Exercício Controle de Qualidade Micro

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Exercícios sobre Pirogênios e Endotoxinas Bacterianas
1) Realizou-se testes de pirogênios para 2 lotes de uma solução injetável de arteméter de acordo com a Farmacopeia Brasileira 5ª edição. Utilizando os dados abaixo, complete as tabelas e conclua sobre os resultados dos testes de pirogênios.
Lote A
	COELHO
	Temperatura inicial
	Temperatura durante o teste
	Diferença
	
	1ª medida
	2ª medida
	Média
	1ª hora
	2ª hora
	3ª hora
	
	1
	39,2
	39,4
	
	39,2
	39,0
	39,1
	
	2
	39,0
	39,2
	
	39,3
	39,4
	39,2
	
	3
	39,1
	39,3
	
	39,2
	39,6
	39,3
	
a) O lote A pode ser aprovado no teste de pirogênios? Explique.
Lote B
	COELHO
	Temperatura inicial
	Temperatura durante o teste
	Diferença
	
	1ª medida
	2ª medida
	Média
	1ª hora
	2ª hora
	3ª hora
	
	1
	39,2
	39,4
	
	39,2
	39,2
	39,1
	
	2
	39,0
	39,2
	
	39,3
	39,6
	39,5
	
	3
	39,1
	39,3
	
	39,2
	39,6
	39,3
	
Houve a necessidade de testar mais cinco animais. Por quê?
Os resultados para os 8 coelhos são apresentados abaixo.
	COELHO
	Temperatura inicial
	Temperatura durante o teste
	Diferença
	
	1ª medida
	2ª medida
	Média
	1ª hora
	2ª hora
	3ª hora
	
	1
	39,2
	39,4
	
	39,2
	39,2
	39,1
	
	2
	39,0
	39,2
	
	39,3
	39,6
	39,5
	
	3
	39,1
	39,3
	
	39,2
	39,6
	39,3
	
	4
	39,3
	39,5
	
	39,9
	39,8
	39,6
	
	5
	39,1
	39,5
	
	39,9
	39,7
	39,8
	
	6
	39,5
	39,7
	
	39,5
	39,6
	39,6
	
	7
	39,2
	39,4
	
	39,7
	39,6
	39,8
	
	8
	39,4
	39,6
	
	39,5
	39,4
	39,5
	
b) O lote B pode ser aprovado no teste de pirogênios? Explique.
2) Realizou-se teste de endotoxinas bacterianas para o produto ácido ascórbico solução injetável. Complete as tabelas e respondas as questões.
Produto: ácido ascórbico solução injetável
Concentração: 100 mg/mL
Limite de endotoxina: no máximo 1,2 UE/mg de ácido ascórbico
Sensibilidade rotulada do lisado: 0,12 UE/mL
a) Confirmação da sensibilidade rotulada do lisado
	Réplica
	Diluições de endotoxina (UE/mL)
	
	
	
	0,50
	0,25
	0,12
	0,06
	0,03
	
	
	1
	+
	+
	+
	+
	−
	
	
	2
	+
	+
	+
	+
	−
	
	
	3
	+
	+
	+
	−
	−
	
	
	4
	+
	+
	+
	−
	−
	
	
Sensibilidade calculada do lisado: ____________________________________
A sensibilidade está de acordo com a sensibilidade rotulada do lisado? Justifique.
b) Teste de inibição ou potencialização da amostra
	Réplica
	Diluições de endotoxina (UE/mL)
	
	
	
	0,50
	0,25
	0,12
	0,06
	0,03
	
	
	1
	+
	+
	+
	−
	−
	
	
	2
	+
	+
	−
	−
	−
	
	
Sensibilidade calculada do lisado: ______________________________
Há interferência da amostra com o reagente LAL? Justifique.
Caso haja interferência, o que poderia ser feito para eliminá-la?
Calcule a MDV para a amostra.
c) Amostra - ácido ascórbico solução injetável
	Réplica
	Diluições da amostra
	
	
	
	1
	2
	4
	8
	16
	32
	64
	128
	
	
	1
	+
	+
	+
	+
	+
	+
	−
	−
	
	
	2
	+
	+
	+
	+
	+
	+
	+
	−
	
	
Concentração de endotoxinas na amostra: ____________________________
O produto cumpre o teste de endotoxinas bacterianas? Justifique.
Exercícios sobre Teste de Esterilidade
3) No desenvolvimento de um teste de esterilidade para 3 novas formulações de um mesmo produto injetável utilizando o método de inoculação direta, o farmacêutico responsável pelo controle microbiológico necessitou testar o efeito bacteriostático/fungistático possivelmente presente. Para isso, quatro tubos contendo caldo caseína-soja foram inoculados com 100 UFC de uma determinada bactéria. O primeiro tubo foi utilizado como controle e nos outros três tubos foram adicionados 5 mL de cada uma das três formulações. O tempo de incubação foi de 14 dias. Os resultados foram os seguintes:
	Tubo
	Descrição
	Resultado
	1
	Tubo controle
	Apresentou turvação do meio.
	2
	Formulação 1
	Não houve turvação do meio.
	3
	Formulação 2
	Apresentou pequena turvação do meio, mas inferior à turvação do tubo controle.
	4
	Formulação 3
	Apresentou turvação comparável ao tubo controle.
Com base nos resultados acima e em seus conhecimentos, responda:
a) Qual(is) formulação(ões) não apresentou(aram) o efeito bacteriostático? Por quê? 
b) Qual(is) formulação(ões) apresentou(aram) efeito bacteriostático? Por quê? 
c) Como o efeito bacteriostático pode ser eliminado, principalmente quando se usa o método de inoculação direta? 
d) Considerando o resultado duvidoso do tubo 3, contendo a formulação 2, após 14 dias de incubação, foi retirada uma alíquota deste tubo. Esta alíquota foi transferida para outro tubo contendo meio de cultura e a incubação prosseguiu por mais 5 dias. Ao final do tempo, o tubo não apresentou turvação. O que se pode concluir sobre o procedimento utilizado e sobre o efeito bacteriostático desta formulação? Explique. 
4) Marque verdadeiro ou falso e justifique.
a) ( ) Os produtos estéreis, após a sua fabricação, devem ser submetidos ao teste de esterilidade que comprova a presença ou ausência de endotoxinas.
b) ( ) Ao realizar o teste de esterilidade deve-se escolher entre os meios de cultura (fluido tioglicolato e caldo caseína soja) qual é mais adequado para o produto.
c) ( ) O meio fluido de tioglicolato permite o crescimento de fungos e deve ser incubado à temperatura de 32,5 ± 2,5 ºC durante 14 dias.
d) ( ) Existem dois métodos de inoculação para a realização do teste de esterilidade: método direto ou método indireto (também chamado de método de filtração em membrana). Para o método direto deve-se realizar um controle positivo e um controle negativo, enquanto que para o método indireto deve-se realizar um controle positivo e três negativos.
Exercícios sobre Controle de Qualidade Microbiológico de Produtos não estéreis
5) O teste para controle de qualidade de produtos não estéreis foi realizado em um lote de condicionador. A primeira etapa do teste foi a avaliação do efeito inibidor do produto, por meio da contaminação de uma amostra do condicionador com cepas padrões de microrganismos e avaliação da recuperação microbiana após o período de incubação. 
a) Descreva brevemente a técnica utilizada para avaliação do efeito inibidor do produto, considerando que foi utilizado o método de contagem em placas.
b) Os resultados obtidos para Bacillus subtilis em ágar caseína soja estão apresentados a seguir:
Placa controle: 4,5 x 104 UFC/mL
Placa do produto: 2,8 x 104 UFC/mL
Pode-se considerar que o produto apresenta efeito inibidor para Bacillus subtilis? Justifique.
6) Para o teste de contagem do número de contaminantes pelo método do ágar fundido, podem ser utilizados os métodos de profundidade ou superfície. Descreva a diferença entre os dois métodos e qual fornece maior homogeneidade de crescimento dos microrganismos. 
7) Em relação ao teste de identificação de patógenos pelo ágar TSI, responda:
a) Quais são os tipos de microrganismos que podem ser identificados pelo teste?
b) Qual a função do vermelho de fenol no meio?
c) Em um determinado teste, os seguintes resultados foram obtidos: fundo do tubo amarelo, superfície do tubo vermelha e produção de H2S. Qual o microrganismo isolado?
8) A verificação de eficácia de conservantes foi realizada em um lote de fenobarbital solução oral. O teste foi realizado com uma cepa padrão de Escherichia coli e avaliou-se o crescimento microbiano nas placas no tempo inicial do teste e após 14 e 28 dias de incubação. Os resultados da contagem microbiana nas placas estão apresentados a seguir:
Tabela 1 – Resultados da contagem de E. coli nas placas no tempo inicial do teste.
	Réplicas
	Fator de diluição da amostra
	
	102
	103
	104
	1
	+250
	225
	14
	2
	+250
	247
	20
Tabela 2 – Resultados da contagem de E. coli nas placas após 14 dias de incubação.
	Réplicas
	Fator de diluição da amostra
	
	102
	103
	104
	1
	+250
	118
	5
	2
	+250
	88
	9
Tabela 3 – Resultados da contagem de E. coli nas placas após 28 dias de incubação
	Réplicas
	Fator de diluição da amostra
	
	102
	103
	104
	1
	+250
	117
	5
	2
	+250
	79
	7
Pede-se:
a) De acordo com a categoria do produto analisado, quais os critérios para avaliação do teste segundo a Farmacopeia Brasileira 5ª edição? 
b) Calcular o número de unidades formadoras de colônias por mililitro(UFC/mL) nas placas do produto no tempo inicial e após 14 e 28 dias de incubação.
c) De acordo com os critérios da Farmacopeia Brasileira 5ª edição, o conservante do produto apresenta eficácia adequada? Justifique.
GABARITO
1) a) Lote aprovado.
 b) Lote reprovado.
2) a) Sensibilidade calculada do lisado = 0,08 UE/mL
 b) Sensibilidade calculada do lisado = 0,17 UE/mL
 c) Concentração de endotoxinas na amostra = 0,05 UE/mg. O produto cumpre o teste de enddotoxinas.
3) a) Formulação 3, pois o crescimento microbiano, evidenciado pela turvação do meio, foi comparável ao tubo controle.
b) Formulação 1, pois não houve crescimento microbiano, indicando que o produto apresenta atividade antimicrobiana.
c) Uso de agentes neutralizantes ou diluições do produto.
d) O procedimento foi utilizado para confirmar se a turvação do meio ocorreu devido a interferências por prováveis incompatibilidades físico-químicas entre o produto e o meio de cultura. Como ao final do teste não houve crescimento microbiano, a formulação 2 apresenta efeito bacteriostático.
4) a) Falso. O teste de esterilidade é um teste de segurança biológica, estabelecido para comprovar a ausência total de contaminação por microrganismos viáveis (bactérias, fungos e leveduras), em produtos que para seu uso necessitam ser estéreis.
 b) Falso. Em todos os testes preliminares (controles) e no teste propriamente dito, deve-se inocular a amostra em ambos os meios de cultura: fluido de tioglicolato e caseína soja.
 c) Falso. O meio fluido de tioglicolato é utilizado para detectar a presença principalmente de bactérias anaeróbicas, uma vez que a concentração de oxigênio no meio é baixa. O crescimento de bactérias aeróbicas também pode ser observado nesse meio.
 d) Verdadeiro. Método direto: controle positivo (teste de promoção de crescimento do meio de cultura); controle negativo (teste de esterilidade dos meios de cultura). Método indireto: controle positivo (teste de promoção de crescimento do meio de cultura); controle negativo 1 (teste de esterilidade dos meios de cultura); controle negativo 2 (teste de esterilidade da membrana de filtração); controle negativo 3 (teste de esterilidade do fluido de lavagem).
5) a) Página 41 da apostila.
b) Não, pois a porcentagem de recuperação do microrganismo foi superior a 50%.
6) Página 44 da apostila. Método de profundidade fornece maior homogeneidade de crescimento.
7) a) Bacilos entéricos Gram negativos.
b) Indicador de pH, permite evidenciar a fermentação de açúcares pelos microrganismos. Quando há fermentação de açúcar, o meio fica ácido e o indicador fica amarelo. O meio permanece vermelho no caso de microrganismos que não fermentam açúcar.
c) Salmonella.
8) a) Categoria 3 - 14 dias: redução de 1 log no crescimento microbiano;
 28 dias: não deve haver aumento no crescimento microbiano.
b) Tempo inicial: 2,03 x 105 UFC/mL; 14 dias: 8,65 x 104 UFC/mL; 28 dias: 7,9 x 104 UFC/mL
c) Não. A redução no crescimento microbiano após 14 dias de incubação foi de apenas 0,37 log.