Questões sobre Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

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Questões para reflexão
Boa tarde queridxs alunxs,
Essa atividade será utilizada para avaliação dos conhecimentos após o estudo da aula de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. 
Leia o artigo: (Tocchini & Mercadante, 2001).Tocchini, L., & Mercadante, A. Z. (2001). Extração e determinação, por clae, de bixina e norbixina em coloríficos. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 21(3), 310–313. Disponibilizado no Moodle da disciplina.
Após a leitura o estudo da aula e leitura do artigo, responda as questões que seguem:
1. A separação dos compostos foi realizada por cromatografia de fase reversa ou normal? Justifique.
Normal, pois quando a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, a cromatografia líquida é denominada de cromatografia de fase normal.
2. Qual foi a ordem de eluição dos compostos analisados? 
Bixina e Norbixina. Polpa e suco de cajá, β-caroteno, αcaroteno, β-criptoxantina, zeinoxantina e luteína.
3. Quais características químicas/estruturais determinam a ordem de eluição (tempo de retenção de cada composto)? Explique sua reposta usando as estruturas disponibilizadas na Figura 1.
A ordem de eluição segue tipicamente o peso molecular. As moléculas com o maior peso molecular eluem primeiro. No entanto, o mecanismo verdadeiro da SEC é baseado no tamanho em solução. A maioria das proteínas é compacta, mas algumas moléculas de proteína são cilíndricas, então podem eluir mais cedo do que o esperado devido a seu maior raio hidrodinâmico em solução. Além disso, fases móveis diferentes podem afetar a ordem de eluição devido às alterações no tamanho em solução (raio hidrodinâmico ou raio de giração).
4. No texto do artigo está relatado: “Para separar os carotenoides foi utilizado um cro- matógrafo líquido de alta eficiência constituído de conjunto de bombeamento quaternário de solvente (Waters, modelo 600), detector de arranjo de diodos (Waters, modelo 996), injetor Rheodyne (“loop” de 20µL), degaseificador “on-line” (Waters) e sistema de aquisição e processamento de dados Millenium (Waters). Os espectros foram adquiridos entre 300 e 600nm e processados no comprimento de onda máximo de cada carotenoide.” 
a. O que significa bombeamento quaternário?
SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA. SISTEMA DE BOMBEAMENTO QUATERNÁRIO POSSUI QUATRO CANAIS DE BOMBEAMENTO INDEPENDENTES COM OPERAÇÃO EM MODO ISOCRÁTICO E GRADIENTE DINÁRIO, TERCIÁRIO E QUATERNÁRIO. FAIXA DE OPERAÇÃO DE FLUXO DE 0,01 A 10 ML/MIM. FAIXA DE PRESSÃO 0 A 6100 PSI. PROGRAMAÇÃO DO FLUXO, GRADIENTE E EVENTOS DE TEMPO. CAPACIDADE DE OPERAR EM MODOS DE GRADIENTE LINEAR E EXPONENCIAL VARIANDO DE 1 A 9,9 (POSITIVO E NEGATIVO), VARIAÇÃO COMPOSICIONAL TÍPICA MENOR QUE 0,2%. SISTEMA DE MISTURA DE BAIXA PRESSÃO COM PISTÃO DUPLO. PRECISÃO DE FLUXO COM RSD DE 0,3%. REPRODUTIBILIDADE DO TEMPO DE RETENÇÃO RSD < 0,3%. 
b. O injeto é manual ou automático? Qual é o volume de injeção de amostra utilizado pelos analistas? Como que esse volume pode ser alterado?
Sim, permite misturas em baixos volumes, o volume não pode ser alterado.
c. O que é um degaseificador e qual a sua função?
Um desgaseificador é um equipamento industrial usado durante as operações de perfuração de petróleo e gás. Ele serve como parte de um sistema de lama e foi projetado para remover contaminantes gasosos do fluido de perfuração. Combinado com um dispositivo de remoção de sólidos, como um agitador de xisto, o desgaseificador pode ajudar a limpar a lama de perfuração e permitir que seja reutilizada continuamente durante as operações de perfuração. Ao remover bolhas de gás desse fluido, o desgaseificador também ajuda a reduzir o risco de explosões e outros perigos no local da perfuração.
d. Observe o tipo de detector e a última frase do parágrafo. O que significa adquirir espectros de 300 a 600 nm? Para que essas informações são utilizadas? 
É uma fonte de radiação que emite no visível e no ultravioleta, ou seja, produz uma radiação útil para o espectrofotômetro na faixa de 300 a 600 nm.
O funcionamento dos espectrofotômetros é muito simples. A fonte de radiação emite luz (UV, visível ou IR) e essa luz é fracionada pelo monocromador (prisma ou rede de difração) nos comprimentos de onda que a compõem, ou seja, ela sofre refração. A faixa de comprimentos de onda, inicialmente selecionada, é dirigida para a amostra (soluções, filmes finos, pós). Parte dessa luz é absorvida e parte é transmitida. A luz que é transmitida chega ao detector e lá é transformada em um sinal elétrico. Finalmente, o sinal elétrico é recebido pelo computador que transmite esses dados em forma de espectro (absorção x comprimento de onda). 
e. A aquisição dos cromatogramas foi realizada em apenas um comprimento de onda. Por quê?
Porque os vários caminhos que a fase móvel percorre dentro da coluna ou na camada de líquido imobilizada na fase estacionária, tem dimensões e absorvem a radiação no comprimento de onda selecionado.
f. Segundo a descrição do artigo, quais as informações foram utilizadas para propor uma identificação? 
Os picos correspondentes à bixina e norbixina foram identificados através do comportamento cromatográfico e comparação dos espectros no UV-visíveis fornecidos pelo detector de arranjos de diodos com os fornecidos na literatura.
5. Pigmentos naturais, como o exemplo do artigo, podem ser analisados por colorimetria. Esses métodos são de menor custo que análises por CLAE. Porém, métodos cromatográficos são seletivos. 
a. Você concorda com as afirmações acima? Responda SIM ou NÃO e justifique. 
Sim, porque quando as inclinações das duas curvas são iguais ou muito próximas e a razão entre os dois coeficientes angulares se aproxima de 1, significa que o único efeito de matriz presente é a interferência natural causada pelo nível básico do analito, ou seja, não há efeito de matriz e, portanto, o método é seletivo.
b. Quando que a análise de CLAE é recomendada no lugar de métodos mais simples e de menor custo, como métodos colorimétricos?
O CLAE é um método de separação de compostos químicos em solução, a qual é utilizada na química analítica para identificar e quantificar cada componente em uma mistura. Esta técnica consiste no bombeamento de um solvente líquido pressurizado contendo uma mistura que passa através de uma coluna preenchida com algum material sorvente, ou seja, quando cada componente da amostra interage de forma diferenciada com o material sorvente, gerando diferentes velocidades para cada componente e levando à separação conforme eles percorrem a coluna.