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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS PUC- Barreiro APOSTILA PRÁTICA DE MICROBIOLOGIA de ALIMENTOS SEGUNDO SEMESTRE -2017 ALUNO: ................................................................................ TURMA: ..................................... BANCADA .......................................... NORMAS GERAIS PARA TRABALHOS PRÁTICOS DE MICROBIOLOGIA 1. Os alunos deverão adquirir, para as aulas práticas, o seguinte material: · fósforo ou isqueiro (para uso do bico de gás) · pincel para retroprojetor para identificar o material em uso; 1. É obrigatório o uso de avental (de preferência longo) e vestimentas adequadas nos laboratórios; 1. Os alunos devem estar sempre atentos ao horário das aulas; 1. Ler o roteiro de práticas antes de iniciar o trabalho; 1. A seriedade e responsabilidade são indispensáveis durante os trabalhos experimentais; 1. Não pipetar reagentes com a boca. As substâncias ácidas e básicas devem subir na pipeta por capilaridade; 1. Usar luvas cirúrgicas no trabalho direto com sangue ou material biológico. No manejo com animais usar luvas de couro; 1. Lavar as mãos após a manipulação de material infectado, corrosivo ou tóxico e antes de deixar as dependências do laboratório; 1. Na bancada de trabalho não deve haver acúmulo de objetos permanecendo apenas os indispensáveis à execução das tarefas; 1. Eliminar os resíduos sólidos ou líquidos em recipiente adequado; 1. Nunca colocar material contaminado nas pias; 1. Usar seringas e agulhas hipodérmicas apenas para injeção parenteral. Usar cânulas para aspiração de líquidos dos animais de laboratório quando possível; 1. É proibido fumar, alimentar-se (bem como guardar alimentos) ou ingerir líquidos nas dependências do laboratório e anexos; 1. Todos os acidentes devem ser rapidamente notificados ao coordenador dos laboratórios ou professor responsável; 1. É proibido o acesso às dependências do laboratório dos alunos que não estejam cumprindo as atividades em curso e sem a presença do professor e/ou monitores; 1. Ao término das atividades deixar o laboratório em condições físicas de ser utilizado para as atividades seguintes; 1. Os professores e monitores devem, ao final das atividades, trancar as janelas e portas do laboratório; 1. Durante as atividades práticas, os equipamentos e materiais utilizados são de inteira responsabilidade dos alunos. USO DO MICROSCÓPIO Objetivas de aumento de 10X e 40X: 1. Ao retirar o microscópio da caixa, colocá-lo cuidadosamente sobre a mesa. 1. Ligar a lâmpada, centrar o microscópio observando a posição da objetiva, do condensador, e do diafragma para se obter um campo bem iluminado. 1. Colocar a lâmina preparada na platina do microscópio e com a objetiva de 10X em posição de foco, abaixar o canhão do microscópio por meio de parafuso macrométrico até o aparecimento da imagem. Com o parafuso micrométrico, ajustar a nitidez. 1. Sem mover a platina e o canhão mudar a objetiva para a de 40X. Caso haja necessidade ajustar a luz e o foco. Objetiva de imersão: 1. Ao retirar o microscópio da caixa, colocá-lo cuidadosamente sobre a mesa. 1. Ligar a lâmpada, suspender o condensador ao máximo, abrir todo o diafragma e verificar se o campo está bem iluminado. 1. Colocar a lâmina com uma gota de óleo de cedro sobre o esfregaço, na platina do microscópio. 1. Baixar o canhão de modo a mergulhar a objetiva de imersão no óleo. Suspender o canhão do microscópio utilizando-se o macrométrico até o aparecimento da imagem e com o parafuso micrométrico ajustar a nitidez. AULA PRÁTICA 1 Título: Demonstração da diversidade e distribuição dos microrganismos e lavagem das mãos Introdução: Os microrganismos encontram-se distribuídos por toda a biosfera fazendo parte do ecossistema onde exercem influências no equilíbrio biológico da natureza. Encontram-se permanentemente ou transitoriamente em todos os locais: no solo, nas águas, na superfície interna e externa do homem e dos animais (pele, cavidade oral, estômago, intestinos) e vegetais (PELCZAR et alii, 1996). São encontrados também na atmosfera, e o transporte destes microrganismos pelo ar constitui um grande risco em termos de contaminação principalmente em áreas como indústrias e hospitais tornando-se imperioso que se estude a composição da microbiota do ar pois quanto mais populoso e movimentado é o ambiente mais rico em microrganismos que disseminam-se pelas correntes aéreas e pela movimentação do ar Objetivos: Demonstrar a presença e distribuição dos microrganismos no ambiente e em objetos Observar a diversidade dos microrganismos. Observar a morfologia das bactérias e leveduras através da Coloração de gram Material e Métodos 1ª parte: Escolher um objeto e passar o swab para coleta do material Semear o swab na superfície do Agar BHI e depois na superfície do Agar Sabouraud com cloranfenicol. Incubar as placas: Agar BHI a 37ºC/48h e Agar Sabouraud – 28ºC/ 5 dias 2ª parte: Escolher um local na PUC, abrir as 2 placas ( 1 de Agar simples e 1 de Agar Sabouraud com cloranfenicol) e esperar 15 minutos, fechar as placas. Incubar: as placas: Agar Simples a 37ºC/48h e Agar Sabouraud – 28ºC/ 5 dias Resultados: 1ª parte Anotar os resultados obtidos na tabela abaixo: Parte do corpo Nº colônias em Agar Sabouraud Nº de colônias em Agar BHI B1 B2 B3 B4 B5 Anotar os resultados obtidos na tabela abaixo: Local Nº colônias em Agar sabouraud Nº de colônias em Agar simples B1 B2 B3 B4 B5 Título: Controle do crescimento da população microbiana Introdução: A condição sanitária de uma população humana ou animal é determinada pela sua capacidade de controlar eficazmente as populações microbianas. Os processos podem ser muito específicos, como o fornecimento de medicação eficaz na eliminação dos microrganismos infectantes, ou podem ser mais gerais, como as práticas sanitárias utilizadas no lar e nos hospitais por exemplo. As principais razões para desenvolver o controle de microrganismos são: prevenir a transmissão de infecções e doenças; prevenir a contaminação ou o crescimento de microrganismos nocivos e prevenir a deterioração e o dano de materiais por microrganismos. 2.1) Controle da microbiota das mãos através de lavagem e uso de antissépticos Objetivos: Demonstrar a importância da lavagem e do uso de antissépticos no controle da microbiota das mãos. Material e métodos: Material: 4 placas de petri pequenas com meio àgar simples Álcool 70% PVPI Papel toalha estéril Detergente neutro Métodos: Rotular as placas placa 1 – dedo sujo placa 2 – dedo lavado com detergente placa 3 – dedo tratado com álcool 70% placa 4 – dedo tratado com PVPI 1 aluno por bancada deverá escolher um dedo para o experimento completo Este aluno deverá imprimir a digital do dedo escolhido seguindo esquema acima Incubar as placas a 37ºC por 48h. Resultados: Tabela : Observar as placas e anotar os resultados na tabela abaixo: Nº de colônias totais Bancadas B1 B2 B3 B4 B5 Placa 1 – dedo sujo Placa 2 – dedo lavado com detergente Placa 3- dedo tratado com álcool 70% Placa 4- dedo tratado com anti-séptico PVPI Discussões/Conclusões: Definir microbiota endógena microbiota transitória. Por que as mãos podem servir como veiculadoras de contaminação? Como explicar as diferenças observadas nas 4 placas? Qual foi o efeito da lavagem das mãos na populacão microbiana? Como evitar as intoxicações alimentares e as infecções hospitalares utilizando-se desses procedimentos? AULA PRÁTICA 2 Título: Morfologia bacteriana e método de coloração de Gram (modificada por Burke e Kopeloff Beerman) Introdução: Entre as principais características das células bacterianas estão suas dimensões, forma estrutura e o arranjo, esses elementos constituem a morfologia da célula. De acordo com a espécie as células podem ser esféricas,em bastão ou espiraladas dispondo-se em cachos, grumos, cadeias e filamentos. É importante reconhecer esses padrões de arranjo já que são importantes características taxonômicas utilizadas na identificação dos microrganismos. Uma das técnicas de coloração diferencial mais largamente utilizada em Microbiologia é o método de Gram. As bactérias coradas por esse método pertencem basicamente a dois grupos: o das Gram-positivas (retém o cristal violeta) e o das Gram-negativas (perdem o cristal violeta e coram-se pela safranina) (PELCZAR et alii, 1996). Objetivos: Mostrar aos alunos os métodos de visualização bacteriana (exame a fresco e coloração de Gram) Ressaltar as diferenças entre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas Material e Métodos: 3 lâminas por bancada: Fazer um esfregaço de cultura de E. coli e Staphylococcus ou Bacillus (diluídos em solução salina- 1 tubo por bancada) Fazer um esfregaço de saliva Fixar no fogo e corar pelo método de gram Observar as lâminas ao microscópio com 1 gota de óleo mineral na objetiva de imersão (100X) Desenhar o que foi visto Método de coloração de Gram: 1. Fazer o esfregaço em lâmina, secá-lo próximo ao Bico de Bunsen e fixá-lo passando a lâmina sobre a chama 1. Colocar a lâmina sobre o suporte e cobrir o esfregaço com solução de Cristal Violeta - Deixar atuar por 1 minuto e lavar com água corrente. 1. Cobrir o esfregaço com Lugol - Deixar atuar por 1minuto e lavar com água corrente. 1. Descorar o esfregaço rapidamente com com solução de éter-acetona, por 5 a 10 segundos – Lavar o esfregaço com água corrente. 1. Cobrir o esfegaço com solução de safranina e deixar atuar por 20 segundos. 1. Lavar o esfregaço com água e secá-lo próximo ao Bico de Bunsen . 1. Colocar 1 gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observar ao microscópio de imersão (1000X) Resultados: Desenhe o que foi observado em cada lâmina Discussões/ Conclusões: Quais foram as formas e os tipos de agrupamentos microbianos observados? Qual a importância da coloração de Gram na prática bacteriológica? Qual o papel da parede celular no processo de coloração? Quais as diferenças de composição química da parede celular de bactéria Gram-positivas e Gram-negativas? Quais as funções de cada reagente usado na coloração de Gram? AULA PRÁTICA 3 Título: Isolamento de Staphylococcus spp. da cavidade nasal. Introdução: O gênero Staphylococcus pertence a família Micrococcaceae que compreende cerca de 20 espécies. São cocos Gram-positivos isolados agrupados em aspecto de cachos de uva irregulares, imóveis, não esporulados, aeróbios e não capsulados (LENNETTE et alii, 1993). Os estafilococos são tradicionalmente divididos em coagulase-positivos (capazes de coagular o plasma humano ou de coelho) e coagulase-negativos. As amostras humanas coagulase-positivas são classificadas como Staphylococcus aureus existindo subgrupos da espécie baseados na susceptibilidade a vários bacteriófagos. A fagotipagem não é um procedimento de rotina em diagnóstico laboratorial mas é muito importante em investigações epidemiológicas. A identificação dos estafilococos coagulase-negativos está geralmente limitada a duas espécies: S. epidermidis e S. saprophyticus. Objetivos: Isolar amostras de S. aureus na cavidade nasal de portadores Estudar o S. aureus quanto a morfologia tintorial, patogenicidade e sensibilidade a antibióticos. Qualificar a microbiota nasal dos estudantes. Material e métodos: Material: 2 tubos de agar manitol 2 swabs Métodos: 2 alunos/bancada Inserir o swab na cavidade nasal e semear o swab na superfície do meio manitol Incubar os tubos a 37ºC por 48h Leitura: Após a leitura do tubo fazer um esfregaço da cultura e corar pelo Gram Observar a presença de cocos gram positivos em cachos Resultados: Observar se houve mudança no meio manitol. Tubo amarelo- indica portador de S. aureus Tubo vermelho ou laranja – portador de S. epidermidis ou outras espécies do gênero Staphylococcus Discussão/Conclusões: Quais as principais espécies pertencentes a este grupo? Qual a importância do S. aureus e qual o seu habitat natural? Como demonstrar a patogenicidade do S. aureus ? Título: Isolamento de Streptococcus spp. da orofaringe Objetivos: Isolar amostras de Streptococcus spp., conhecer sua morfologia, coloração e arranjo Estudar alguns aspectos típicos do gênero (cultivo e identificação) Material e Métodos: Material: 2 placas de agar sangue 2 swabs 2 tubos de tioglicolato Métodos: 2 alunos/bancada Inserir o swab na profundidade da garganta Semear o swab primeiramente na superfície do agar sangue e posteriormente semeá-lo no meio líquido de tioglicolato Incubar as placas e os tubos a 37ºC por 48h Leitura: Observar a presença de hemólise (zona clara ao redor das colônias) no agar sangue Observar o crescimento no meio tioglicolato Fazer um esfregaço a partir do tioglicolato, corar pelo gram Observar a presença de cocos gram positivos em cadeias longas Desenhar o que foi visto Resultados: Discussões/ Conclusões: AULA PRÀTICA 4 Contagem de Bolores e Leveduras em alimentos - PAÇOQUINHA E QUEIJO Introdução: Objetivos: Observar a presença de fungos e leveduras em amostras de alimentos –Material e métodos: Pesar 9g de paçoquinha comum, 9 g de paçoquinha diet e 9 g de biscoito água e sal e diluir cada uma das amostras em 90mL de de solução salina, e homogeneizar Inocular 1mL da solução na superfície do meio de agar sabouraud.e espalhar com a alça bacteriológica. Incubar a 28 oC por 3 a 5 dias Fazer a contagem das placas e expressar o resultado em UFC/g INTRODUÇÃO A fabricação de queijos é tradição em várias regiões do estado de Minas, na maioria das vezes, uma fabricação caseira. Porém, atualmente existem grandes indústrias no mercado brasileiro e no exterior. Nestas indústrias, o controle de qualidade do alimento deve ser rigoroso, incluindo as Boas Práticas de Fabricação e a análise microbiológica do alimento. O queijo é um alimento muito utilizado nas dietas por ser ótima fonte de proteína e cálcio, tendo grande variedade de sabores e texturas, entretanto é um alimento facilmente colonizado por micro-organismos diversos devido aos seus componentes, forma de obtenção da matéria prima, manipulação e estocagem. Estas contaminações são responsáveis por alterações no produto final, deterioração e até transmissão de doenças. OBJETIVOS Verificar em amostras de queijo minas o crescimento de micro-organismos em diferentes meios de cultura. METODOLOGIA 1. Identificar os tubos e placas. (grupo, bancada e amostra) 2. Selecionar a amostra a ser testada. 3. Fazer a diluição da amostra. Pesar 25 gramas da amostra de queijo, e adicioná-la ao frasco contendo 225ml de salina. Agitar por dois minutos. 4. Retirar 1 ml e colocar sobre o caldo e/ou meio de cultura. Quando se tratar de meio, espalhar sobre ele com auxílio da alça de Drigalski. 5. Incubar na estufa, por 48 horas. Ágar MacConkey: destinado à detecção de bactérias gram negativas, e a mudança de cor indica a fermentação de lactose. Resultado: colônias de bactérias fermentadoras de lactose tornam o meio rosa, e as bactérias que não são fermentadoras tornam o meio amarelo claro. Caldo Verde Bile Brilhante 2%: destinado à detecção de coliformes em água, alimentos e produtos lácteos. O grupo dos coliformes incluem bacilos aeróbios e anaeróbios facultativos, Gram-negativos, não formadores de esporos e que fermentam lactose, formando ácido e gás a 35°C dentro de 48 horas. A digestão enzimática de gelatina é a fonte de carbono e nitrogênio utilizados para o crescimento do organismo, a Bile bovina e o verde brilhante inibem as bactérias Gram positivas e muitas Gram-negativas que não sejam coliformes, e a Lactose é a fonte de carboidrato. Bactérias que fermentam a lactose e produzem gás são detectadas. Resultados: Bolhas (gás) presentes no tubo de fermentação indicam resultado positivo e negativo com ausência de bolhas (gás) no tubo de fermentação. Pfizer selective enterococcus agar: enterococos podem ser consideradosuma parte essencial da microflora autóctone de seres humanos e animais. Devido à sua ampla distribuição, podem ocorrer em diferentes produtos alimentares, especialmente aqueles de origem animal. O Agar Enterococcus Selectivo de Pfizer é utilizado no isolamento seletivo e cultivo de Enterococcus. Enterococcus são bactérias gram-positivas, normalmente encontradas no intestino e no trato genital feminino. Existem 14 espécies descritas de Enterococcus spp., sendo o E. faecalis e o E. faecium as duas que normalmente promovem colonização e infecções em humanos. E. faecalis constituem 85 a 90% dos Enterococcus spp. identificados, sendo essa espécie a menos propensa ao desenvolvimento de resistência. E. faecium é o menos prevalente, de 5 a 10%, mas apresenta maior propensão ao desenvolvimento de resistência. A emergência desse patógeno nas últimas duas décadas, entre muitos fatores, se deve em parte à sua resistência intrínseca aos antimicrobianos comumente utilizados, como: aminoglicosídeos, aztreonam, cefalosporinas, clindamicina, oxacilina. E. faecium é menos sensível aos antimicrobianos beta-lactâmicos do que E. faecalis devido à baixa afinidade das PBPs (proteínas de ligação da penicilina) a esses compostos. RESULTADOS - Números de unidades formadoras de colônias (UFC) Bancada- Amostra Meio MacConkey Verde brilhante Agar Enterococcus Bancada 1 - Bancada 2 - Bancada 3 - Bancada 4 - - Aspecto das colônias e alterações observadas PRÁTICA 5 – LEITE FERMENTADO E ANTIBIOGRAMA Isolamento de Lactobacillus de leite fermentado Introdução: Objetivos: Observar a presença de Lactobacillus em diversas marcas de leite fermentado Material e métodos: Fazer diluições seriadas a partir de 1 mL de leite fermentado. ( cada bancada deverá usar uma marca diferente) Diluir 1mL em 9 mL de solução salina, transferir 1mL da 1ª diluição para um tubo com 9mL, e novamente 1ml da 2ª diluição para um terceiro tubo com 9mL de solução salina. Inocular 1 ml das 3 diluições na superfície do meio ROGOSA Deixar o meio absorver o líquido e incubar a 37ºC por 48h Resultados: Contar o número de colônias obtidas em cada uma das diluições e comparar os resultados com as outras bancadas Discussões/ Conclusões: Antibiograma Objetivo: Verificar o grau de sensibilidade/resistência de E. coli e S. aureus a diferentes antibacterianos em meio sólido Material e métodos Material: 2 placas de agar Mueller Hinton por bancada Discos de drogas variados ( para Gram positivos e para gram negativos) Swab Pinça Amostra líquida de Staphylococcus aureus e E. coli Métodos: Semear com auxílio do swab amostra de bactéria em placas de Agar Mueller hinton cobrindo toda a superfície. Com a pinça distribuir 4 discos de drogas em pontos equidistantes da placa. Pressionar levemente os discos na superfície da placa. Incubar as placas a 37ºC por 48h Resultados: Observar o aparecimento de halo inibição de crescimento bacteriano nas placas, medir o diâmetro do halo com o auxílio do paquímetro, consultar a tabela de valores de halo (no final da apostila) e anotar os resultados nas tabelas abaixo: E.coli ZONA DE INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO Antibióticos / Bancadas Microrganismos (resistente/ intermediário/ sensível) B1 B2 B3 B4 B5 1 2 3 4 5 S. aureus ZONA DE INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO Antibióticos / Bancadas Microrganismos (resistente/ intermediário/ sensível) B1 B2 B3 B4 B5 1 2 3 4 5 Discussões/ Conclusões: Quais os métodos de susceptibilidade a drogas podem ser utilizados em laboratório? Explique cada um deles. Qual a importância do antibiograma dentro dos hospitais? Você é favorável ao uso indiscriminado de antibióticos? Justifique-se. Tabela1: Tabela dos principais antimicrobianos e valores dos halos de inibição ANTIBACTERIANO RESISTENTE INTERMEDIÁRIO SENSÍVEL ÁC. NALIDÍXICO ≤ 13 14-18 ≥ 19 AMICACINA (AMI) ≤ 14 15-18 ≥ 19 AMPICILINA (Gram +) (AMP) ≤ 11 12-13 ≥ 14 AMPICILINA (Gram - ) ≤ 28 - ≥ 29 AZTREONAM (ATN) ≤15 16-21 ≥ 22 BACITRACINA ≤ 8 9-12 ≥ 13 CARBENICILINA (CAR) ≤ 17 18-22 ≥ 23 CEFOPERAZONA (CFP) ≤ 15 16-20 ≥ 21 CEFOTAXIMA (CTX) ≤ 14 15-22 ≥ 23 CEFOXITINA (CFO) ≤ 14 15-17 ≥ 18 CEFTAZIDIMA (CAZ) ≤ 14 15-17 ≥ 18 CEFTRIAXONA (CRO) ≤ 12 13-15 ≥ 16 CEFALOTINA (CFL) ≤ 14 15-17 ≥ 18 CIPROFLOXACIN (CIP) ≤ 16 17-21 ≥ 22 CLINDAMICINA (CLI) ≤ 14 15-16 ≥ 17 CLORANFENICOL (CLO) ≤ 12 13-17 ≥ 18 ERITROMICINA (ERI) ≤ 13 14-17 ≥ 18 ESTREPTOMICINA ≤ 11 12-14 ≥ 15 GENTAMICINA (GENE) ≤ 12 13-14 ≥ 15 IMIPENEM ≤ 13 14-15 ≥ 16 KANAMICINA ≤ 13 14-17 ≥ 18 NEOMICINA ≤ 12 13-16 ≥ 17 NITROFURANTOINA (NIT) ≤ 14 15-16 ≥ 17 NORFLOXACIN (NOR) ≤ 12 13-16 ≥ 17 NOVOBIOCINA ≤ 17 18-21 ≥ 22 OXACILINA (OXA) ≤ 10 11-12 ≥ 13 PENICILINA G (PEN) (Staphylococcus) ≤ 28 - ≥ 29 PENICILINA G ≤ 14 ≥ 15 PERFLACIN (PEF) ≤ 15 16-18 ≥ 19 RIFAMPICINA (RIF) ≤ 11 12-18 ≥ 19 SULF +TRIMETROPIN (SUT) ≤ 10 11-15 ≥ 16 SULFONAMIDA (SUL) ≤ 12 13-16 ≥ 17 TEICOPLANIN ≤ 14 15-17 ≥ 18 TETRACICLINA (TET) ≤ 14 15-18 ≥ 19 TOBRAMICINA (TOB) ≤ 12 13-14 ≥ 15 VANCOMICINA (VAN) ≤ 9 10-11 ≥ 12 BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA EM MICROBIOLOGIA BIBLIOGRAFIA BÁSICA 1. BURTON, G.R., & ENGELKIRK, P.G. Microbiologia para ciências da saúde. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. 1. STROHL,W.A.,ROUSE, H., FISHER, B.D. Microbiologia Ilustrada. 1 ed. Porto Alegre: Artes Médicas Sul, 2004. 531p. 1. PELCZAR, M.J., CHAN, E.C.S., KRIEG, N.R. Microbiologia. 2 ed. São Paulo: Makron Books, 1996. Vol. 1., 542p.; vol. 2, 515p. 1. TORTORA, G.T. et alii. Microbiologia. 6 ed. Porto Alegre: Artes Médicas Sul, 2005. 827p. 1. BLACK, J.G. Microbiologia. Fundamentos e perspectivas. 4 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002, 829p. BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTAR (sugestões de consulta) 1- ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da célula. 3. Ed. Porto Alegre: Artes Médicas, 1997. 1293p. 2- BARNETT, M.L. & HUNTER, B.B. Illustrated genera of Imperfect Fungi. 3 ed. Minnesota: Burgess Publishing Company. 1983. 241p. 3- KONEMAN et alii. Diagnóstico Microbiológico. 5 ed. Rio de Janeiro. Ed MEDSI, 2001. 4- JORGE, A O C. Microbiologia – atividades práticas. 1ed. São Paulo: Livraria Santos, 1997, 183p. 5- LACAZ, C. S, PORTO, E., MARTINS, J.E.C. Micologia Médica. 8 ed. São Paulo: Sarvier, 1991. 385p. 6- MARSHALL, J.R. Microbiologia-manual de laboratório clínico. 1ed. São Paulo: Livraria santos, 1995 7- MASA, L.M., PEZZLO, M.T., BARON, E.J. Color Atlas of diagnostic Microbiology. 1 ed. St. Louis, Missouri: Year Book, 1997. 100p. 8- MIDGLEY, G., HAY, R.J., CLAYTON, Y.M. Micologia Médica. 1 ed. São Paulo: Manole. 1998. 155p 9- RIBEIRO, M.C. & SOARES, M.M.S.R. Microbiologia prática – roteiro e manual. São Paulo: Atheneu, 1998. 112p. 10- SILVA, C.M.S., ROQUE, M., MELO, L.S. Microbiologia Ambiental: manual de laboratório. Embrapa Meio Ambiente. 2000. 11- MELO, I.S., AZEVEDO, J.L. Microbiologia Ambiental . Embrapa. 1997. 12- SOARES, J.B., MAIA, ACF. Água, Microbiologia e tratamento. UFC edições. 1999 13- ROITMAN, I. et al. Tratados de Microbiologia. Volume 2. Editora Manole. 1991.
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