ROTEIRO DE PRÁTICA 3

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ROTEIRO DE AULA PRÁTICA 3 – Análise Microbiológica da água 1
Unidade Curricular: Mecanismos de Agressão e Defesa II
Objetivos
- Realizar fluxo laboratorial da análise de alimentos para identificação de coliformes totais e fecais 
- Capacitar o estudante a distinguir os diferentes meios de cultura 
- Interpretar o NMP 
Pesquisa de Coliformes Totais, Coliformes Termotolerantes e E.Coli pela Técnica do NMP (Número Mais Provável) 
1.INTRODUÇÃO 
1.1. Bactérias do grupo coliforme 
São bacilos Gram negativos, não esporulados, com a capacidade de fermentar lactose, produzindo gás a a 35°C em 48 h. 
1.2.Técnica do Número Mais Provável (NMP) 
A técnica do NMP é uma forma de se ESTIMAR o número de microrganismos presentes na amostra. É baseada na probabilidade estatística de certo número de microrganismos estarem presentes na amostra quando uma série de resultados positivos ocorre. 
Esta estimativa é obtida pelo preparo de diluições decimais sucessivas da amostra e a transferência de alíquotas destas diluições para uma série de três ou cinco tubos contendo meio de cultura adequado. No caso da análise de coliformes, o resultado positivo é evidenciado pela presença de gás no interior do tubo invertido (tubo de Durhan), contido no interior do tubo com meio de cultura. O método do NMP é portanto uma forma indireta de medida, em contraste com a técnica de plaqueamento que pode ser considerada como um método direto.
 PROCEDIMENTO
2.1. Preparo da Amostra 
a. Transferir de forma asséptica 25 mL de agua para um erlenmeyer de 500 mL contendo 225 mL de água peptonada a 0,1%, estéril (diluição 10-1); 
b. Homogeneizar 
c. Transferir 1 mL da diluição 10-1 para um tubo de ensaio contendo 9 mL de solução de água peptonada a 0,1% estéril – diluição 10-2 (agitar os frascos vinte vezes antes de cada retirada de amostra) 
d. Transferir 1 mL da diluição 10-2 para um tubo de ensaio contendo 9 mL de solução de água peptonada a 0,1% estéril – diluição 10-3 (agitar os frascos vinte vezes antes de cada retirada de amostra) 
2.2. Teste presuntivo para coliformes 
Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) 
Os nutrientes presentes no meio e o tampão fosfato permitem o rápido crescimento e produção de gás de microrganismos que fermentam a lactose, mesmo aqueles que fermentam lentamente. O lauril sulfato apresenta ação seletiva, inibindo o crescimento de microrganismos indesejáveis.
a. Inocular 3 tubos de ensaio contendo 10mL de caldo LST, com 1mL da primeira diluição; 
b. Repetir a mesma operação para as diluições subsequentes; 
c. Incubar os tubos a 35ºC por 24 a 48 h. Após 24 h verificar os tubos com produção de gás. 
d. Reincubar os tubos negativos por mais 24 h; 
e. Para cada diluição, anotar o número de tubos com produção de gás. 
Roteiro:
1. Descreva as técnicas utilizadas em laboratório
2. Quando devemos utilizar a técnica de tubos múltiplos?
3. Quais outros métodos de contagem direta?