Acetaminofeno no burst oxidativo e apoptose de neutrófilos (Apresentação de um artigo cientifico)

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Acetaminophen Prevents Oxidative Burst And Delays Apoptosis In Human Neutrophils
Marisa Freitas, Vera M. Costa, Daniela Ribeiro, Diana Couto, Graça Porto, Félix Carvalho, Eduarda Fernandes
Isabela Nascimento
Introdução	
Acetaminofeno (paracetamol) é uma droga muito usada como antipirética e analgésica;
Inibe COX-1 e -2 em inflamações com pouco peróxido, como no cérebro (efeito antipirético);
Não ocorre nos processos inflamatórios devido ao peróxido;
Neutrófilos: maioria dos leucócitos, imunidade inata, fagocitose, burst oxidativo, apoptose constitutiva
Interação do acet com neutrófilos
Objetivo: entender efeito do acetaminofeno no burst oxidativo e apoptose dos neutrófilos humanos
Materiais
Leitor de microplaca para deteção colorimétrica, fluorimétrica e quimioluminométrica
Citómetro de fluxo
Isolamento de neutrófilos humanos por centrifugação em gradiente de densidade
Efeito do acetaminofeno no burst oxidativo de neutrófilos induzidos por PMA (ativador de PKC)
Ensaio de quimioluminescência com luminol: oxidação do luminol por espécies reativas
	NEUTR + ACET + PMA + LUM
	Resultados em % de inibição da oxidação do luminol
Métodos
Ensaio de fluorescência com amplex red: Deteção por ser oxidado por H₂O₂
	NEUTR + ACET + PMA + HRP + AMPLEX
	λ de excitação e emissão: 530 e 590nm 
	Resultados em % de inibição da oxidação do amplex red
Ensaio de APF: oxidado por EROs e ERAs (especialmente HOCl, usando ABAH que diminui sinais de HO• e ONOO⁻), produto fluorescente
	NEUTR + ACET + PMA + APF
	 λ de excitação e emissão: 485 e 528nm
	Resultados em % da inibição da oxidação de APF
Ensaio de HE (hidroetidina): oxidada por O₂•⁻, produto fluorescente
	NEUTR + ACET + PMA + HE
	 λ de excitação e emissão: 485 e 528nm
Métodos
Ensaios com desativadores de espécies reativas de oxigénio (EROs) em sistemas não celulares
Desativador de O₂•⁻: medido através de quanto acet. inibe a reação entre superóxido e NBT
	 Resultados em % da inibição da redução de NBT em diformazan
Desativador de H₂O₂: com amplex red e adição de peróxido
	 ACET + TAMPÃO + AMPLEX + HRP + H₂O₂
	 Resultados em % de inibição da indução de H₂O₂ em oxidar amplex red
Desativador de HOCl: HOCl induz oxidação de DHR em rhodamine 123
	 Resultados em % de inibição da oxidação do DHR
Métodos 
Medição de níveis de glutationa: medida glutationa total (GSH + GSSG) em neutrófilos estimulados na presença e ausência de acetaminofeno
	NEUTR + PMA (15min) + ACET (1h) -> acidificado -> centr -> sobrenadante
	
Avaliação da apoptose de neutrófilos
Alteração citomorfológica: 
	NEUTR + PMA (15min) + ACET (1h) -> centrífuga -> corado com Hemacolor®
	Contadas células que sofreram apoptose
Ligação de Anexina-V: 
	Fosfatidilserina (PS) é translocada para fora da membrana; anexina-V se liga e é 	detetada em citometria de fluxo
 	NEUTR + PMA (15min) + ACET (1h) -> CENTR -> PBS (tampão) -> CENTR -> 	anexina-V (15min) -> CENTR -> PBS + IP (iodeto de propídio) 
Métodos e Resultados
Avaliação do potencial de membrana mitocondrial: DiOC₆(3), corante lipofílico fluorescente, permeia célula viva
	NEUTR + DiOC₆(3) + PMA(15min) + ACET (1h) -> CENTR -> PBS (tampão) 
	λ de excitação e emissão: 485 e 520nm
Estatísticas
	GraphPad Prism™
	Resultados dados em média±desvio padrão
	Média de pelo menos 4 experimentos individuais feitos em triplicado
	ANOVA / teste de Bonferroni
	p < 0,05 é estatisticamente relevante
Métodos e Resultados
Resultados 
Efeito do acetaminofeno no burst oxidativo de neutrófilos induzidos por PMA 
Oxidação dos reagentes diminuiu por acet diminuir ERO
Resultados
Ensaios com desativadores de espécies reativas de oxigénio (EROs) em sistemas não celulares
Conforme aumenta dose de acet, aumenta a desativação de H2O2 e HOCl
Resultados
Acetaminofeno não tem efeito sobre GSHt em neutrófilos não estimulados
Medição de níveis de glutationa
Conforme aumenta dose de acet, aumenta a percentagem de depleção do GSH
Alteração citomorfológica 
PMA
PMA + ACET
Percentagem de proteção do acet em cells apoptóticas
Resultados
Ligação de Anexina-V
Percentagem de proteção de cells apoptoticas conforme aumenta dose de acet
Resultados
Avaliação do potencial de membrana mitocondrial
Quanto as alterações na membrana da mitocôndria foram inibidas conforme aumentou dose de acet
Discussão
Discussão
Baixas [ ] de acet já conseguiram inibir o Luminol que reage com O₂•⁻, H₂O₂, HO•, HOCl, •NO, ONOO⁻
Teste de APF com sensibilidade para HOCl +
↓ Amplex red = acet desativa H₂O₂
Resultado negativo para HE (hidroetidina)
Duas possibilidades de como acetaminofeno reage:
Inibindo enz importantes como NADPH oxidase ou MPO
Desativando espécies pro-oxidativas
Discussão
Testes c/ desativadores sem adição de neutrófilos, c/adição dos produtos do burst:
Alta desativação para H₂O₂ e HOCl, nenhuma para O₂•⁻
Conclui-se que não age em O₂•⁻ nem NADH oxidase
↓ H₂O₂ pode causar ↓ HOCl , ou acet inibe ambos? 
acet. reage com HOCl formando 1,4-benzoquinona e NAPQI, que reage com GSH
Discussão
Caminhos que iniciam a apoptose: recetores PS (extrínseco) e por mediação da mitocôndria (intrínseco)
Anexina-V: acet tem efeito protetor da apoptose
Avaliação potencial de membrana mitocondrial: mostrou indução do PMA à apoptose; EROs influenciam na apoptose; H₂O₂ é o ERO com + influencia na apoptose 
Acet. ↑ vida útil de neutrófilos x
↓ ERO e ERA prevenindo que prejudiquem outros tecidos quando em excesso
Não prejudica outros mecanismos não oxidativos do neutrófilo
∴ Potencial como inibidor do burst oxidativo dos neutrófilos, além de prolongar sua vida útil, favorecendo a eliminação de patógenos contribuindo para cura do tecido e resolução da inflamação