Relatório da aula prática Enzimas

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Relatório da aula prática - Atividade da peroxidase 
Prof. Dra. Giuseppina Pace Pereira Lima
Beatriz Zerbinato Balista
Botucatu, 2020.
Introdução
A peroxidase é uma enzima que degrada Peróxido de Hidrogênio (H2O2). Essa molécula de H2O2 é um radical livre, que pode ser danoso para a célula se presente em grande quantidade, pois causa o rompimento da membrana e a perda de seletividade celular, e como consequência leva a morte celular. 
Sendo assim, há o aumento da atividade da enzima Peroxidase para evitar os altos níveis de Peróxido de Hidrogênio e consequentemente a morte celular. A atividade da peroxidase na maioria dos casos, aumenta sob diferentes situações de estresse, provocadas por ferimentos, infecções causadas por fungos, salinidade, déficit hídrico, déficit nutricional, dentre outros, isso ocorre devido à essas condições aumentarem os níveis de peroxido de hidrogênio e assim ocorre o aumento da atividade da peroxidase, para conter os danos à célula. Para que isso seja feito, ela quebra o peroxido de hidrogênio em substancias não danosas. 
Além de indicar condições de estresse a peroxidase também indica a qualidade em alimentos – enzimas de escurecimento enzimático; variações de cor, aroma e textura-. Além de indicar senescência – útil nos pós colheita da indústria do papel. 
Nesta aula pudemos aprender sobre a atividade da peroxidase, na batata-doce (‎I. batatas). Foi realizado um procedimento para a extração da enzima. 
Material e métodos
Reagentes e Soluções 
1. Solução extratora: Tampão fosfato de potássio a 0,2M – pH 6,7
2. Solução A: Peróxido de hidrogênio (H2O2) à 30%
3. Solução B: Fenol e Amino antipirina (AAP)
Ensaio
A amostra foi macerada em nitrogênio liquido
Na balança analítica, foram pesados 500mg de amostra e com auxílio da pipeta automática, foram adicionados 5ml da solução tampão de fosfato de potássio 0,2M pH 6,7. Centrifugaram sob refrigeração por 10 minutos, sob 6000 rpm. 
Durante o tempo que a amostra estava na centrifuga foram pré-identificados tubos de ensaio: Branco da solução; Branco da Amostra; Amostra (amostra crua e amostra cozida).
Após ser retirada da centrifuga, foram colocados em cada tubo de ensaio uma quantidade do sobrenadante da amostra. E logo após, os tubos foram colocados em banho maria, pré-aquecido, com temperatura igual a 30º C, durante 5 minutos. Essa é a temperatura ideal para que a enzima peroxidase não desnature. 
Com os tubos de ensaio em banho maria, foram acrescentados os reagentes e as reações foram homogeneizadas. 
Portanto cada tubo de ensaio, ficou composto pela seguinte reação: 
Importante salientar que no Branco da amostra não foram colocadas as soluções A e B, para não ocorrer a reação com as soluções e ser possível visualizar o que acontece com a amostra. No branco da amostra, para substituir as soluções de substrato e solução que dá coloração à amostra, foi colocado 1,0 ml de água destilada. 
Os tubos com as reações foram deixados em banho maria durante 5 minutos. Passado o tempo, os tubos foram transferidos para banho maria em água fervente, e foram mantidos sempre sendo homogeneizados. 
Após serem retirados do banho maria, foram realizadas as leituras no espectrofotômetro para medir a absorbância das amostras. 
Para essa leitura, o aparelho foi ajustado com 505nm. A cubeta utilizada foi a de vidro, como leitura de referência foi usada a amostra do tubo branco da solução. Logo após, as cubetas contendo as amostras foram preparadas e as leituras realizadas. 
Resultados
Após análise espectrofotométrica, foram obtidos os seguintes resultados para as amostras. 
	Amostra
	Leitura (nm)
	Resultado Leitura Final 
	Branco da amostra 1 
	0,130
	0,77
	Amostra 1
	0,900
	
	Branco da amostra 2
	0,026
	0,262
	Amostra 2
	0,288
	
Resultado para amostra 1:
U.A = (0,77 x 2) / (6,58 x 5 x 0,5) 
 0,5
U.A = 0,18 μmol H2O2 decomposto. min-1. g-1 massa fresca.
Resultado para amostra 2: 
U.A = (0,262 x 2) / (6,58 x 5 x 0,5) 
 0,5
U.A = 0.063 μmol H2O2 decomposto. min-1. g-1 massa fresca.
Discussão
Foi possível através da pratica, notar a diferença de coloração nas amostras, a amostra crua apresentou além de coloração mais escura, resultado de U.A = 0,18 μmol H2O2 decomposto. min-1. g-1 massa fresca, e a amostra cozida apresentou coloração mais clara e U.A = 0.063 μmol H2O2 decomposto. min-1. g-1 massa fresca. Evidenciando assim que a temperatura influenciou a atividade enzimática. 
Conclusão 
Através da pratica, foi possível notar a diferença de coloração, e a partir desta conclui-se que a temperatura influenciou os resultados obtidos. Além de que pudemos concluir que ocorreu a desnaturação de maior parte da enzima
Literaturas Consultadas 
LIMA, G. P. P.; BRASIL, O. G; OLIVERA, A. M. Polyamines and peroxidase activity in bean (Phaseolus vulgaris L.) grown under saline stress. Scientia agrícola, v. 56, n.1, p. 21-16, 1999.
FREITAS, Andreia Andrade de et al. Atividades das enzimas peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO) nas uvas das cultivares benitaka e rubi e em seus sucos e geléias. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, v. 28, n. 1, p. 172-177, mar.  2008.. Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-20612008000100025&lng=pt&nrm=iso>.acessos em 19 maio 2020.  http://dx.doi.org/10.1590/S0101-20612008000100025
BRITO, C.A.K. et al. Características da atividade da peroxidase de abacaxis Ananás comosus ((L.) Merrill) da cultivar IAC gomo-de-mel e do clone IAC-1. Ciência e Tecnologia de Alimentos. 25(2):244-249, 2005. Disponível em <https://www.scielo.br/pdf/cta/v25n2/25018.pdf>. Acesso em 19 maio 2020.