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P R O F. D R . R I C AR D O C É S AR TAVAR E S C AR VAL H O FATORES QUE INFLUENCIAM O CRESCIMENTO MICROBIANO Universidade de Cuiabá (UNIC) - Campus Beira Rio 1 Faculdade de Medicina Veterinária CUIABÁ – MT 2020 Crescimento Microbiano Substrato para os microrganismos Agentes infecciosos Infecções e/ou intoxicações alimentares Espécies encontradas inicialmente em alimentos: poucas sobrevivem e se multiplicam nas condições impostas pelo hospedeiro ou alimento, o microrganismo que não se adaptar morre! Em condições ótimas: tempo geração população bacteriana: 15 - 20 minutos Conhecimento de condições favoráveis ao crescimento microbiano Interação agente x hospedeiro x ambiente; Temperatura. pH. Nutrientes. Atividade de água (Aw). Ação enzimática e/ou imunológica. Conhecimento de condições desfavoráveis ao crescimento microbiano Conhecer os fatores que influenciam o crescimento FATORES QUE INFLUENCIAM O CRESCIMENTO MICROBIANO Vários fatores podem afetar o crescimento de uma população bacteriana, incluindo: - o tipo de ambiente; - número de indivíduos na população; - interações dinâmicas com outras populações bacterianas; - presença de outros microrganismos predadores; - fatores químicos e físicos tais como disponibilidade de nutrientes essenciais, temperatura, pH, osmolaridade, pressão hidrostática, concentração de oxigênio, luz, radiação ionizante ou ultravioleta, presença de metabólitos tóxicos resultantes do metabolismo das células da população em crescimento ou presença de agentes antimicrobianos tais como bacteriocinas e antibióticos. Os microrganismos podem sobreviver em uma diversidade de ambientes. Para qualquer mudança ambiental haverá um microrganismo capaz de sobreviver. Como controlar a infecção por microrganismos no organismo animal? Prevenção da infecção. Prevenção da doença (colonização e patogenicidade). Controle do ambiente. Controle do hospedeiro. 1. Condição nutricional adequada. 2. Imunizações preventivas. 3. Eliminação da(s) fonte(s) de infecção. 4. Controle de vetores. Prevenção da contaminação: controle da matéria-prima. controle do processamento térmico. assepsia dos equipamentos e operadores. Eliminação dos microrganismos presentes. Barreiras para a multiplicação. Como controlar o crescimento? Teoria de Leistner (1995) Curva de Crescimento Microbiano Por que alguns microrganismos crescem mais rapidamente em algumas situações? Dúvidas.... Capacidade de sobrevivência e multiplicação Fatores Intrínsecos Fatores Extrínsecos Definição: expressão pelo microrganismo de suas propriedades físicas pH; Atividade de água (Aa ou Aw); Potencial de oxido-redução (Eh); Quantidade de nutrientes Compostos antimicrobianos; Estrutura biológica do microrganismo. Fatores Intrínsecos Definição: próprios do ambiente. temperatura, umidade, tensão de oxigênio Fatores Extrínsecos Fatores Intrínsecos pH: Potencial de Hidrogeniônico - medida de acidez ou alcalinidade de um substrato O grau de acidez dos alimentos que tem uma influência importante na determinação da microbiota epífita e alterante. À medida que os valores de pH decrescem, maior será a seleção da microbiota; pH mais baixo também causa um desdobramento da molécula de proteína por rompimento dos laços de hidrogênio e isto reduz a atividade enzimática e aumenta a sensibilidade para desnaturação; O efeito inibitório do pH depende do tipo de ácido presente no alimento e da interação deste com todos os outros fatores. pH: EFEITO SOBRE OS MICRORGANISMOS Os microrganismos tem um pH MÍNIMO, ÓTIMO e MÁXIMO para crescimento A maioria dos microrganismos crescem melhor em pH próximo da neutralidade (6,5 a 7,5). - (pH < 4,5 acidófilos, pH entre 6,0 – 7,0 neutrófilos e pH >7,0 basófilos). Em geral os fungos filamentosos crescem melhor em pH mais baixo que as leveduras e estas são mais tolerantes que as bactérias. Bactérias crescem melhor que leveduras em pH neutro ou pH levemente ácido pH 5,0 ou menos, leveduras podem competir ou superar o crescimento de bactérias. pH: Condições ácidas ou básicas > 4,5 = alimentos de baixa acidez (neutro ou pouco ácido) - Predominância de crescimento bacteriano entre 4,5 e 4,0 = alimentos de média acidez (ácidos) - Leveduras oxidativas ou fermentativas, bolores aeróbios e algumas bactérias esporogênicas e não esporogênicas. < 4,0 = alimentos de alta acidez (muito ácido) - Bactérias acéticas, e quase que exclusivamente leveduras e bolores. Faixa de pH aproximada para crescimento de alguns grupos de MICRORGANISMOS Maioria dos microrganismos: cresce e se multiplica melhor pH de 6.5-7.5; FATORES INTRÍNSECOS - pH ORGANISMO Mínimo Ótimo máximo Bactérias (maioria) 4,5 6,5-7,5 9,0 Leveduras 1,5-3,5 4,0-6,5 8,0-8,5 Mofos 1,5-3,5 4,5-6,8 8,0-11,0 Clostridium botulinum 4,8-5,0 6,0-8,0 8,5-8,8 Salmonella sp 4,5-5,0 6,0-7,5 8,0-9,6 Vibrio parahaemolyticus 4,8-5,0 7,5-8,5 11,0 FATORES INTRÍNSECOS - pH FATORES INTRÍNSECOS - pH Efeito dos ácidos nos microrganismos Maior gasto de energia para manter o pH intracelular Desnaturação de proteínas, DNA Alteração da atividade das enzimas responsáveis pelas atividades vitais da célula Menor velocidade de crescimento Desnaturação de proteínas, DNA Alteração da atividade das enzimas responsáveis pelas atividades vitais da célula; Menor velocidade de crescimento Efeito dos ácidos nos microrganismos -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Tempo (dias) D iâ m et ro (m m ) 3,5 22°C rep 3 Gompertz Baranyi 4,5 22°C Influência da mudança de pH no crescimento de A. niger em néctar de manga. pH: ALTERAÇÃO DO pH PELOS MICROORGANISMOS O ambiente influencia no crescimento dos microrganismos, assim como os microrganismos influenciam no ambiente; Produtos metabólicos formados podem ser ácidos ou alcalinos; Quebra de carboidratos – produção de ácidos orgânicos (bactéria ácido-lática); Alteração do pH pela produção de ácidos é usada nas industrias de produtos fermentados; Tipos proteolíticos como as Pseudomonas tendem a aumentar o pH pela produção de amônia ou outras substâncias básicas. pH baixo de frutas, salmouras inibe crescimento G(-); C. botulinum: não germina a pH < 4.6 e não cresce pH < 4.5; Tratamento térmico em alimentos ácidos : mais suave. Acidófilos: Lactobacillus e Streptococcus: crescem pH 3-4; Fungos e leveduras: pH 2-8.5; Efeito inibidor do pH é dependente: tipo de ácido presente no substrato; nutrientes; Aw e temperatura pH Nenhum microrganismo cresce em meio totalmente seco; Necessitam de água livre para crescer. Atividade de Água (Aw) ATIVIDADE DE ÁGUA (Aa ou Aw): É o quociente entre a pressão de vapor do alimento (soluto) e a pressão da água pura (solvente) à mesma temperatura. Aw= p/po = 1 onde p = pressão de vapor do alimento (soluto) po = pressão de vapor da água pura (solvente) O valor absoluto de Aw fornece uma indicação segura do teor de água livre do alimento. Água livre: É a única forma de água passível de utilização por parte dos microorganismos. Numericamente: Aw varia de 0 a 1. FATORES INTRÍNSECOS - Aw A adição de solutos a um líquido puro irá causar uma redução na pressão de vapor da solução e conseqüentemente diminuir a atividade de água (Aw). Microorganismos Atividade de água (Aw) Bactérias 0,90 Leveduras 0,88 Fungos filamentosos 0,80 Bactérias halófilas 0,75 Bactérias xerotolerantes 0,71 Fungos filamentosos xerófilos 0,65 Leveduras osmofílicas 0,60 Redução da atividade de água no alimento Adição de soluto: sal açúcar glicerol Remoção da água livre: desidratação congelamento Atividade de Água (Aw) Limites de Aw para o desenvolvimento de microrganismos Aw Um mesmo valor de Aw pode determinar diferentes graus de crescimento, dependendo daspropriedades dos solutos e de outros fatores como: Temperatura: - Ao reduzir a Aw do alimento diminui também a capacidade dos microorganismos crescerem em um certa temperatura. - Os limites de Aw são maiores para o crescimento microbiano se estes encontrarem uma temperatura ótima de crescimento. - A temperatura se propaga mais rapidamente nos alimentos úmidos que nos alimentos secos, por isso, estes alimentos oferecem maior resistência dos microorganismos a ação do calor. Nutrientes: a presença de elementos nutritivos aumenta os limites de Aw em que os microorganismos são capazes de se desenvolver. Aw Aw ALIMENTOS MICROORGANISMOS 1 a 0,98 Leite, pescados e carne fresca, verduras, vegetais em salmoura e fruta em calda leve Todos os patógenos e a Maioria dos deteriorantes. Ex: Salmonella, Campylobacter, E.coli, Shigella, B. cereus, Clostridium, S. aureus. 0,98 a 0,93 Queijo processado, carne curada, embutidos, lingüiça cozida, fruta em calda forte e pães. Enterobacteriáceas, S. aureus e V. parahaemolyticus e outros acima crescem lentamente ou para sua reprodução. 0,93 a 0,85 Leite condensado, queijo cheddar maturado, lingüiça fermentada, carne seca, presunto cru e bacon. S. aureus mas sem produção de enterotoxina. Fungos produtores de micotoxinas. 0,85 a 0,60 Farinhas, massas, cereais, nozes, frutas secas, gelatinas e geléias, melaço. Fungos xerofílicos, osmofílicos, halófilos. Não há crescimento de bactérias patogênicas Inferiores a 0,60 Confeitos, biscoitos, leite e ovos em pó, vegetais fermentados, chocolate, mel, macarrão seco, biscoitos e batatas chips. Microrganismos não se multiplicam. Não há crescimento microbiano, mas estes permanecem viáveis. FATORES INTRÍNSECOS - Aw O potencial de oxidação-redução (redox - Eh) de um substrato pode ser definido, de um modo geral, pela facilidade com a qual o substrato ganha ou perde elétrons. Quando um elemento perde elétrons, diz-se que este substrato é oxidado, ao passo que, quando um substrato ganha elétrons, diz-se que se tornou reduzido. Desta forma, um substrato que facilmente doa elétrons é chamado de bom agente redutor, e aquele que facilmente recebe elétrons é denominado um bom agente oxidante. Quando os elétrons são transferidos cria-se uma diferença potencial, esta pode ser medida através de um instrumento apropriado e é expressa em milivolts. Quanto mais oxidada está uma substância, mais positivo será o seu potencial elétrico. Entre as substâncias dos alimentos que ajudam a manter condições redutoras estão o ácido ascórbico e os açúcares redutores em frutas e vegetais. Definição: índice do grau de oxidação de um sistema Cu Cu++ + 2e- quando elemento perde e- oxida; quando elemento ganha e- reduz. A oxidação também acontece pela adição de oxigênio na reação abaixo 2Cu + O2 2CuO Potencial de Oxido-Redução (Eh) O potencial redox de um ambiente pode ser afetado por uma série de compostos. O oxigênio é o fator que mais contribui para o aumento do potencial redox de um alimento. Os microrganismos variam no grau de sensibilidade ao potencial redox do meio de multiplicação e podem, de acordo com o Eh requerido, ser divididos em grupos, como: • Aeróbios: exigem Eh positivo para o seu crescimento (presença de oxigênio) e são representados pelos bolores, bactérias como a Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Micrococcus, algumas espécies de Bacillus e leveduras oxidativas; • Anaeróbios: requerem Eh negativo para seu crescimento (ausência de oxigênio). O oxigênio chega a ser tóxico para a célula, porque gera peróxidos letais ao microrganismo. Os gêneros Clostridium e Desulfotomaculum compreendem espécies anaeróbias; • Facultativos: multiplicam-se em Eh positivo e negativo, sendo representados pelas leveduras (fermentativas, enterobactérias e Bacillus); • Microaerófilas: multiplicam-se melhor em Eh baixo. As bactérias lácticas são encontradas neste grupo. Verifica-se, portanto, que este é um fator de importância a ser utilizado na preservação de alimentos e que determina também quais tipos de microrganismos irão se desenvolver em determinados alimentos. Por exemplo, pode-se utilizar a exaustão, embalagens impermeáveis ao oxigênio, o uso de vácuo, atmosfera com gases inertes para se controlar os microrganismos. Estes recursos são usados para queijos, vegetais, produtos cárneos e outros, a fim de evitar os mofos superficiais. No caso dos enlatados, o ambiente anaeróbio favorece a multiplicação de bactérias esporuladas, anaeróbias ou facultativas. FATORES INTRÍNSECOS Potencial de oxido-redução (redox) (Eh) O potencial redox de um alimento pode ser definido como a “facilidade” com a qual este ganha ou perde elétrons. Tal potencial é expresso em milivolts (mV). Diversos são os fatores que concorrem para determinação da Eh do alimento (pH, oxigênio, açúcares redutores, aditivos, etc). Microrganismos aeróbios: Requerem Eh positivo entre +350 a +500mV (oxidante) para o seu desenvolvimento. Microrganismos anaeróbios: Requerem Eh negativo (redutor), ao redor de +30 a -250mV, para o seu desenvolvimento. Os anaeróbio estritos necessitam, ainda, da exclusão de oxigênio. Microrganismos microaerófilos: Requerem Eh “levemente” negativo (redutor) para o seu desenvolvimento. Potencial de oxido-redução (redox) (Eh) Microrganismos Eh de crescimento (em mV) Aeróbios +350 a +500 Anaeróbios +30 a –250 (melhor = - 150) Na ausência de O2 toleram substrato com Eh elevado (+370) Na presença de O2 este limite cai para +100 Anaeróbios Facultativos + 100 a + 350 FATORES INTRÍNSECOS - Eh POTENCIAL DE ÓXIDO-REDUÇÃO (redox) (Eh) DE ALGUNS ALIMENTOS Classificação dos MICRORGANISMOS de acordo com a utilização ou não do oxigênio em suas rotas metabólicas AERÓBIOS ESTRITOS: suas rotas metabólicas, para obtenção de energia, necessitam de concentrações de oxigênio ao redor de 21%. Realizam RESPIRAÇÃO AERÓBICA, tendo o oxigênio como aceptor final de elétrons. AERÓBIOS FACULTATIVOS: possuem rotas metabólicas que utilizam o oxigênio, mas, também, rotas para obtenção de energia sem utilização do mesmo. Realizam RESPIRAÇÃO AERÓBICA em presença de oxigênio, e na ausência podem realizar tanto a FERMENTAÇÃO quanto a RESPIRAÇÃO ANAERÓBICA tendo como aceptor final de elétrons compostos como Classificação dos MICRORGANISMOS de acordo com a utilização ou não do oxigênio em suas rotas metabólicas sulfatos, nitratos ou carbonatos. MICROAERÓFILOS: necessitam de concentrações de oxigênio inferiores à atmosférica (21%) para crescerem. A concentração ideal varia entre 1 e 15%. ANAERÓBIOS AEROTOLERANTES: não utilizam o oxigênio no processo metabólico, a obtenção de energia se dá por vias FERMENTATIVAS. ANAERÓBIOS ESTRITOS: não utilizam o oxigênio para obtenção de energia e sua presença é tóxica e prejudicial ao metabolismo. Obtêm energia pela realização de RESPIRAÇÃO ANAERÓBICA ou FERMENTAÇÃO. Classificação dos MICRORGANISMOS de acordo com a utilização ou não do oxigênio em suas rotas metabólicas AERÓBIOS ESTRITOS: Necessita de oxigênio. Presença da enzima catalase e SOD (superóxido desmutase) permite a neutralização das formas tóxicas de oxigênio, pode usar o oxigênio. AERÓBIOS FACULTATIVOS: Aeróbio e Anaeróbio - aumento do crescimento na presença de oxigênio. Presença da enzima catalase e SOD permite a neutralização das formas tóxicas de oxigênio, pode usar o oxigênio. MICROAERÓFILOS: Necessita do oxigênio em baixas concentrações. Produção de quantidades letais das formas tóxicas de oxigênio quando expostas a atmosfera normal de oxigênio ANAERÓBIOS AEROTOLERANTES: Crescimento continua na presença de oxigênio. Presença de SOD que permite a neutralização parcial das formas tóxicas de oxigênio ANAERÓBIOS ESTRITOS: Somente crescimento anaeróbio (sem oxigênio). Ausência das enzimas que neutralizam as formas tóxicas de oxigênio FATORES INTRÍNSECOS- Eh FATORES INTRÍNSECOS - Eh SUPERÓXIDO DISMUTASE: elimina os radicais superóxido convertendo-os a peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio produzido por esta reação pode ser metabolizado por outras duas enzimas: CATALASE: converte o peróxido de hidrogênio em oxigênio molecular e água. PEROXIDASE: converte o peróxido de hidrogênio em água FATORES INTRÍNSECOS Quantidade de nutrientes: Nutrientes necessários para a multiplicação microbiana: ÁGUA ENERGIA (CARBONO): Açúcar, álcool, carboidratos, aminoácidos, lipídios, amido, celulose. NITROGÊNIO: aminoácidos (fonte primária), proteínas e peptídeos. MINERAIS: sódio, potássio, cálcio, magnésio, ferro, cobre, manganês, fósforo, zinco, enxofre, cobalto e molibidênio. VITAMINAS: complexo B, biotina, ácido pantotênico FATORES INTRÍNSECOS Quantidade de nutrientes Pode variar dependendo das condições em que se encontrem os microorganismos. Maior exigência de nutrientes, quando em temperaturas abaixo ou acima do ótimo para crescimento do microorganismo. FATORES INTRÍNSECOS Denominação quanto à utilização e degradação de nutrientes Proteolíticos: degradação de proteínas por enzimas, chamadas proteases. Sacarolíticos: degradação de açúcares como fonte de energia no metabolismo. Lipolíticos: degradação de lipídeo como fonte de energia no metabolismo. Halofílicos ou halófilos: Microorganismo que desenvolve-se em ambientes com concentrações salinas. Ex: Vibrio vulnifiçus Osmofílicos: Capacidade de sobreviver em meio rico em açúcar. Nutrientes Antimicrobianos Constituintes Naturais dos Alimentos Apresentam diversos mecanismos: a) Inibição da síntese de ácidos nucléicos, proteínas ou parede celular; b) Quebra da integridade da membrana; c) Interferência em processos metabólicos essenciais para micro-organismos. Alguns tem efeito microbiocida outros microbiostático FATORES INTRÍNSECOS Constituintes antimicrobianos: Naturais Lacteninas - leite fresco Lizozima – clara do ovo Eugenol – cravo/canela Ácido benzóico – vegetais Aldeído cinâmico – canela Alicina – alho Timol e isotimol – orégano FATORES INTRÍNSECOS Constituintes antimicrobianos Substâncias que apresentam a capacidade de retardar ou impedir a multiplicação microbiana. Podem ser: Naturais; Produzidas pelos microrganismos; Adicionadas aos alimentos FATORES INTRÍNSECOS Constituintes antimicrobianos: Produzidas pelos microrganismos ácido propiônico - bactéria propiônica ácido lático - bactéria lática Álcool - levedura Antibiótico - bolores bacteriocinas - presente em bactérias gram-positivas água oxigenada - estreptococos e lactobacilos FATORES INTRÍNSECOS Constituintes antimicrobianos: Adicionadas aos alimentos (conservantes) Ácidos Nitratos e nitritos Dióxido de enxofre e sulfitos Nisina FATORES INTRÍNSECOS Constituintes antimicrobianos: Tipos de ações das substâncias antimicrobianas: Inibição da biossíntese dos ácidos nucléicos, de proteínas ou da parede celular dos microorganismos. Dano à integridade das membranas celulares. Interferência nos processos metabólicos. FATORES INTRÍNSECOS Estruturas Biológicas: Membranas das sementes Casca dos frutos Casca das nozes Pele dos animais Casca dos ovos Estruturas biológicas Microbiota competitiva. Barreiras físicas naturais (Pele, mucosas, muco, urina…) Atividade do sistema imune – Resposta celular - Resposta humoral. Estruturas biológicas Cobertura natural de alguns alimentos constitui excelente barreira física contra a entrada de microrganismos casca de ovos; casca de frutas; casca de nozes; películas que envolvem sementes; cortes cárneos inteiros são mais protegidos que fatiados MUITO OBRIGADO A TODOS
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