induzir a ovulação: hCG + Deslorelina