Cromatografia em Camada Delgada - Separação de Lipídeos

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
Centro de Ciências da Saúde
Curso: Nutrição – Bacharelado
Disciplina: Bioquímica
Prof. Dr. Luís Flávio Mendes Saraiva
 
 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA - CCD
ANA LETÍCIA PEIXOTO BARROSO
ISABELA UCHÔA LIMA
Fortaleza, Abril/2020.
O QUE É CROMATOGRAFIA?
	Idealizada por volta de 1900 a cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura. Ela permite fazer a separação, a identificação e a quantificação das espécies químicas, por si mesma ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de análise, de forma simples e fácil.
	Os componentes vão ser distribuídos em duas fases que estão em contato íntimo. Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra se move através dela. Na fase estacionária estará presente o adsorvente enquanto na fase móvel estará presente o solvente enquanto a fase móvel irá arrastar a mistura pela fase estacionária.
	Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, de acordo com sua afinidade química, resultando em migrações diferenciais destes componentes, ou seja, os componentes da amostra têm diferentes velocidades ao passarem pela fase estacionária.
CROMATOGRAFIA DA CAMADA DELGADA:
	A Cromatografia da camada delgada é um método que irá separar componentes de uma mistura sólido - líquido, na qual a fase móvel irá conter o líquido e a fase estacionária irá conter o sólido. Nesse processo a fase móvel migra sobre uma camada delgada de adsorvente, que é um pó insolúvel, dividido de forma muito fina, inerte e é capaz de adsorver as toxinas ou outras substâncias em sua superfície extensa. Essa camada de adsorvente ficará retida em uma superfície plana que será a fase estacionária. 
Esse processo de separação está fundamentado, principalmente no fenômeno de adsorção que é quando as moléculas de um líquido se unem a superfície de um adsorvente. Para ocorrer essa uniam é preciso ter condições ideais de temperatura, de pressão, da área da superfície e das forças de interações entre as moléculas.
	Neste método, a fase estacionária é constituída por uma fina camada de granulado que ficara sobre uma placa inerte, quase sempre de vidro. Já a fase móvel, por sua vez, é bastante variável, sendo comum o emprego de solventes com polaridade média em relação à polaridade dos elementos que compõem a mistura.
	É importante salientar que adsorção é diferente de absorção, uma vez que o último ocorre quando uma molécula se infiltra na outra diferentemente do primeiro, pois, na adsorção, a união entre as moléculas é superficial.
	
ADSORVENTES MAIS UTILIZADOS
	A atividade do adsorvente varia em função da quantidade de água presente no mesmo. Quanto menor o teor de água, maior será a sua atividade, isto é, maior sua afinidade para com as substâncias a separar. A atividade depende, pois, da temperatura e do tempo de aquecimento a que é submetido o adsorvente.
•	 SILICA GEL OU ÁCIDO SILÍCICO
	É uma substância porosa e amorfa. É o adsorvente mais usado na cromatografia da camada delgada e é usada para separar compostos lipofílicos. Possui caráter ácido e uma característica polar, pois possui em sua estrutura hidroxilas (silanóis).
	 Seu mecanismo de adsorção consiste:
 -Si-OH: Interações polares por ponte de hidrogênio, como doador ou aceptor de H. 
-Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo ou dipolo/dipolo induzido.
CURIOSIDADE: A aspiração da sílica causa silicose, um tipo de inflamação pulmonar crônica!
•	 ALUMINA
A alumina é geralmente empregada na separação de compostos lipofílicos e, pelo fato de poder ser preparada com características ácida, neutra e alcalina, é bastante útil na separação de substâncias que apresentam variações do PH.
Mecanismo de adsorção consiste em:
 - Al3+: campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis (sistemas conjugados).
- O2-: sítios básicos favorecem a interação com doadores de H +
A ativação da alumina faz-se depois secagem ao ar durante cerca de 2 h, pelo aquecimento em estufa a 120ºC por 60 min.
TÉCNICA GERAL
1. ESCOLHER FASE ESTACIONÁRIA: 
Na escolha da fase estacionária é preciso levar em consideração a polaridade ( interação com os componentes ), a necessidade de aditivos aglutinantes e substâncias fluorescentes, e a capacidade de adsorção.
2. PREPARAÇÃO DE PLACAS: 
As placas precisam ser resistentes, inertes aos reagentes e solventes, resistentes à temperatura e uniformes.
As placas precisam passar por processos de:
- Limpeza da placa de vidro → detergente e água corrente (eliminação de gordura); 
- Secagem → em estufa 
- Preparação das camadas finas dos adsorventes: Utilização de espalhadores (mais empregada); Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do adsorvente apropriado. 
Dificuldades: Obtenção de solução com viscosidade adequada. 
Placas pré fabricadas: Dispensam a fase de preparação; são mais uniformes e homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais reprodutíveis.
É preciso fazer riscos para determinar o início e o final do processo.
3. ATIVAR PLACAS:
Objetivo: retirar substâncias interferentes e eliminar água
Para ativar varia de um adsorvente para outro - Sílica e alumina ⇒ estufa 105 – 110 ºC por 30 – 60 min;
•	SELECIONAR FASE MÓVEL:
Depende da natureza química das substâncias a serem separadas e polaridade da fase móvel.
É preciso levar em consideração a natureza da fase móvel, da fase estacionária e do soluto. Assim, para solutos muito polares deve-se utilizar um adsorvente de baixa atividade e uma fase móvel de grande poder eluente.
•	APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS 
 Aplicada na forma de solução 0,1 – 1%, dependendo da sensibilidade do revelador, usando solventes mais voláteis possíveis. Aplica-se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos capilares. As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato direto com o solvente durante o desenvolvimento do cromatograma.
•	PREPARAÇÃO DA CUBA:
A placa deve ser colocada, rapidamente (para evitar evaporação) e verticalmente, após aplicadas as amostras, numa cuba de vidro contendo a fase móvel desejada.
. A cuba deve estar saturada com vapor da fase móvel para que o cromatograma se desenvolva regularmente. Para isso, coloca-se papel de filtro na cuba, que ajuda na evaporação e na conseqente satura.
•	 REVELAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS:
Nessa fase são aplicados procedimentos químicos, físicos, ou biológicos ao cromatograma para tornar visível as manchas das substâncias separadas por cromatografia.
Procedimentos Físicos: Luz ultravioleta (aromáticos ou dupla ligação conjugada). Radiação ultravioleta para compostos fluorescentes. 
Procedimentos Biológicos e Enzimáticos: Antibióticos, Enzimas e Substratos. Utiliza -se reações enzimáticas ou bacterianas para tornar a mancha visível. 
Procedimentos Químicos: Aplicação de um reativo químico para formar um derivado colorido ou fluorescente.
•	FATOR DE RETENÇÃO Rf:
Rf = distância percorrida pela substância / distância percorrida pela fase móvel. 
Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com dois algarismos após a vírgula.
APLICAÇÕES LABORATORIAIS
O que essa técnica permite descobrir e analisar no meio químico:
1. MONITORAMENTO E SÍNTESE DE REAÇÕES QUÍMICAS, através do consumo de reagentes e da formação de produtos. Coloca-se uma substância que reage com o meio da placa (adsorvente) e, assim, ocorre uma reação química, que permite ser visualizada em seus detalhes da placa: o reagente, a formação do composto intermediário e a posterior formação dos produtos.
2. ANÁLISE QUALITATIVA, porque podemos ver quais são os componentes ao longo da camada, identificando-os de acordo com a sua polaridade. 
3. DETERMINAÇÃO DAS MELHORES CONDIÇÕES PARA CC (cromatografia em coluna), já que é muito rápida, a CCD (cromatografia em camada delgada) é utilizada para avaliar omelhor solvente a usar na CC. É como se a CCD agisse como um teste, dessa forma, você não precisa desperdiçar tempo testando os solventes na CC, quando pode testá-los mais rapidamente na CCD e já ir pra a CC com o solvente ideal, agilizando o processo e tornando-o mais reproduzível.
APLICAÇÕES NO COTIDIANO
De modo mais prático: SEPARAÇÃO DE LIPÍDEOS
Os lipídeos são pouco solúveis em água, por possuírem natureza fortemente apolar – mesmo que possuam uma parte polar -, e, dessa forma interagem bastante com solventes orgânicos, o que mostra que a CCD é uma separação adequada na distinção de seus componentes.
EXEMPLO: Separação das classes de lipídios por cromatografia clássica e análise por CG do licuri, caxandó e coco.
AUTORES: Florenco Filho, D. (UESB) ; Barreto, P.K.C. (UESB) ; Novais, C.S. (UESB) ; Santos, M.F. (UESB) ; Damasio, J.M.A. (UESB) ; Lacerda, E.C.Q. (UFRJ) ; Santana, D.A. (UESB) ; Simionato, J.I. (UTFPR)
- LICURI: AMÊNDOA CONSUMIDA IN NATURA; COCADAS E LICORES.
 CULINÁRIA BAIANA: LEITE DE LICURI.
- COCO: ÓLEO E FRUTA; MASSA RICA EM GORDURA.
- CAXANDÓ: AMÊNDOA RICA EM ÓLEO.
O licuri, coco e caxandó são frutos bastante conhecidos e consumidos na região nordeste do Brasil. A amêndoa do licuri (Syagrus coronata) é consumida in natura, sendo também utilizada para fabricação de cocadas, licores, e o leite de licuri, muito utilizado na culinária baiana. O côco, bastante conhecido por fazer parte da dieta de uma grande maioria, principalmente em regiões litorâneas, é um fruto cuja massa é rica em gordura e o seu óleo tem sido utilizado como redutor de medidas. Quanto ao caxandó, ainda existem poucos estudos sobre sua composição e características, este fruto é uma espécie da região praieira e assim como o licuri possui uma amêndoa rica em óleo. 
- MULTIPLOS USOS, MAS NEGLIGENCIADOS: o estudo objetivou quantificar e qualificar, mediante a separação CCD, o teor de ácidos graxos presentes em cada uma das classes de lipídeos, a fim de mostrar a utilidade bioquímica e importância desses alimentos na dieta humana.
Apesar da multiplicidade de uso, esses frutos são utilizados em sua grande maioria de forma regional e são pouco valorizados. Estudos recentes têm demonstrado que os constituintes majoritários, em destaque ácidos graxos insaturados e compostos antioxidantes, concentram-se nas cascas e sementes das frutas em geral (MELO et al., 2008; ABRAHÃO et al., 2010). O aproveitamento dessas oleaginosas na obtenção de óleo pode ser uma alternativa para valorização e melhor uso de suas propriedades na alimentação, além de possível emprego na indústria de alimentos, porém existem poucos estudos quanto à caracterização desses frutos, principalmente o licuri e caxandó. Dessa forma, a partir da extração de óleo da amêndoa de frutos foi possível separar e quantificar as classes de lipídios presentes nesses óleos, assim como quantificar o teor de ácidos graxos (AG) presentes em cada uma das classes de lipídios fracionados através de cromatografia gasosa.
- RESULTADOS:
ALTO TEOR DE LIPÍDEOS TOTAIS: 52,67% - LICURI
 20,13% - COCO
 15,66% - CAXANDÓ
CLASSE DE LIPÍDEOS: LIPÍDEOS NEUTROS (90,8% - 98,4% - 90,6%)
 FOSFOLIPÍDEOS (4,70% - 1,23% - 9,24%)
ÁCIDO GRAXO PREDOMINANTE: ÁCIDO LÁURICO (12:0) – SIMILAR A VITAMINA E
A partir dos resultados pode-se observar teor de lipídios totais de 52,67% para o licuri, 20,13% para o coco e 15,66% para o caxandó, evidenciando o alto teor lipídico dessas espécies. Quanto as classes de lipídios, os lipídios neutros apresentaram-se em maior quantidade para o licuri (90,8), caxandó (90,6%) e coco (98,4%), seguido de fosfolipídios com 4,70%, 9,24% e 1,23%, respectivamente. Valores mais baixos foram encontrados para a classe de glicolipídios com 4,50% para o licuri, 0,19% para o caxándo e 0,41% para o óleo de coco. Ao analisar cada classe de lipídios, por cromatografia gasosa, foi possível quantificar as massas dos ácidos graxos presentes em cada classe (Tabela 1). O ácido graxo predominante entre as classes de lipídios foi o ácido láurico (12:0), este funciona como um ativo antioxidante similar à vitamina E, também presente nos óleos. O ácido láurico encontra-se presente em gorduras tropicais pouco empregadas na alimentação, e é principalmente utilizado na produção de sabões, plásticos e emborrachados (Laureles et al., 2002).
VANTAGENS
1. BARATO em relação a outros experimentos, já que os solventes e adsorventes não são caros e são utilizadas pequenas quantidades de amostra.
2. RÁPIDO em relação a outros processos, entretanto, ‘perde’ na rapidez se comparada à cromatografia HPLC.
3. SIMPLES, pois se aplica a quase todos as classes de compostos.
DESVANTAGENS
1. FONTES DE ERROS
Como todo experimento laboratorial, está sujeito a erros que podem dificultar um resultado excelente do procedimento. Portanto, cada passo deve ser feito com cautela e seguindo à risca as regras prescritas no que concerne à quantidades, tempos, materiais, etc.
1.1 ESCOLHA DA FASE MÓVEL
Os melhores resultados geralmente obtêm-se quando utilizar uma mistura de solventes cuja polaridade fica um pouco abaixo da das substâncias a serem separadas.
Se os solventes forem muito polares ou muito apolares, a mistura não irá se separar devidamente, pois passa a haver uma discrepância muito grande em relação aos componentes da mistura. É como se você usasse uma régua que mede em metros para medir milímetros, não haverá precisão alguma e, então um material de 10mm ficará bem próximo de um material de 100mm, impossibilitando uma boa distinção. Se fosse feito com uma régua que mede em milímetros (ou seja, se a polaridade for adequada), conseguiríamos distinguir bem os dois materiais. Muito POLARES: todos os componentes estarão no ÁPICE da plaquinha, como se estivesse um sobre o outro. Muito APOLARES: todos os componentes estarão na BASE da plaquinha.
1.2 DISSOLUÇÃO DAS AMOSTRAS
As amostras devem ser dissolvidas em SOLVENTES BEM VOLÁTEIS, para que assim possam ser rapidamente evaporados após a aplicação. Caso contrário, esses solventes poderão interferir no procedimento, tendo em vista que estarão intimamente incorporados à mistura e, então, dificultarão a boa execução do processo.
2. DIFÍCIL REPRODUTIBILIDADE
É muito difícil a confecção de duas placas idênticas, com a mesma quantidade de amostra. Além disso, a preparação das placas é complicada, estando a cair em desuso, aumentando a AQUISIÇÃO DE PLACAS PREPARADAS.
REFERÊNCIAS
01. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA. http://www.cempeqc.iq.unesp.br/Jose_Eduardo/Cromatografia%20em%20Camada%20Delgada.pdf
02. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA – Instituto de Química, UNESP. http://www.cempeqc.iq.unesp.br/Jose_Eduardo/Blog2013/Aula_28_06/11%20-%20Cromatografia%20em%20camada%20delgada%20LIC%202009.pdf
03. CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA (TLC) – LABORATÓRIO ONLINE. https://www.fciencias.com/2015/03/12/cromatografia-em-camada-fina-tlc-laboratorio-online/
04. 53º Congresso Brasileiro de Química, realizado no Rio de Janeiro/RJ, de 14 a 18 de Outubro de 2013. TÍTULO: Separação das classes de lipídios por cromatografia clássica e análise por CG do licuri, caxandó e coco. http://www.abq.org.br/cbq/2013/trabalhos/10/3672-17145.html
05. AULA DE EXTRAÇÃO DE LIPÍDEOS DA GEMA E ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA DE CAMADA FINA. https://bioquimicaufal.blogspot.com/2013/06/extracao-de-lipideos-da-gema-e-analise.html
06. CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE MINAS GERAIS CAMPUS TIMÓTEO Cromatografia em Camada Delgada. http://sistemas.timoteo.cefetmg.br/nos/_media/bd:roteiro:quimica:cromatografia_04_2019.pdf
07. Técnicas básicas de cromatografia. 2016, Maria Luiza Faria Salatino.
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/1842690/mod_resource/content/1/Aula%202%20-%20T%C3%A9cnicas%20de%20cromatografia.pdf
08. TLC - Cromatografia de camada fina. http://www3.uma.pt/jcmarques/docs/qaii/QAII03TLC2007JCM.pdf
09. LABORATÓRIO 2: ANÁLISE DE LIPÍDEOS.http://www2.iq.usp.br/docente/miyamoto/QBQ0105%20Enfermagem/QBQ0105-Laboratorio_Analise_de_Lipideos.pdf