3 - ASPERGILOSE & ZIGOMICOSE

Prévia do material em texto

Métodos de Diagnóstico Laboratorial 
de Fungos Invasivos: 
- ASPERGILOSE -
Dr. Alexandre M. Fuentefria 
Prof. Adjunto do Departamento de Análises / Faculdade de Farmácia / UFRGS
Orientador de Mestrado e Doutorado nos programas PPGMAA/UFRGS e PPGCF/UFRGS
Coordenador do Laboratório de Micologia Aplicada da UFRGS
QUAIS OS RISCOS DE SITUAÇÕES COMO 
ESTAS ? 
QUAIS OS RISCOS DE SITUAÇÕES COMO 
ESTAS ? 
QUE GRUPO DE FUNGOS SÃO ESTES ? 
DEPENDE DO QUE PARA NOS INFECTARMOS 
COM ELES ? 
CLASSIFICA-SE EM QUAIS TIPOS DE 
MICOSE ? 
HIFAS
HIALINAS
ASPERGILOSE
(ângulos de 45oC)
DERMATÓFITOS*
LARGAS
(ângulos de 90oC)
ZIGOMICOSE
ENTOMOFTOROMIC
OSE
HIALOHIFOMICOSE
(ângulos de 45oC)
DEMÁCEAS
FEOHIFOMICOSE
Rhizopus sp.
Mucor sp.
Absidia sp.
Rhizomucor sp.
QUANDO ENCONTRAMOS HIFAS, O QUE FAZEMOS?
Pseudallescheria boydii
(Scedosporium 
apiospermum)
Fusarium sp.
ASPERGILOSE
Definição, Sinônimos e Agentes Etiológicos
 Hialohifomicose
 Mais de 200 espécies
 Fungo anemófilos
A. fumigatus* 
A. niger
A. flavus
A. terreus
A. nidulans
A. clavatus
IMPORTÂNCIA MÉDICA
ASPERGILOSE
Ecologia Microbiana
- Ubíquos na natureza
- Saprófitas em restos vegetais, solo
- Conídios se dispersam no ar
- Flora anemófila (1-6%)
- Cabeça conidial libera 1 x 103 propágulos
Onde são encontrados no ambiente domiciliar e 
hospitalar?
Celulose dos móveis; Papel de parede; Pó doméstico; 
Plantas interiores; Cozinhas; Filtros de ar condicionado
FATORES 
PREDISPONENTES
Tuberculose
Abscessos 
Fibrose cística
Neutropenia
RESPOSTA 
IMUNE DO 
HOSPEDEIRO
GRAU DE INÓCULO 
INALADO
ARQUITETURA 
DO PULMÃO
HOSPEDEIRO
IMUNOSSUPRIMIDO 
Quimioterapia
Uso corticóides
AIDS
ASPERGILOSE
Fisiopatogenia
DOSE de esporos 
inalados
Inalação
Infecção
(imunodeprimidos)
Disseminação
ASPERGILOSE
Fisiopatogenia
ASPERGILOSE
Fisiopatogenia
ASPERGILOSE
Fisiopatogenia
RISCOS PARA ASPERGILOSE INVASIVA
NEUTROPENIA
USO DE 
CORTICÓIDES
DPOC
IMUNODEFICIÊNCIA
1. ASPERGILOSE IMUNOALÉRGICA
2. ASPERGILOMA OU BOLA FÚNGICA
3. ASPERGILOSE PULMONAR INVASIVA
4. ASPERGILOSE PULMONAR NECROTIZANTE
5. SINUSITE ASPERGILAR
6. OUTRAS FORMAS DE ASPERGILOSE
6.1 – Otomicose 6.2 - Orbital
6.3 – Cerebral 6.4 - Onicomicose
ASPERGILOSE
Aspectos Clínicos
QUAIS SÃO AS FORMAS CLÍNICAS DA ASPERGILOSE?
1. ASPERGILOSE IMUNOALÉRGICA
Características: formação de tampões de muco contendo 
hifas de Aspergillus, nos brônquios, além do aumento da IgE 
total  Tampões = geram sintomas brandos até 
bronquiectasias e fibrose
Patogênese: É o resultado de reações dos tipos I, III, IV 
frente a antígenos de Aspergillus, colonizando a árvore 
brônquica.
Sintomas: febre, asma intratável, tosse produtiva,
expectoração de tampões mucosos contendo micélio.
2. ASPERGILOMA OU BOLA FÚNGICA
 Características: Colonização das 
cavidades pulmonares em forma de 
um “novelo” de hifas;
 Predisposição 
 Doença pulmonar crônica com 
cavitação (Tuberculose ou fibrose 
cística)
 imunodepressão
Sinais radiológicos típicos  Bola
fúngica intracavitária;
10% dos casos  cura espontânea;
 Complicações:
• Evoluir para ASPERGILOSE PULMONAR NECROTIZANTE ou ASP. 
PULM. INVASIVA;
• OXALOSE: Aspergillus produz ácido oxálico + Cálcio tecidual 
Oxalato de Ca (deposição tecidual) e insuficiência renal
2. ASPERGILOMA OU BOLA FÚNGICA
Conidióforos de 
Aspergillus fumigatus
em massa da bola 
fúngica cercado por 
micélio (HE, x400)
Características: A. fumigatus (90%); 
A. flavus (10%);
Patogênese:
• Fungo invade áreas saudáveis do pulmão; 
tropismo vascular  trombose, necrose 
isquêmica
• pacientes imunocomprometidos graves 
(neutropênicos);
3. ASPERGILOSE PULMONAR INVASIVA
Sintomas: febre >38°C 
refratária a 
antimicrobianos; dor 
pleurítica, tosse.
Características:
- bola fúngica e presença de Precipitinas (+)
Patogênese: O fungo ataca o pulmão de pacientes razoavelmente 
imunocompetentes
4. ASPERGILOSE PULMONAR NECROTIZANTE
SINUSITE ASPERGILAR ALÉRGICA:
Reconhecimento recente; Ocorre em pacientes atópicos; 
Causa: obstrução intermitente uni ou bilateral;
Sintomas: cefaléia, dor facial;
5. SINUSITE ASPERGILAR 
SINUSITE INVASIVA AGUDA:
Acomete pacientes neutropênicos;
Aspectos clínicos similares a zigomicose:
a) Lesões necróticas no palato
b) Destruição desfigurante do tecido facial
c) Disseminação para órbita ocular e cérebro
6. OUTRAS APERGILOSES
6.1. OTOMICOSE
Olhos  CERATITE
6.2. ASPERGILOSE ORBITÁRIA 
6.2. ASPERGILOSE CEREBRAL 
6.3. ONICOMICOSE ASPERGILAR
- Decorrente de infecção pulmonar com disseminação;
- 10-20% dos casos de Aspergilose disseminada
- Diagnóstico: TC localiza lesões, entretanto líquor é pouco útil
DERMATOMICOSE de unhas:
- 1° lugar: Scopulariopsis brevicaulis
- 2° lugar: Aspergillus spp
Ocorre em pacientes c/ traumatismos ungueais ou transtornos 
circulatórios nos M.I.
Aspergillus só afeta unhas previamente distróficas;
ASPERGILOSE
Epidemiologia
 Possuem distribuição mundial;
 Aspergilose ocorre em pacientes:
a) Imunocomprometidos: HIV, transplantados
b) com terapêutica a base de corticosteróides
 São fungos anemófilos = relacionados com infecções 
oportunistas pelo ar;
Porta de entrada no organismo: 
Inalação de esporos (pulmões, seios)
Implantação traumática (córnea, acidente)
Incidência de aspergilose invasive no 
ambiente hospitalar?
Cornillet et al, Clin Infect Dis 2006;43:577
POR QUÊ É TÃO DIFÍCIL O DIAGNÓSTICO 
LABORATORIAL DA ASPERGILOSE ?
 Característica clínica inespecífica;
 O agente etiológico é raramente isolado do sangue;
 As biópsias geralmente contra-indicadas;
 Diagnóstico imunológico inconsistente;
Diagnóstico Laboratorial
COMO DIAGNOSTICAR ENTÃO ?
Diagnóstico Laboratorial
ASPERGILOSE
Coleta e Exame Direto
Escarro: útil só na aspergilose alérgica 
“Abundante micélio septado com hifas dicotômicas”
Lavado Bronco Alveolar: tem valor diagnóstico na 
aspergilose invasiva;
Biópsia: melhor material  “Hifas hialinas septadas, 
com ramificações dicotômicas”
Fragmento de Lesões Cutâneas: Material necrótico 
com hifas hialinas
Lavado dos seios paranasais: tem valor diagnóstico na 
sinusite aspergilar 
Escarro, LBA, Biópsia, 
Fragmentos de lesões 
cutâneas e Lavados
 ANÁLISE A FRESCO 
• Lâmina e lamínula + KOH 10-40%
• Hialinas 
• Regulares
• Septadas
• Dicotômicas (filamentos em 
ângulo agudo)
• ± 4 mm de diâmetro
HIFAS
Visualização de CONÍDIOS no exame direto NÃO TEM VALOR DIAGNÓSTICO (contaminação)
ASPERGILOSE
Exame Direto a fresco
 HISTOPATOLOGIA (biópsias em geral/ fluidos corporais/ unhas)
• Colorações: PAS, HE, Grocott-Gomori
A) © G. Armstrong, Hope Hospital, Manchester. Published in Denning, D.W. Invasive aspergillosis. Clin Infect Dis 1998; 26: 781-805.
B) Dr H M Doran, University Hospital of South Manchester, Manchester, UK.
A) Hifas em escarro (Papanicolau, x500)
B) Tecido necrótico de pulmão - cabeças de 
conídios (HE, x500)
ASPERGILOSE
Exame Histopatológico

• Ágar Sabouraud (com cloranfenicol / sem cicloheximida)
• Temperatura ambiente (25-30°C)
• Crescimento em 2-4 dias (colônias maduras  cabeças aspergilares 
montadas)
Características macromorfológicas da colônia 
+ 
achados micromorfológicos
DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO
Cultura
ASPERGILOSE
MORFOLOGIA DA COLÔNIA
• Fase inicial: textura algodonosa/ coloração branca
• Após: textura veludosa/ coloração cinza esverdeada
• Reverso branco ou acastanhado
EXAME MICROSCÓPICO CULTURAL
• Conidióforo: liso, incolor (tendendo para o verde na
parte terminal), vesículas hemisféricas, uma só rede
de fiálides muito densa (3/4 superiores da vesícula)
• Conídios: globulosos (rugosos/ equinulados)
Aspergillus fumigatus
MICROMORFOLOGIA COLONIAL
Aspergillus niger
MORFOLOGIA DA COLÔNIA
• Fase inicial: textura algodonosa/ coloração branca
ou amarela
• Após: textura arenosa (grânulos grandes)/ coloração
preta
EXAMEMICROSCÓPICO CULTURAL
• Conidióforo: paredes lisas e espessas, coloração
variável (hialino ao castanho), vesícula perfeitamente
globosa, duas fileiras radiais de fiálides
•Conídios: globulosos (lisos/ equinulados), castanho
escuro
MICROMORFOLOGIA COLONIAL
Aspergillus flavus
MORFOLOGIA DA COLÔNIA
• Fase inicial: textura algodonosa/ coloração branca
• Após: textura arenosa (grãos grandes)/ coloração
amarelo-esverdeada
• Reverso branco ou cinza (esclerócitos  castanho
escuro)
EXAME MICROSCÓPICO CULTURAL
• Conidióforo: incolor, mais ou menos rugoso, vesícula
hemoesférica, coroa birradiada formada de fiálides
•Conídios: globulosos (lisos/ rugosos)
MICROMORFOLOGIA COLONIAL
Aspergillus
fumigatus niger flavus
Caracte
-rística
A. niger
A. 
fumigatus A. flavus
Coloraçã
o das
Colônias
Pretas, lado 
inferior 
pálidas 
Verde-azulado
claro até
verde-escuro e
marrom-escuro
Verde-
amarelado-claro,
verde-amarelado
escuro,
marrom-oliva,
acastanhado
Tamanho 
dos
conídios
4-5 mm 2-5 mm 4 mm
Formato 
dos 
Conídios
Cadeias 
compactas
Cadeias 
compactas
Cadeias soltas e 
divididas 
Conídios Marrom-
escuros
Esféricos,
pontiagudos,
até pouco
ásperos
Esféricos, lisos,
até ásperos,
tamanhos
variados
Formato 
dos
Fialoconí-
dios
Redondas
e
espinhosas
Redondas Redondas
Hifas 
(largura)
6 mm 3-8 mm 5-6 mm
Comprim
ento dos 
Conidiófo
-ros
≤ 3 mm 150-300 mm ≤ 850 mm
Forma 
dos 
conidiófo
-ros
Largo, com
matiz
marrom na
metade
superior
Paredes lisas e 
paralelas
Paredes 
grosseiras e 
paralelas
Conidiós
poros
Liso,
incolores
até marrons
Liso,
terminações
verdes, 300-
500 µm
Desbastados, 
incolores
Vesícula Diâmetro
médio (60
mm) e
esférica
25 mm de
diâmetro,
forma de
frasco, fiálides
na metade
superior
Média 40 mm,
globosa,
subglobosa,
fiálides na
superfície
Esterigm
a
Mono ou 
duplo nível
Um só nível Mono ou duplo 
nível
Aspergillus flavus 
Aspergillus niger 
Aspergillus fumigatus
Fundamental para confirmação 
ASPERGILOMA
ASPERGILOMA IMUNOALÉRGICA
 IMUNODIFUSÃO DIRETA
 IMUNOBLOTTING
 ELISA DIRETA
ASPERGILOSE
IMUNOENSAIOS
Resultado falso negativo 
ASPERGILOSE INVASIVA 
(positividade aparece muito tarde)
DETECÇÃO DE GALACTOMANANAS:
 Podem ser detectadas no soro em estágio inicial, anterior a sinais
clínicos e RX.
ELISA (Platelia Aspergillus Bio Rad):
• Sensibilidade: 50-90 % ; Especificidade: 81-93%
HÁ POSSIBILIDADE DE SE PESQUISAR ANTÍGENOS 
NO DIAGNÓSTICO DA ASPERGILOSE ?
• Amostras: escarro, sangue total, 
• Primers universais p/ fungos (Panfungal PCR)
• Sensibilidade: 1-10 fg de DNA fúngico
PCR REAL TIME: permitirá controle tratamento!
Problmas: risco de contaminação ambiental
COMO USAR A BIOLOGIA MOLECULAR NO 
DIAGNÓSTICO DA ASPERGILOSE ?
PCR NESTED 
 Sequenciamento do DNA 
 PCR RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição)
RFLP
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL (molecular)
DETECÇÃO AMBIENTAL DE ANTÍGENOS 
ANEMÓFILOS – UMA OPORTUNIDADE ??
Métodos de Diagnóstico Laboratorial 
de Fungos Invasivos: 
- ZIGOMICOSE -
Dr. Alexandre M. Fuentefria 
Prof. Adjunto do Departamento de Análises / Faculdade de Farmácia / UFRGS
Orientador de Mestrado e Doutorado nos programas PPGMAA/UFRGS e PPGCF/UFRGS
Coordenador do Laboratório de Micologia Aplicada da UFRGS
HIFAS
HIALINAS
ASPERGILOSE
(ângulos de 45oC)
DERMATÓFITOS*
LARGAS
(ângulos de 90oC)
ZIGOMICOSE
ENTOMOFTOROMIC
OSE
HIALOHIFOMICOSE
(ângulos de 45oC)
DEMÁCEAS
FEOHIFOMICOSE
Conidiobolus sp.
Basidiobolus sp.
Rhizopus sp.
Mucor sp.
Absidia sp.
Rhizomucor sp.
Alternaria sp.
Bipolaris sp.
Cladophialophora sp.
Curvularia sp.
Exophialla sp.
Phialophora sp.
ONDE LOCALIZAM-SE OS ZIGOMICETOS ?
Pseudallescheria boydii
(Scedosporium 
apiospermum)
Fusarium sp.
QUEM É A FAMÍLIA MUCORACEAE?
• Fungos ubíquos, cosmopolitas;
• Patógenos raros;
• Oportunistas;
• Presença de hifas cenocíticas largas no tecido;
 Reação de Hoeppli-Splendore
• Infecção de rápida evolução;
• Predisposição: Diabetes descompensada (cetoacidose), 
doença linfoproliferativa, pós-transplantados, 
imunodeprimidos, uso de corticoides, etc.;
CARACTERÍSTICAS DOS ZIGOMICETOS ?
Esporângio contendo os esporos
• Forma Rino-orbital-cerebral:  MAIS FREQUENTE
– Inalação de esporos -> seios paranasais;
– Quadro semelhante a sinusite (febre, congestão nasal, 
secreção purulenta, cefaléia e dor nos seios nasais);
– Envolvimento de palato, orbita e cérebro  rápida 
progressão!
PATOGENIA
• Forma Pulmonar: 
– Inalação de esporos -> bronquíolos e alvéolos;
– Pneumonia e infartamento -> necrose;
– Disseminação das estruturas para mediastino, 
coração e via hematogênica para outros órgãos 
(Forma Sistêmica).
• Forma Subcutânea
– Inoculação de esporos na derme  trauma;
– Cateter, picada de insetos, local de aplicação de 
insulina, queimaduras;
– Celulite dolorosa, infarto isquêmico e necrose.
PATOGENIA
Sítios de infecção da Zigomicose
Sítio de infecção % em 1000 
Pacientes
Mortalidade
(%)
Rinocerebral 21 62
Sino-orbital 8 24
Sinusite 8 16
Pulmonar 24 76
Cutâneo 19 31
Disseminado 3 100
Gastrointestinal 7 85
Cerebral 9 79
Roden MM et al., Clin Infect Dis (2005) 41:634-653
Esporângio Esporangiosporo
Columela
Esporangióforo
Apófise
RizóideEstolão
MORFOLOGIA 
• Rhizopus oryzae: 
• Ágar-Sabouraud: crescimento rápido, T0 = 250C;
• Colônia branca, com o tempo fica amarelada;
• Hifas largas, asseptadas, presença de rizóides;
• Esporangióforos simples e/ou ramificados (hialinos a marrom);
• Esporângios globosos, escuros, com cogumela.
AGENTES ETIOLÓGICOS 
Rizóide
Esporângio
• Mucor:
• Ágar-Sabouraud: crescimento rápido, T0 = 250C;
• Colônia branca, posteriormente cinza e/ou amarela;
• Micélio cenocítico, hialino  AUSÊNCIA de rizóides
• Esporangióforos simples e/ou ramificados, terminando em 
cogumelas;
• Esporangiosporos esféricos ou elípticos.
AGENTES ETIOLÓGICOS 
• Rhizomucor sp.
• Colônias de crescimento rápido.
• RIZÓIDES distantes dos esporangiófaros / COLUMELA
desnuda
• Textura algodonosa inicialmente brancas  com o decorrer da 
esporulação tornam-se acinzentas.
• As espécies de Rhizomucor são TERMOFÍLICAS (50 – 58°C).
AGENTES ETIOLÓGICOS 
Colônia: branca, 
amarelada a marrom
Colônia: branca, 
amarelada a marrom
Colônia: branca, 
algodonosa
Colônia: branco-
cinza, cotonosa
presença de 
nós, estolões 
e rizóides.
Zigosporos escuros
Esporângios 
escuros globosos –
no ápice do 
Esporangióforo.
sem estolões 
e rizóides
Zigosporos escuros
Esporângio
s globosos, 
escuros
Esporangióforo
marrom, com 
ramificações do tipo 
monopodial e/ou 
simpodial
esporangiosporos
esféricos a elípticos, 
lisos
dos estolões 
elevam-se 
esporangiófaros
simples e/ou 
ramificados.
Rizóides -
nos nós dos 
estolões
Zigosporos com parede 
celular espessa 
equinulada e filamentos 
circinados.
• HISTOPATOLÓGICO
• Coloração de HE, etc;
• Visualização de hifas cenocíticas largas;
• Ramificações em ângulo reto.
• EXAME DIRETO
• CULTURAL
• Falsos-negativos!
• IMAGEM
• Ressonância, tomografia, raio X;
• BIOLOGIA MOLECULAR
• Primers IT1, ITS4, ZM1 e ZM2.
• IMUNOENSAIOS Imunodifusão e Imunofluorescência
DIAGNÓSTICO
• Homem, 27 anos, LES com pneumonite e glomerulite lúpica, uso de 
corticoide sistêmico;
• Hepatite medicamentosa, insuficiência renal e hepática;
• 20 dias após internação apresentou EDEMA PERIORBITAL, mais 
intenso no olho esquerdo;
• 1 dias depois apresentou necrose cutânea no canto interno do olho 
esquerdo, necrose de palato e necrose de seios paranasais;
• Biopsia da lesão: presença de hifas largas tortuosas, com 
ramificações em ângulo reto e raras septações.
• Invasão fúngica nos vasos de pequeno calibre, formação de 
trombos.
RELATO DE CASO
• TTO: Anfotericina B (25mg/dia 75mg/dia);
• Sinais de comprometimento SNC;
• Óbito, 8 dias após manifestação inicial de edema.