Introducao ao CRISPR

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Um guia sobre CRISPR para iniciantes
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Introdução à edição Genética
A edição genética envolve a exclusão, inserção ou modificação de 
sequências específicas de DNA no genoma. Por muitos anos, os 
pesquisadores tentavam desenvolver ferramentas fáceis e econômicas de 
edição de genoma para resolver problemas em um amplo espectro de 
campos. Por exemplo, a terapia genética em humanos poderia progredir 
rapidamente se alguém pudesse simplesmente eliminar o gene responsável 
por um determinado distúrbio genético. Na agricultura, a manipulação do 
DNA das plantas poderia ser usada para otimizar o rendimento das culturas 
e controlar as doenças das plantas. Da mesma forma, os genomas 
bacterianos podem ser ajustados para aumentar o rendimento de seus 
produtos em várias aplicações industriais.
Finalmente, os esforços dos pesquisadores foram recompensados com o 
desenvolvimento do CRISPR, uma ferramenta molecular robusta que pode 
editar o DNA em praticamente qualquer lugar. A tecnologia CRISPR está 
iniciando uma revolução nas ciências da vida e está rapidamente se 
tornando uma ferramenta padrão em muitos laboratórios. Dada a sua 
facilidade de uso e versatilidade, o CRISPR já está sendo usado para uma 
variedade de aplicações e possui muitas promessas para o futuro.
Um guia sobre CRISPR para iniciantes
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O que é CRISPR?
CRISPR é um sistema de dois componentes simples que pode ser utilizado 
para atingir uma sequência genómica específica e, em seguida, fazer um 
corte no DNA. Esta poderosa ferramenta permite aos cientistas manipular 
um gene específico de interesse. Por exemplo, pode realizar knock out em 
um gene (tornando-o inativo) ou knock in numa sequência particular, que 
repara uma mutação ou acrescenta uma característica. A seguir, 
descrevemos como CRISPR foi descoberto e desenvolvido como uma 
ferramenta de edição genética poderosa.
A História da CRISPR
As descobertas fundamentais que levaram ao desenvolvimento da 
tecnologia CRISPRCas9 podem ser rastreadas até 1993, quando 
segmentos palindrômicos repetitivos de DNA intercalados com outros 
fragmentos de material genético foram identificados em procariontes (1). 
Esses segmentos repetidos do código genético foram denominados 
Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Interpoladas em Cluster, ou 
CRISPR. No entanto, os segmentos de DNA entre as repetições foram 
realmente a parte interessante.
Em 2007, após anos de estudo, os pesquisadores concluíram que a função 
do CRISPR está relacionada à imunidade procariótica (2). Foram 
necessários esforços combinados de vários grupos de pesquisa nos 
próximos 5 anos para elucidar o mecanismo molecular subjacente por trás 
do sistema CRISPR.
Acontece que as bactérias e as arquéias usam o sistema CRISPR-Cas9 
para se defender contra vírus invasores (chamados bacteriófagos). Ao 
encontrar uma infecção viral, a célula procariótica emprega uma nuclease 
especial associada ao CRISPR (Cas9) para cortar um pedaço de DNA viral, 
criando uma quebra de fita dupla (DSB) em seus locais alvo.
Como a proteína Cas9 reconhece o DNA alvo? É direcionado para a 
sequência alvo por um pequeno fragmento de RNA conhecido como RNA 
guia (gRNA). O RNA guia é complementar a um segmento do genoma viral, 
que permite ao Cas9 clivar o DNA com um alto grau de especificidade.
A clivagem do DNA não apenas destrói o vírus, mas um fragmento de 
DNA estranho, chamado de "espaçador", pode ser armazenado entre as 
seqüências palindrômicas da matriz CRISPR como uma maneira de reter 
a memória genética de infecções passadas. Se o vírus fosse invadido 
novamente, o sistema CRISPR-Cas9 poderia atacar e destruí-lo 
rapidamente. Portanto, essa biblioteca de fragmentos virais é 
essencialmente equivalente ao nosso sistema imunológico, que 
armazena antígenos para se preparar para futuras infecções.
Depois que os cientistas descobriram o mecanismo do CRISPR nos 
procariontes, não demorou muito para que eles percebessem o potencial de 
engenharia dos genomas de micróbios, plantas e animais. Hoje, o CRISPR 
é utilizado para uma variedade de aplicações e sua adoção continua a 
aumentar em laboratórios em todo o mundo.
CRISPR: um conjunto de sequências de DNA envolvidas no sistema 
imunológico procariótico que foi adaptado para a engenharia do genoma.
4
Os componentes do CRISPR
O sistema CRISPR compreende dois componentes: um RNA guia (gRNA) 
específico para a sequência de DNA alvo e uma endonuclease associada ao 
CRISPR (Cas). Para experimentos com CRISPR, o RNA guia e a 
endonuclease Cas são combinados para formar um complexo de 
ribonucleoproteína (RNP).
A proteína Cas funciona como uma tesoura molecular, enquanto o gRNA é o 
GPS que o guia até o local apropriado. Em procariontes, o gRNA guia a 
nuclease para o DNA viral, mas como uma ferramenta biotecnológica, as 
especificações de design do gRNA podem ser alteradas para atingir o 
genoma de qualquer organismo em praticamente qualquer local.
Para muitas aplicações de engenharia genética, a proteína Cas9 (de 
Streptococcus pyogenes) é usada. A ligação do gRNA ao alvo genômico 
depende da presença de um motivo adjacente protospacer curto (PAM) 
localizado diretamente a jusante do alvo (na cadeia de DNA oposta; Fig 1). 
As proteínas Cas de diferentes espécies procarióticas reconhecem 
diferentes motivos de PAM. O PAM para Cas9 é 5'-NGG-3 ', onde N é 
qualquer nucleotídeo.
Se for feita uma correspondência correta com o PAM e se o gRNA se ligar 
com sucesso ao alvo, o Cas9 clivará os dois filamentos de DNA 3-4 
nucleotídeos a montante do local do PAM. Na natureza, esse pequeno 
elemento genético ocorre apenas em vírus invasores (não no genoma 
bacteriano) e, portanto, garante que o Cas9 não decida seu próprio locus 
CRISPR.
5'
3'
3'
5'
cas9
sgRNA
PAMDNA alvo
Figura 1. O sistema CRISPR-cas9.
O sistema CRISPR-Cas9 compreende um RNA guia (gRNA) e nuclease Cas9, que juntos 
formam um complexo de ribonucleoproteína (RNP). A presença de um motivo adjacente 
protospacer específico (PAM) no DNA genômico é necessária para que o gRNA se ligue à 
sequência alvo. A nuclease Cas9 então quebra uma fita dupla no DNA (indicado pela 
tesoura). Mecanismos de reparo endógenos desencadeados pela quebra de fita dupla 
podem resultar em nocaute genético por meio de uma mutação de mudança de quadro ou 
nocaute de uma sequência desejada se um modelo de DNA estiver presente.
RNA guia (gRNA): o componente de RNA da ferramenta de 
engenharia do genoma CRISPRCas9. Contém uma sequência de 
~ 20 pares de bases que é complementar ao alvo genômico.
Proteína de endonuclease associada ao CRISPR (Cas): família 
de proteínas capazes de clivar ácidos nucleicos. Cas9 é a 
proteína Cas mais comumente usada em experimentos CRISPR.
Motivo adjacente protospacer (PAM): uma sequência curta de 
nucleotídeos que deve estar presente a jusante do local alvo para 
que a nuclease faça uma quebra de fita dupla.
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Guia RNA Formatos
Na sua forma natural, o RNAt consiste em dois segmentos distintos de 
RNA: RNA CRISPR (crRNA) e RNA CRISPR transativador (tracrRNA). O 
crRNA é uma sequência de 18 a 20 pb que se liga ao alvo genômico. O 
tracrRNA funciona como um andaime para a interação crRNA-Cas9. Em 
contextos naturais, os RNAs guia formam uma molécula duplex, com os 
segmentos crRNA e tracrRNA recozidos juntos (denotados como cr: 
tracrRNA). No entanto, os RNAs guia agora podem ser produzidos 
sinteticamente com o crRNA e o tracrRNA conectados por um loop de 
ligação. Essas moléculas sem costura são chamadas RNAs de guia único 
(sgRNAs) (Fig 2).
tracrRNA tracrRNA
laço linker
Sequência gRNA alvo Sequência gRNA alvo
crRNA crRNA~ 20 nt ~ 20 nt
Figura 2. Formatos de RNA guia de duas peças e único. Os RNAs guia podem ser 
construídos em dois formatos. a) os componentes crRNA (verde) e tracrRNA (roxo) 
podem ser recozidos juntos para formar um guia de duas peças (cr: tracrRNA) ou b) eles 
podem ser conectados por um looper de ligação (azul) para formar uma molécula 
contínua ( RNA guia únicoou sgRNA).
Criar quebras de cadeia dupla (DSB)
Para muitas experiências de CRISPR-Cas, o Cas9 facilita o processo de 
edição de genes criando um DSB no DNA (Fig 3), semelhante ao que 
ocorre em bactérias e arquéias. Gerar um DSB é a etapa inicial no 
caminho de edição do CRISPR. O mecanismo de reparo a seguir ditará o 
tipo de edição de genes que ocorrerá e influenciará o resultado de edição 
desejado. Na próxima seção, exploraremos dois tipos principais de reparo: 
união final não homóloga (NHEJ) e reparo dirigido a homologia (HDR).
DSB
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
cas9
sgRNA
PAMDNA alvo
Figura 3. Os componentes CRISPR-Cas criam uma quebra de fita dupla. O complexo 
sgRNA e Cas9 forma uma ribonucleoproteína. O sgRNA se liga ao alvo genômico e Cas9 
faz uma quebra de fita dupla (DSB) no DNA.
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Reparando quebras induzidas por CRISPR
Como descrito acima, o CRISPR facilita a geração de DSBs em locais específicos no genoma. No entanto, essa ação por si só não faz com que um gene seja 
editado. Em vez disso, o processo de reparação da quebra permite que sejam feitas alterações no gene alvo. Depois que um DSB é feito, mecanismos inatos 
de reparo do DNA são automaticamente acionados dentro da célula. A seguir, discutiremos dois tipos principais de vias de reparo que são frequentemente 
usadas para editar genes: junção de extremidade não homóloga (NHEJ) e reparo dirigido por homologia (HDR).
União final não homóloga (NHEJ)
Se o objetivo experimental é interromper permanentemente um gene 
para que nenhuma proteína funcional seja produzida (um nocaute), 
então o mecanismo de reparo de união não-homóloga (NHEJ) pode 
ser explorado (Fig. 4, esquerda). O NHEJ liga as extremidades do 
DNA novamente, mas é propenso a erros e pode inserir ou excluir 
nucleotídeos (chamados indels) no processo. Se o número de 
nucleotídeos inseridos ou excluídos não for divisível por três, induzirá 
uma mutação de deslocamento de quadro e provavelmente encerrará 
a função da proteína resultante.
Reparo Direcionado à Homologia (HDR)
Se o objetivo do experimento é substituir o elemento genético alvo 
por uma sequência diferente (uma imitação), a célula pode ser 
direcionada para a via de reparo direcionado por homologia (HDR) 
(Fig 4b). Um modelo de doador de DNA contendo a sequência 
desejada flanqueada por regiões de homologia deve ser 
introduzido junto com os componentes CRISPR às células. As 
células usarão esse modelo para reparar a sequência interrompida 
por meio de recombinação homóloga, incorporando as alterações 
desejadas na região alvo (Fig. 4, à direita).
Indels: inserção ou deleção de nucleotídeos no genoma. Freqüentemente 
causada por junção de extremidade não-homóloga após uma quebra de fita 
dupla no DNA.
Figura 4. Mecanismos de reparo do CRISPR. Os dois mecanismos de reparo mais comuns que facilitam a edição do 
CRISPR-Cas são a junção final não-homóloga (NHEJ) e o reparo direcionado à homologia (HDR). O NHEJ resulta em 
inserções ou deleções de nucleotídeos para reparar o DSB. HDR repara o DSB incorporando um modelo de doador de DNA na 
sequência alvo.
DSB
5'
3'
3'
5'
Não homóloga End
Juntando (NHEJ)
Homologia-Directed 
Repair (HDR)
Inserção
5'
3'
3'
5'
Eliminação
5'
3'
3'
5'
OU
Knock-in Sequência
5'
3'
3'
5'
Knock-in Sequência
homologia
Braços
5'
3'
3'
5'
Template Donor DNA
Molde de DNA doador : uma sequência de DNA específica que deseja ser 
introduzida no genoma flanqueado por braços de homologia para facilitar a 
recombinação homóloga.
7
2. Formação RNP
cas9
sgRNA RNP
cas9 sgRNA crRNA: tracrRNA
Componentes e Mecanismo de Edição CRISPR-cas9
1. Componentes de CRISPR-cas9
5'
3'
~ 20 nt
Sequência de gRNA alvo
crRNA
tracrRNA
linker loop
5'
5'
3'
3'
~ 20 nt
crRNA
Sequência de gRNA alvo
tracrRNA
OU
3. Quebra de fita dupla mediada por Cas9
 
3'
5'
DSB
cas9
sgRNA 5'
3'
PAM
5'
3'
DNA alvo
3'
5'
eliminação de
Inclusão
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
OU
Knock-in Sequência
5'
3'
3'
5'
Knock-in Sequência
homologia
Braços
5'
3'
3'
5'
Figura 5. Edição do genoma do CRISPR-Cas9. 1) Os componentes do CRISPR são um RNA guia (sgRNA ou cr: tracr) e uma endonuclease Cas9. 2) O RNA guia e Cas9 formam uma 
ribonucleoproteína (RNP). 3) Dentro da célula, o RNP cria uma quebra de fita dupla (DSB) no alvo genômico. Um dos dois mecanismos de reparo endógenos pode reparar a interrupção. 
4a) O reparo não-homólogo da junção de extremidade (NHEJ)) é uma via propensa a erros que frequentemente insere ou exclui nucleotídeos (indels). 4b) Se um modelo de DNA for 
fornecido, a via de reparo direcionado à homologia (HDR) pode reparar a ruptura por meio de recombinação homóloga.
4-A. Reparação NHEJ
4-B. Reparo Direcionado à Homologia
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O que podemos 
conseguir usando 
CRISPR?
Depois que os cientistas perceberam o potencial do 
CRISPR, o campo da engenharia do genoma 
cresceu rapidamente. Desde então, o CRISPR tem 
sido utilizado em uma ampla gama de células e 
organismos, incluindo plantas, fungos e mamíferos. 
A tecnologia tem sido usada para manipular genes 
de diferentes maneiras, como alterar suas 
seqüências de nucleotídeos ou alterar sua 
expressão. A Figura 6 mostra alguns dos usos 
atuais da tecnologia CRISPR. Nesta seção, 
discutiremos esses usos em mais detalhes.
Figura 6. Usos atuais da tecnologia CRISPR. A tecnologia CRISPR agora está sendo usada em vários métodos além dos 
tradicionais knockout e knock-ins de genes. Os avanços nos métodos e nas pesquisas do CRISPR deram origem a 
tecnologias como CRISPRi e CRISPRa, proteínas anti-CRISPR, telas CRISPR e uso do CRISPR para marcar genes para 
rastreamento e visualização.
Etiquetas de genes
Triagem
Anti-CRISPR
CRISPRi / a
Knock-ins
knockouts
Um guia sobre CRISPR para iniciantes
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knock-outs
Tornar um gene permanentemente inoperante (não codifica uma proteína 
funcional) é chamado de nocaute. A capacidade do CRISPR de interromper a 
função do gene depende da natureza propensa a erros do mecanismo NHEJ. 
Como descrito acima, os indels que causam mudanças na estrutura de leitura 
de um gene provavelmente terminarão a função do gene. Isto é 
especialmente verdade para turnos de quadros que causam códons de 
parada prematuros.
Também é possível obter um nocaute usando o sgRNA multivias (vários 
gRNAs que têm como alvo o mesmo gene). Ao fazer vários cortes 
simultâneos no DNA, os sgRNAs induzem uma ou mais grandes deleções de 
fragmentos nos genes-alvo. Como essas deleções removem vários 
aminoácidos, muitas vezes tornam o gene alvo completamente inoperante. O 
Gene Knockout Kit v2 e as bibliotecas de triagem da Synthego utilizam essa 
abordagem de vários guias para eliminar genes de maneira robusta.
Ao interromper propositadamente a sequência de um gene (e o mRNA e a 
proteína correspondentes), os pesquisadores podem elucidar o impacto do 
nocaute no fenótipo de uma célula ou organismo. Esta técnica é, portanto, útil 
para uma variedade de aplicações, incluindo a identificação e validação de 
possíveis alvos de drogas, a análise de vias celulares e a validação de 
anticorpos.
Knock-ins
A incorporação de material genético no genoma de uma célula é chamada 
de knock-in. Essas edições são obtidas através da indução de células para 
reparar DSBs por HDR.
Para experimentos em HDR, um modelo de DNA contendo a sequência de 
inserção flanqueada por regiões de homologia deve ser introduzido nas 
células juntamente com os componentes CRISPR. O modelo é usado para 
reparar com precisão a sequência de destino cortada, incorporando a 
sequência de encaixe no processo. O HDR permite que inúmeras 
aplicações de reescrita genômica introduzam mutações de ponto único e 
inseram marcadores selecionáveis. Embora a técnica HDR exija mais 
refinamento, os pesquisadores já empregaram o método para corrigir uma 
mutação geneticamente codificada que causa catarata em camundongos 
(3), demonstrando a prova de conceito do HDR como um método para 
corrigir doençasgeneticamente modificadas.
Knock-out: uma mutação em uma sequência genética 
que faz com que seja inoperante (ou seja, nenhuma 
proteína funcional é produzida).
Knock-in: a integração de uma sequência genética 
estranha no genoma de uma célula.
SgRNA multivias: múltiplos gRNAs projetados para 
atingir o mesmo gene e são introduzidos nas células 
simultaneamente.
10
CRISPR interference (CRISPRi)
Embora o nocaute genético possa ser alcançado interrompendo uma 
sequência genética, a expressão gênica pode ser reprimida sem alterar 
o DNA correspondente. Em 2013, Qi et al. fez uma variante de Cas9 
modificando os domínios da endonuclease para que a enzima não corta 
mais o DNA (chamado Cas9 ou dCas9 morto) (4). Os pesquisadores 
usaram o dCas9 para desenvolver uma técnica em que o complexo 
CRISPR se liga ao seu alvo de DNA, mas não o cliva. A ligação do 
dCas9 impede que o mecanismo de transcrição da célula acesse o 
promotor, inibindo assim a expressão do gene (Fig 7a). A fusão de um 
domínio repressor transcricional (como KRAB) ao dCas9 permite uma 
redução reversível e ajustada na expressão gênica.
Em um aceno à técnica precursora de silenciamento de genes, 
interferência de RNA (RNAi), a técnica de silenciamento de CRISPR foi 
denominada interferência de CRISPR ou CRISPRi (4). Enquanto o RNAi 
reprime os genes destruindo os transcritos do RNA, o CRISPRi reprime 
os genes no nível do DNA. Comparado ao RNAi, o CRISPRi está 
associado a maior eficiência, maior versatilidade e menos efeitos fora do 
alvo.
CRISPR activation (CRISPRa)
Embora as endonucleases de dCas9 possam ser usadas para silenciar a 
expressão gênica, elas também podem ser modificadas para ativar os genes 
alvo (chamados ativação de CRISPR ou CRISPRa). Ao fundir um ativador de 
transcrição (como VP64 ou VP16) ao dCas9, os cientistas estão agora 
desenvolvendo sistemas que podem superexpressar genes de interesse (Fig 
7b). Polstein e Gersbach (2015) criaram um desses sistemas ao fundir 
proteínas induzíveis à luz à Cas9 mutada, fazendo com que a expressão 
gênica seja ativada na presença de luz azul e reprimida na sua ausência (5). 
Outras equipes de pesquisadores, como Zalatan et al. (2015), estão 
construindo sistemas mais complexos para ativação e repressão gênica 
multiplexada em até três locos simultaneamente (6).
dCas9 Ativador gene Expresso
Promotor
dCas9 inibidor gene Silenciado
a) 
CRISPRi
b) 
CRISPRa
Promotor
Figura 7. Mecanismos de interferência e ativação do CRISPR. Os métodos CRISPRi e 
CRISPRa usam Cas9 morto cataliticamente (dCas9) para alterar a expressão gênica de 
alvos sem alterar a sequência genética. Dependendo do regulador transcricional utilizado, 
a expressão gênica pode ser a) inibida ou b) ativada.
RNA interference (RNAi): um processo biológico reversível e transitório pelo 
qual o RNA de fita dupla pode inibir a expressão gênica.
CRISPR interference (CRISPRi): uma técnica que usa Cas9 inativo para silenciar 
ou desativar a expressão gênica sem alterar a sequência de DNA.
CRISPR activation (CRISPRa): uma técnica que usa Cas9 inativo para ativar ou 
ativar a expressão gênica sem alterar a sequência de DNA.
11
Telas CRISPR
Outra aplicação do CRISPR é a triagem funcional em todo o genoma. Até 
recentemente, o RNAi era a abordagem principal para as telas de perda de 
função, onde os genes são sistematicamente inibidos em todo o genoma para 
determinar sua função. No entanto, como mencionado anteriormente, o RNAi 
é atormentado por problemas relacionados à baixa eficiência e altos efeitos 
fora do alvo. Agora, com o CRISPR, as bibliotecas de gRNA estão sendo 
desenvolvidas para eliminar centenas de genes em uma única tela com alta 
eficiência (Fig. 8). A Synthego agora oferece várias bibliotecas de sgRNA com 
matriz que têm como alvo um gene por poço de uma placa de múltiplos poços. 
Essas telas podem ser usadas para várias aplicações, incluindo a 
identificação de possíveis alvos de drogas.
Anti-CRISPR
Embora o sistema CRISPR-Cas9 permita o ajuste fino do DNA genômico, uma 
desvantagem é o risco de efeitos fora do alvo (cortar o DNA no lugar errado). Uma 
solução para esse problema é aproveitar as proteínas anti-CRISPR que inibem a 
atividade da Cas9. Na natureza, os bacteriófagos usam essas proteínas para evitar 
a maquinaria CRISPR dos procariontes. Pawluk et al. (2016) descobriram 
inibidores da proteína anti-CRISPR que eram eficazes contra a nuclease Cas9 de 
Neisseria meningitidis (Nme). De fato, a equipe mostrou inibição da atividade do 
Nme-Cas9 em células bacterianas e de mamíferos usando essas proteínas 
anti-CRISPR (7). Por fim, essa tecnologia pode ser usada para reduzir erros de 
edição. Acontece que a adição de proteínas anti-CRISPR após a edição ocorre 
apenas parcialmente reduz a clivagem nos locais de destino, mas reduz bastante a 
clivagem nos locais fora do alvo.
Visualizações de genes
O sistema CRISPR também pode ser usado para visualizar regiões 
genômicas. Isso é conseguido anexando proteínas fluorescentes (como a 
proteína verde fluorescente; GFP) às proteínas dCas9 ou RNAs guia e 
usando o sistema CRISPR para marcar as partes desejadas do genoma 
(8,9). Essa tecnologia agora permite aos cientistas visualizar ácidos 
nucleicos em tempo real, um processo que anteriormente era 
extremamente difícil de executar.
Anti-CRISPR: Proteínas capazes de inibir a atividade da endonuclease Cas 
bloqueando a ligação ou clivagem do DNA alvo
proteínas fluorescentes: proteínas com propriedades bioluminescentes 
comunmente usadas para visualizar componentes celulares e moleculares.
Aplicar droga / 
tratamento
cas9 + gRNA
biblioteca CRISPR
ATGTCGTAGCGCCGTCGTGAG
CTCCGCTGCGAGCTAAGCTGC
GATCTGCGAGCCCCTATACTA
Sistematicamente interromper uma
conjunto de genes utilizando um
biblioteca CRISPR
Identificar células com o fenótipo 
mutante e genótipo subjacente
Figura 8. Fluxo de trabalho de triagem em matriz 
CRISPR. Um gRNA direcionado a cada gene é introduzido em cada 
poço de uma placa de múltiplos poços. A aplicação de um tratamento 
(como um medicamento) às células permite identificar quais genes 
(quando inoperantes) fazem com que as células tenham uma 
sensibilidade aumentada ou diminuída ao medicamento. Esse 
processo pode ser usado para identificar possíveis alvos de drogas.
12
ETAPAS DE UM EXPERIMENTO CRISPR
O fluxo de trabalho CRISPR, envolve três etapas básicas: Design, Editar, e Analisar.
Design
A primeira etapa de um experimento CRISPR envolve o design dos componentes e 
parâmetros necessários para o seu experimento específico. Você deve projetar seu 
gRNA e escolher uma nuclease Cas apropriada. Em seguida, você precisará escolher 
o formato dos componentes CRISPR, selecionar um método de transfecção e otimizar 
as condições de transfecção para o seu tipo de célula. Essas etapas iniciais garantirão 
que você obtenha uma edição genética bem-sucedida em seu experimento.
Editar
Depois de projetar seu experimento e otimizar suas condições de transfecção, você 
estará pronto para entregar seu gRNA específico do alvo (e nuclease Cas) às suas 
células. Transfecte suas células e permita que a edição do CRISPR ocorra.
Analisar
Após a edição, as sequências genômicas direcionadas devem ser analisadas para 
avaliar a frequência e o tipo de edições feitas. Existem várias ferramentas de análise 
que avaliam dados genômicos e determinam a eficiência da edição. A ferramenta de 
análise gratuita da Synthego, Inference of CRISPR Edits (ICE), avalia os dados da 
sequência Sanger. Ensaios proteicos e fenotípicos também podem ser usados para 
avaliar o efeito da edição de genes.
13
CRISPR no Futuro
O CRISPR recebeu muita atenção principalmente devido à sua 
especificidade e viabilidade como uma ferramenta de edição de genes. 
Consequentemente, o CRISPR revolucionou rapidamente o campo da 
engenharia do genoma. Os avanços que o CRISPR facilitou nos últimos 
anos são verdadeiramente notáveis. Agora, os pesquisadores começaram a 
mexer com a tecnologia para desbloquearseus vastos potenciais que vão 
além dos aplicativos discutidos até agora.
Agora, os cientistas estão usando uma versão modificada do CRISPR para 
explorar a epigenômica - o conjunto de grupos químicos em todo o genoma 
que adornam o DNA e suas proteínas associadas à embalagem de 
histonas. Anteriormente, os pesquisadores eram apenas capazes de 
catalogar a correlação entre marcadores epigenéticos e expressão gênica 
nas células. Agora, um complexo CRISPR que é capaz de acetilar proteínas 
histonas em locais precisos ditados pelo gRNA do complexo foi 
desenvolvido (10). Tais tecnologias podem lançar luz sobre a relação causal 
entre marcadores epigenéticos e expressão gênica no futuro.
O CRISPR também está permitindo a elucidação de grandes porções do 
genoma humano, anteriormente com função desconhecida. Os cientistas há 
muito tentam identificar a localização e a função dos elementos genéticos 
de 'não-gene' que não codificam proteínas, mas acredita-se que tenham um 
importante papel regulador na expressão. O CRISPR está permitindo que 
os pesquisadores eliminem essas regiões previamente desconhecidas para 
estudar seu papel na célula).
Um guia sobre CRISPR para iniciantes
14
O CRISPR também está desempenhando um papel cada vez mais 
importante na indústria biomédica. O processo de descoberta de 
medicamentos é notoriamente longo, árduo e caro. É provável que o 
CRISPR acelere o estágio pré-clínico do desenvolvimento de 
medicamentos. Por exemplo, as bibliotecas de triagem CRISPR estão 
agora disponíveis para facilitar a descoberta de novos alvos de 
medicamentos. O CRISPR também pode ser usado para desenvolver 
modelos de doenças precisos para validar possíveis medicamentos. 
Paralelamente, a pesquisa usando CRISPR para terapias in vivo e ex vivo 
está aumentando. Há um otimismo substancial de que a edição de genes 
permitirá o desenvolvimento de melhores terapias e medicamentos mais 
personalizados em um futuro próximo.
O CRISPR não está apenas preparando o caminho para os pesquisadores 
resolverem os problemas mais difíceis nas ciências biomédicas, mas 
também está permitindo avanços em outros campos científicos. A 
tecnologia CRISPR promete proporcionar alguns avanços 
verdadeiramente impressionantes nas próximas décadas, particularmente 
em relação à terapêutica humana, biologia agrícola, biocombustíveis e 
pesquisa científica básica.
Referências
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Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei 
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Sobre o Movimento Biotecnologia Brasil
Somos uma instituição que visa mobilizar os cidadãos em 
favor de implementar planos, programas, projetos, ações e 
atividades para o efetivo desenvolvimento da Biotecnologia 
no Brasil. Defendemos a interação do Governo Federal com 
o setor empresarial, academia, laboratórios públicos e 
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os diversos setores que utilizam a biotecnologia no país.
Um guia sobre CRISPR para iniciantes