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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS ESCOLA SUPERIOR DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Disciplina: Bioquímica – ESA0222 AULA PRÁTICA – Introdução ao laboratório e à bioquímica clínica básica 1. Objetivos - Compreender normas gerais de segurança no laboratório e a importância dos testes bioquímicos; - Conhecer alguns EPI, EPC, equipamentos, vidrarias, materiais, símbolos de risco e classificação de resíduos; - Discutir as principais considerações para as quais é preciso estar atento quando se solicitam exames laboratoriais e se interpretam os resultados. - Explicar como os intervalos de referência são determinados e como eles são utilizados pelo laboratório e pelos profissionais da área da saúde. - Conhecer amostras biológicas que podem ser empregadas para testes de bioquímica clínica e cuidados a serem observados durante a coleta, a manipulação e o processamento das amostras. - Exemplificar analitos que podem ser testados em perfis bioquímicos. 2. Normas gerais de segurança no laboratório - Usar jaleco, luvas e demais equipamentos de proteção individual requeridos. - Usar calça comprida e calçado fechado. - Não beber, comer, fumar ou correr. - Nunca testar amostras ou reagentes pelo sabor ou odor. - Não levar as mãos à boca, nariz, olhos e ouvido no laboratório. - Em caso de qualquer incidente, manter a calma e chamar o professor ou técnico responsável. - Todos os objetos pessoais (bolsas, mochilas, eletrônicos, entre outros) devem ser guardados em armários localizados na entrada do laboratório, não sendo permitido portar ou permanecer com os mesmos na área das bancadas. - O uso de equipamentos eletrônicos pessoais (smartphones, tablets e similares) não são permitidos no laboratório, durante as atividades práticas. - Brincadeiras e/ou conversas paralelas não são permitidas no laboratório. - Entregar ao técnico ou responsável as vidrarias trincadas, lascadas ou quebradas. - Antes de manipular qualquer reagente, deve-se ter conhecimento de suas características com relação à toxicidade, inflamabilidade e explosividade. - Identificar claramente os reagentes e as soluções que serão utilizadas, assim como prestar atenção e seguir corretamente o roteiro de aula, sem improvisações, evitando equívocos, erros ou acidentes. - Usar corretamente os equipamentos, vidrarias e demais materiais. - Orientar-se com o professor e/ou técnico do laboratório, quanto ao descarte de reagentes e/ou outros resíduos. - Manter a organização na bancada. 3. Segurança no laboratório: riscos físicos, químicos e biológicos A biossegurança é um conjunto de estudos e ações destinados a prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes às atividades que possam comprometer a saúde humana, animal, vegetal e o meio ambiente. Em relação à segurança no laboratório, visando evitar a ocorrência de acidentes e proteger o indivíduo, a coletividade e o ambiente, frente aos riscos físicos, químicos e biológicos existentes, destaca-se o uso de equipamentos de proteção individual (EPI) e equipamento de proteção coletiva (EPC). EPI refere-se a roupa ou equipamento especializado usado por profissionais para se protegerem da exposição direta ao sangue ou a outros materiais potencialmente infecciosos ou perigosos; inclui, mas não está limitado, a luvas, jaleco, calçados de segurança, protetores oculares, respiratórios, auditivos e faciais. EPC tem como função a proteção do ambiente e a manutenção da saúde, além da integridade dos ocupantes de uma determinada área. Além dos extintores de incêndio, outros exemplos são: Autoclave: para o processo de esterilização de materiais ou resíduos produzidos em laboratório, diminuindo os efeitos contaminantes dos resíduos sobre o meio ambiente. Capela: é uma câmara de exaustão na qual são manuseadas substâncias ou realizados experimentos que originam gases tóxicos ou inflamáveis. Cabine de segurança biológica: uma cabine de trabalho especial que fornece proteção enquanto trabalha com microrganismos infecciosos. Chuveiro e lava-olhos de emergência: equipamento de segurança utilizado no caso de acidentes no laboratório. Extintores de incêndio: para acidentes envolvendo fogo. São classificados de acordo com o material envolvido no incêndio. Extintores tipo “ABC” são usados com eficiência em incêndios de classes A, B e C. Laboratórios que trabalham com reagentes químicos constituem um ambiente potencialmente perigoso. Por isso, símbolos de risco foram estabelecidos, visando servirem como avisos de alerta a serem interpretados, objetivando-se evitar a ocorrência de possíveis acidentes. O Regulamento (CE) n.º 1272/2008, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 16 de Dezembro de 2008, relativo à Classificação, Rotulagem e Embalagem de substâncias e misturas químicas (Regulamento CRE) introduziu um novo sistema de classificação e rotulagem de produtos químicos, baseado no Sistema Mundial Harmonizado das Nações Unidas (GHS da ONU). Pictogramas relacionados, constam a seguir: 4. Classificação dos resíduos De acordo com a Resolução Conama no 358, de 29 de abril de 2005, os resíduos são classificados nos grupos a seguir: Grupo A — Resíduos com a possível presença de agentes biológicos que, por suas características de maior virulência ou concentração, podem apresentar risco de infecção; Grupo B — Resíduos com substâncias químicas que podem apresentar risco à saúde pública ou ao meio ambiente, dependendo de suas características de inflamabilidade, corrosividade, reatividade e toxicidade; Grupo C — Quaisquer materiais resultantes de atividades humanas que contenham radionuclídeos em quantidades superiores aos limites de eliminação especificados nas normas da CNEN (Comissão Nacional de Energia Nuclear) e para os quais a reutilização é imprópria ou não-prevista; Grupo D — Resíduos que não apresentem risco biológico, químico ou radiológico à saúde ou ao meio ambiente, podendo ser equiparados aos resíduos domiciliares; Grupo E — Materiais perfurocortantes ou escarificantes, como lâminas de barbear, agulhas, escalpes, ampolas de vidro, brocas, limas endodônticas, pontas diamantadas, lâminas de bisturi, lancetas, tubos capilares, micropipetas, lâminas, lamínulas, espátulas e todos os utensílios de vidro quebrados no laboratório (pipetas, tubos de coleta sanguínea e placas de Petri) e demais similares. A Política Nacional de Resíduos Sólidos (PNRS) – Lei n.º 12305/2010 (BRASIL, 2010), e as normas nacionais sobre o gerenciamento de Resíduos de Serviços de Saúde - RSS, padronizam as orientações técnicas quanto à obrigatoriedade do tratamento prévio das frações infectantes dos RSS, antes do seu descarte final (ANVISA, 2004 e CONAMA, 2005) 5. Principais equipamentos, vidrarias e outros materiais utilizados no laboratório Equipamentos Agitador magnético: equipamento destinado a homogeneizar soluções que podem ou não possuir aquecimento próprio. Balança digital: é usada para medir massa de sólidos e líquidos não-voláteis com grande precisão. Banho-maria: é um aquecedor de água termostatizado por meio de resistência elétrica que atinge a temperatura máxima de 100°C. Centrífuga: serve para acelerar o processo de decantação. São aparelhos que, por meio da força centrífuga, forçam uma substância insolúvel em uma mistura líquido–sólido a se precipitar rapidamente. Estufa: é utilizada para secagem de material cujo controle de temperatura se dá por meio de termostato. Vidrarias Balão volumétrico: possibilita medidas de volumes exatos. Possui volume definido e nele se preparam as soluções. Béquer: serve para fazer reações entre soluções, dissolver substâncias sólidas, efetuar reações de precipitação e aquecer líquido. Mede volumes aproximados. Erlenmeyer: utilizado em titulações, aquecimento de líquidos, para dissolver substâncias e proceder a reações entre soluções. Usado principalmente para misturar substâncias líquidas. Bureta: é utilizada em análises volumétricaspara dispensar líquidos com grande exatidão. Pode livrar-se de quantidades de volume variáveis, devido às marcas de graduação e extensão. Funil: também não pode ser aquecido. Usado na filtração e para a retenção de partículas sólidas. Proveta: não pode ser aquecida e serve para medir e transferir volumes de líquidos que, embora não exatos, são mais precisos do que de um béquer ou Erlenmeyer. Pipeta graduada: utilizada para medir volumes pequenos e variáveis. Possui precisão superior à da proveta. Não pode ser aquecida. Pipeta volumétrica: usada para medir e transferir volumes fixos de líquidos. Não pode ser aquecida, pois possui grande precisão de medida. A pipeta volumétrica fornece a medida mais exata em laboratório. Tubo de ensaio: empregado para fazer reações em pequena escala, principalmente em testes de reação em geral. Pode ser aquecido cuidadosamente direto sob a chama do bico de Bünsen. Existem tubos especiais para centrífugas, utilizados em reações químicas, que formam substâncias insolúveis, e que necessita de uma precipitação rápida por meio de um centrifugador. Outros materiais Estante para tubo de ensaio: é usada para suporte de tubos de ensaio. Pinça de madeira: usada para segurar o tubo de ensaio durante o aquecimento. Pisseta ou frasco lavador: usada para lavagens de materiais ou recipientes por meio de jatos de água, álcool ou outros solventes. Pipeta automática: são muito utilizadas nos laboratórios. Podem ter volumes variáveis e possibilitam a transferência de quantidades muito pequenas de líquidos, da ordem de microlitros. 6. Procedimento de pipetagem com pipetas automáticas - Escolher a pipeta a ser utilizada. - Ajustar (se de volume variável) o volume a ser pipetado. - Colocar a ponteira indicada para a pipeta automática. - Pressionar o êmbolo da pipeta até o primeiro estágio (trava), inserir a ponteira dentro do recipiente contendo a amostra ou reagente a ser aspirado e soltar o êmbolo lentamente. - Inserir a ponteira contendo o líquido pipetado e que está acoplada a pipeta dentro do tubo de ensaio, no qual será dispensado o líquido e pressionar o botão até o segundo estágio (final). - Dispensar a ponteira utilizada em recipiente destinado ao seu descarte. - Após o uso, ajustar o volume para o valor máximo especificado no corpo da pipeta (se de volume variável) e colocar no suporte para pipetas automáticas. 7. Importância dos testes bioquímicos Analitos são substâncias químicas que são submetidas à análise química. Os testes bioquímicos podem ser para analito, ou substâncias que têm uma função biológica, metabólitos não funcionais ou produtos de excreção, fármacos, substâncias tóxicas ou que indicam dano celular ou doenças. Profissionais da área de saúde podem contar com o auxílio dos resultados de testes bioquímicos e outros exames laboratoriais no estabelecimento de diagnósticos, na avaliação de um tratamento e na prevenção de doenças. Os resultados devem ser confiáveis para basear o diagnóstico e o tratamento nesses achados. De modo que, as amostras precisam ser coletadas, manipuladas, armazenadas, analisadas e os resultados calculados e informados, por meio de procedimentos corretos e adequados de segurança e de controle de qualidade. A interpretação do resultado de um teste deve estar embasada na compreensão dos processos bioquímicos e fisiológicos que ocorrem tanto na saúde quanto na doença. Os exames laboratoriais atuam como marcadores substitutos de patologia tecidual, mas não fornecem evidências definitivas dessa patologia e, portanto, não devem ser utilizados como único meio de estabelecer um diagnóstico em determinado paciente. 8. Amostras biológicas Amostra do paciente é parte do material biológico de origem humana utilizada para análises laboratoriais. São líquidos, secreções, excreções, fragmentos de tecido obtidos do corpo humano e que possam ser analisados. Nas análises laboratoriais de bioquímica, entre as amostras biológicas empregadas estão o sangue (capilar, venoso e algumas vezes, arterial) total, o soro ou o plasma, a urina, o líquido cerebrospinal, os fluidos pleural, sinovial e pericárdico, ressaltando-se o primeiro como o mais empregado. Algumas análises bioquímicas podem ser realizadas a partir de sangue total. Todavia, o soro e o plasma são as amostras preferenciais para a maioria das mensurações. O plasma é uma solução aquosa na qual os elementos formados do sangue estão suspensos, constituindo o líquido amarelado remanescente, após a remoção das células sanguíneas do sangue anticoagulado. Uma das técnicas mais simples para separar a parte líquida do sangue (plasma) da parte sólida, é através da centrifugação, por meio de uma centrífuga. Se o sangue coletado não é tratado com anticoagulante (substância química que evita a coagulação do sangue), ocorre a coagulação, e se o material é centrifugado, o sobrenadante é conhecido como soro, isto é, o líquido obtido do sangue após a formação do coágulo. Durante a coagulação, o fibrinogênio é convertido em fibrina pela clivagem proteolítica pela trombina e, assim, o soro não tem fibrinogênio. 9. Intervalos ou valores de referência (normais) – VR É determinado medindo seu nível em uma porção da população geral e aplicando métodos estatísticos aos dados como o cálculo da média e do desvio-padrão (DP) dos grupos de valores encontrados. Na determinação do intervalo de referência, é acrescentado (e subtraído) dois desvios-padrão (± 2 DP) da média. Cada laboratório estabelece seus próprios VR e os fornece sempre que o resultado de um teste é informado no laudo, indicando quando um resultado está dentro ou não do VR. Todavia, cabe ao profissional de saúde realizar a interpretação apropriada, relacionando com a condição do paciente. Em caso de resultados incomuns ou inesperados, deve-se assegurar que não tenha ocorrido nenhum erro pré- analítico ou analítico. VR diferenciam-se segundo o gênero ou idade do paciente, o horário do dia, o intervalo após uma refeição, ou substância ou medicações que o indivíduo esteja tomando. Ainda, de acordo com a área geográfica de determinada população, os métodos de análise laboratoriais e o instrumento analítico empregados. 10. Variáveis que afetam os valores da análise Diversos são os fatores ou variáveis pré-analíticas que podem afetar os valores dos analitos e influenciar a sua faixa de referência, entre os quais destaca-se: idade, sexo, raça, ambiente, postura (em decúbito versus sentado), variações diurnas ou outras variações cíclicas, gravidez, jejum ou estado pós-prandial, alimentos ingeridos, fármacos, nível de exercício físico, método de coleta da amostra. Os erros também podem estar associados à análise das amostras, conhecidos como erros analíticos que abrangem os erros aleatórios e os erros sistemáticos. Os erros aleatórios geralmente estão associados a ensaios manuais e não são facilmente identificados. Os erros sistemáticos estão associados ao método de análise, levando a resultados não exatos e podendo ser identificados e corrigidos, se os procedimentos de controle de qualidade forem adequadamente seguidos. 11. Causas de anormalidades nos níveis dos analitos medidos no laboratório Alguns dos inúmeros distúrbios e condições que podem causar anormalidades nos níveis de diversos analitos medidos em laboratórios são: certas condições fisiológicas; alterações nos volumes dos líquidos orgânicos; alterações no equilíbrio do pH; alterações da função endócrina; alterações no estado nutricional; lesão ou morte celular; processos inflamatórios agudos ou crônicos (incluindo infecções); doenças genéticas; falência orgânica; traumatismo; câncer; fármacos; venenos, entre outros como estresse. 12. Perfis bioquímicos Os testes bioquímicos sanguíneos são organizados nas categorias de rotina (requisitados com mais frequência) e especiais (requisitados com menos frequência, como hormônios ou níveis de determinados fármacos). Um perfil de bioquímica(perfil metabólico completo) consiste em um grupo de testes executados simultaneamente em uma amostra, visando fornecer uma avaliação da condição geral do paciente, em associação com o exame físico. Em perfis bioquímicos de rotina, os testes incluídos refletem o estado do metabolismo de carboidratos e lipídeos, as funções renal, hepática, cardíaca e da tireoide (Quadro 1.1). Quadro 1.1 Exemplos de analitos testados em perfis bioquímicos Perfil Analitos Informações Valores de referência* Renal Glicose O metabolismo da glicose é regulado pela insulina, glucagon, cortisol e hormônio do crescimento. A determinação da glicemia é um dos testes laboratoriais mais solicitados. Dois distúrbios do metabolismo da glicose são (1) diabete melito, na qual há aumento da glicose sanguínea, chamada hiperglicemia, e hipoglicemia, redução dos níveis de glicemia, que é encontrada nas deficiência de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e de hormônio do crescimento. Jejum: <100 mg/Dl Nitrogênio ureico (BUN) ou ureia A sua concentração é influenciada por dieta, hormônios e função renal. Os seus níveis estão reduzidos durante inanição, gravidez e dietas hipoproteicas e aumentados durante uma dieta hiperproteica, após a administração de esteroides e na doença renal. 8-18 mg/dL Creatinina Os seus níveis não são afetados pela dieta ou pelos níveis hormonais. Estão aumentados quando há alteração na formação ou na excreção da urina, a qual ocorre em distúrbios renais, choque, desequilíbrio hídrico ou bloqueio de ureter. 0,7-1,4 mg/dL Eletrólitos Na+ Possuem grande efeito na hidratação e no equilíbrio ácido-básico (pH), nas funções cardíacas e muscular. 135-148 mEq/L K+ 3,5-5,4 mEq/L Cl- 98-108 mEq/L HCO3- 22-28 mEq/L Lipídeos Triglicerídeos (TG) Associação com doença cardiovascular (DCV). Níveis elevados de TG no sangue causam uma aparência leitosa ao plasma. Hiperlipidemia é a dislipidemia na qual há níveis sanguíneos elevados de TG. Na realização do teste, o sangue deve ser coletado quando o paciente está em jejum entre 12 a 14 horas, de preferência pela manhã, antes do desjejum. Jejum: Desejável < 150 mg/dL Colesterol HDL Associação com DCV. A concentração sérica tende a elevar- se com a idade. Níveis aumentados de colesterol elevam o risco de doença arterial coronariana. As frações de colesterol sanguíneo ligados à LDL (low-density lipoprotein ou lipoproteína de baixa densidade) – o colesterol “ruim” e à HDL (high-density lipoprotein ou lipoproteína de alta densidade) – o colesterol “bom” também são medidas. Desejável > 40 mg/dL Colesterol LDL < 130 mg/dL Colesterol total Desejável < 190 mg/dL Tireoide Tri-iodotironina (T3) Os dois principais hormônios da tireoide são T3 e T4. A secreção excessiva dos hormônios da tireoide, o hipertireoidismo ocasiona doenças como de Graves. O hipotireoidismo, redução da função da tireoide, causa uma condição denominada mixedema. Os níveis dos hormônios da tireoide variam conforme a idade. TSH é um hormônio da glândula hipófise anterior que regula a atividade da glândula tireoide. 80-230 ng/mL Tiroxina (T4) 5-12 µg/dL Hormônio estimulante da tireoide (TSH) 0,35-5,0 µlU/mL Proteína sérica total Estado de hidratação, nutrição e função hepática, tendo em vista que a maioria das proteínas do soro é sintetizada no fígado. 6,0-8,0 g/dL Albumina Hipoalbuminemia ocorrem em doenças do fígado, inanição, má absorção de aminoácidos, catabolismo proteico aumentado e perda proteica através da pele, dos rins ou do trato gastrintestinal. 3,8-5,0 g/dL Bilirrubina É medida para avaliar ou monitorar o fígado ou a disfunção da vesícula biliar. Os níveis de bilirrubina tendem a ser baixos. Pode estar aumentada quando há destruição excessiva de hemoglobina, como nas anemias hemolíticas, na excreção hepática reduzida, em casos de obstrução biliar ou doença da Direta: 0-0,3 mg/dL Total: 0,1-1,2 mg/dL Hepático vesícula biliar, ou em situações de metabolismo alterado da bilirrubina, como ocorre nas hepatites. Fosfatase alcalina (ALP, AP) Os seus níveis séricos aumentam consideravelmente em casos de tumores e lesões hepáticas e apresentam aumento moderado em doenças como hepatite. 20-130 U/L Gama glutamil transferase (GGT) Permanece normal nas doenças ósseas e musculares, sendo mais útil do que a AP na determinação de lesão hepática e do que a AST. Frequentemente empregada para monitorar a recuperação das hepatites. 3-40 U/L Lactato deidrogenase (LD, LDH) Os seus níveis elevam-se no sangue durante as doenças hepáticas e após infarto do miocárdio. Hemólise da amostra leva ao aumento dos níveis de LDH no soro. 120-230 U/L Alanina aminotransferase (ALT, TGP) Era denominada de transaminase glutâmica-pirúvica (TGP). Apresenta níveis baixos no tecido do coração e elevados no tecido do fígado. Geralmente, aumenta mais do que a AST nas doenças hepáticas, com aumentos moderados (até dez vezes maiores que os normais) em casos de cirrose, infecções ou tumores, e aumentos até cem vezes acima do normal em casos de hepatite viral ou tóxica. 3-30 U/L Aspartato aminotransferase (AST, TGO) Era denominada de transaminase glutâmica-oxaloacética (TGO). Presente principalmente no coração, no fígado e nos músculos. Eleva-se no infarto do miocárdio e nas doenças hepáticas. 10-37 U/L Cardíaco Creatina quinase (CK) Os seus níveis elevam-se, após dano musculoesquelético e dano cerebral. Ainda, auxilia no diagnóstico de infarto do miocárdio. Após um ataque cardíaco, CK é liberada no músculo cardíaco lesionado, aumentando seus níveis de 5 a 8 vezes o limite superior normal, levando a picos em aproximadamente 24 horas e a diminuição dos níveis aos valores normais, entre 3 a 4 dias. 30-170 U/L * Valores de referência listados são para soro. Fonte: adaptado de Estridge (2011). Referências AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). Resolução da Diretoria Colegiada nº. 306, de 07 de Dezembro de 2004. Dispõe sobre o Regulamento Técnico para o Gerenciamento de Resíduos de Serviços de Saúde. Diário Oficial da União; Poder Executivo, 10 de dezembro de 2004. Acesso em 01 jul. 2008. BISHOP, M. L.; FODY, E. P.; SCHOEFF, L. Química clínica: princípios, procedimentos, correlações. Tradução de Fernando Gomes do Nascimento - 5ª ed. - Barueri, SP: Manole, 2010. BRASIL. Presidência da República. Política Nacional de Resíduos Sólidos. Lei n.º 12305, de 2 de agosto de 2010. Disponível em < http://www.planalto.gov.br/ccivil_03 /_ato2007- 2010/2010/lei/l12305.htm>. Acesso em 28 jun. 2011. CONSELHO NACIONAL DE MEIO AMBIENTE (CONAMA). Resolução 358, de 29 de abril de 2005. Dispõe sobre o Tratamento e a Disposição Final dos Resíduos de Serviços de Saúde, e dá outras providências. Diário Oficial da União, 04 maio de 2005. Acesso em 01 jul. 2008. ESTRIDGE, B. H.; REYNOLDS, A. P. Técnicas básicas de laboratório clínico. Tradução de Ana Lúcia Peixoto de Freitas [et al.] - 5ª ed. – Porto Alegre: Artmed, 2011. MOTTA, V. T. Bioquímica clínica para o laboratório – Princípios e interpretações. 5ª ed. Rio de Janeiro: MedBook, 2009. NARDY, M. B. COMPRI; STELLA, M. B. E OLIVEIRA, C. Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica: uma visão integrada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2011.
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