ATIVIDADE artigo micro-RNA e RNAi

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INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
BIOLOGIA MOLECULAR
PROF. CAROLINE RIGOTTO
Nome: Júli Ellwanger
ATIVIDADE
* Ler o artigo de revisão sobre micro-RNA e responda as seguintes questões:
1. O que são micro-RNAs?
São oriundos de pequenas estruturas precursoras endógenas do tipo stem-loop e funcionam como reguladores de diversos processos dos eucariotos como proliferação, diferenciação, desenvolvimento e morte celular, imunidade, interação entre vírus e célula hospedeira, metabolismo, conformação cromossômica, oncogênese, entre outros. Para melhor definir, micro-RNAs são pequenas sequências de RNA que não são traduzidas em proteínas, mas que tem função na regulação dos RNAs condificantes , ou seja, RNAs regulando RNAs.
2. Explique a síntese dos micro-RNAs.
Os miRNAs são transcritos de diferentes regiões genômicas como longos transcritos primários (pri-miRNA) pela RNA polimerase II. Após a transcrição, os pri-miRNAs são processados por uma RNase III chamada Drosha e uma proteína de ligação ao RNA dupla-fita DGCR8/Pasha (3,15), em precursores duplafita de aproximadamente 70 nucleotídeos de comprimento, os chamados pré-microRNAs (pré-miRNAs), os quais possuem a forma de grampo de cabelo, ou haste-alça. Após este processamento, os pré-miRNAs são exportados para o citoplasma pela proteína Exportina 5-Ran-GTP (11). No citoplasma, o pré-miRNA é clivado pela proteína Dicer, gerando uma molécula intermediária dupla-fita de aproximadamente 20 pares de base (pb) (16,17). O miRNA maduro que corresponde a uma das fitas do dúplex de 20pb é, então, incorporado em um grande complexo protéico chamado Complexo de Silenciamento Induzido por RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex) (11) . O RISC é constituído em parte por enzimas helicases e proteínas Argonautas, as quais promovem o desenovelamento do dúplex miRNA:miRNA e a quebra das pontes de hidrogênio que unem as duas fitas. Desse modo, uma das fitas do dúplex pode então, ser incorporada ao RISC, como miRNA maduro enquanto a outra fita do dúplex é degradada (3,4). E aparentemente, a escolha de qual fita servirá como miRNA maduro, parece ser determinada pela estabilidade termodinâmica do dúplex, dando-se preferência à fita cuja extremidade 5´ possui menor estabilidade termodinâmica. Dessa forma, o miRNA maduro incorporado ao RISC pode conduzir o complexo protéico ao mRNA complementar para promover a repressão da expressão gênica.
3. Explique de forma sucinta o funcionalismo destas pequenas moléculas, suas implicações em estados fisiológicos normais e patológicos.
Os miRNAs são expressos de forma temporal dependendo do estágio de desenvolvimento celular e em níveis muito variados entre os diferentes tecidos. Evidências demonstram que os miRNAs exercem funções de oncogenes ou genes supressores tumorais, regulando direta ou indiretamente a expressão de moléculas responsáveis pelo desenvolvimento, diferenciação e proliferação celular. Além disso, por apresentarem expressão tecido e estágioespecífica, parecem correlacionar-se com o estado clinicopatológico do paciente e com o prognóstico da doença. Da mesma forma, a superexpressão ou a deficiência na expressão de determinados miRNAs, mostram-se associadas a uma grande variedade de patologias.
4. Comente sobre suas possíveis utilidades clínicas como ferramentas diagnósticas, prognósticas e terapêuticas.
Os miRNAs também auxiliam no controle da tradução e regulação de genes, tendo potencial como tratamento para diversas doenças. Atualmente, a bioinformática é a ferramenta inicial para a escolha de um miRNA como candidato de um novo fármaco para atuar em terapias. 
Ler o artigo sobre RNA de interferência (RNAi) e novos fármacos e responda as seguintes questões:
1. O que são RNAi?
O RNAi é um mecanismo celular responsável pelo silenciamento gênico pós-transcricional que atua sobre o RNA mensageiro (mRNA), ou seja, é esse mecanismo que determinará o fim da vida útil do mRNA, para que não sejam produzidas proteínas além do necessário.
2. Como funciona os RNAi na célula?
1 - A entrada de um RNA de cadeia dupla (dsRNA), como um transgene introduzido, um elemento genético não desejado ou um intruso viral, desencadeia a via de RNAi das células. Isso resulta no recrutamento da enzima Dicer.
 2 -Dicer digere o dsRNA em fragmentos menores, usualmente de 20-25pb, que são chamados RNA de interferência pequeno (siRNA).
3 - Um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), então, distingue entre as duas cadeias do siRNA, a cadeia direta e a cadeia inversa. As cadeias diretas (com exatamente a mesma sequência do gene alvo) são degradadas.
4 - As cadeias de sentido inverso, por outro lado, são incorporadas ao complexo RISC e utilizadas como guia para os RNA mensageiros alvo (mRNA), de modo específico para a sequência.
5 - Os mRNAs, que codificam para os ácidos aminados, são clivados pelo complexo RISC, inibindo a síntese de proteínas. O complexo RISC activado pode participar repetidamente na degradação de mRNAs.
3. Quais são as principais vias utilizadas para silenciamento gênico através de ação direta em protocolos humanos com RNA interferência?
Duas abordagens distintas podem ser usadas. Na primeira, vetores genéticos, em geral derivados de vírus (como adenovírus, retrovírus ou vírus adenoassociados), são transduzidos nas células, de modo a expressar genes que são transcritos em moléculas de RNAdf na forma de grampo (similares aos miRNA). Essas moléculas são conhecidas como shRNA e têm como alvo o gene que se deseja silenciar. O shRNA é clivado pela proteína Drosha e assim é processado pela maquinaria de RNA interferência celular.
Em uma segunda abordagem, pequenas moléculas de RNAdf podem ser introduzidas diretamente nas células em cultura, visando à degradação específica do gene-alvo. Essas moléculas são conhecidas como siRNA e podem ser introduzidas na célula, por vários tipos de metodologias, para o silenciamento de seu gene-alvo.
4. Quais as vantagens e desvantagens do uso dos RNAi em relação a terapia convencional?
Vantagens: grande potencial terapêutico de silenciamento através de RNA para vários tipos de doenças que podem ser realizados in vivo e ex vivo.
Desvantagem: algumas proteínas não tiveram sucesso pelos métodos farmacológicos.
5. Dê exemplos de protocolos clínicos já em andamento com a terapia de RNAi.
- Tratamentos oftalmológicos 
- Tratamento para diabetes com edema macular.
- Tratamento para infecções respiratórias
- Tratamento contra Aids.