Teórico-Prática Virologia

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Diagnóstico Laboratorial das Viroses 
Felipe Carvalho 
 
Espécimes clínicos para o diagnóstico virológico 
 Um dos mais importantes fatores para um diagnóstico apurado na Virologia está 
relacionado com a maneira com que a amostra clínica é manuseada. O tempo da 
colheita em relação ao aparecimento da doença, a quantidade, a qualidade do 
material colhido, o tempo antes de ser processado e as condições do transporte 
para o laboratório são importantes variáveis a serem destacadas. Colher o material 
clínico na fase aguda da doença e no sítio em que está ocorrendo replicação viral 
aumenta o êxito no diagnóstico laboratorial. 
O isolamento viral requer mais atenção nas condições de armazenagem e 
transporte do que as amostras submetidas para detecção de antígeno viral ou ácido 
nucleico, pelo fato de a infecciosidade do vírus ter de ser preservada. As amostras 
clínicas devem ser colocadas em meio de cultura com salina balanceada e 
tamponada em pH 7,2, contendo antibióticos e antifúngico (meio de transporte de 
vírus; MTV), e transportadas rapidamente para o laboratório, no gelo, para garantir a 
integridade das partículas virais. Caso não seja possível o transporte imediato, a amostra 
deve ser mantida refrigerada ou em gelo. Se a demora for maior que 24 horas para o 
transporte, as amostras devem ser congeladas a -70ºC e transportadas em gelo seco. 
Alguns vírus como o vírus respiratório sincicial humano (HRSV) e o herpesvírus, não 
podem ser mantidos nessa temperatura pois podem ser seriamente comprometidos, 
devendo ficar na geladeira (4ºC) e não congelado a – 20ºC. 
 
Em geral, o processamento da amostra clínica inclui a adição de mais 
antibióticos e antifúngicos à amostra e centrifugação para retirar debris e 
contaminantes (clarificação), antes da inoculação nos sistemas hospedeiros. Desse 
modo, acompanhando o material colhido deve seguir uma ficha contendo as seguintes 
informações: nome, idade, endereço e sexo do paciente; descrição do material colhido; 
época da colheita e suspeita clínica; histórico das vacinas virais já tomadas pelo 
paciente; situação epidemiológica da doença na zona residencial do paciente, no seu 
local de trabalho ou em áreas próximas, e se realizou viagem a local de circulação de 
algum vírus endêmico. 
 
Métodos utilizados no diagnóstico virológico 
□ Isolamento e identificação do vírus 
□ Sorologia para detecção de antígenos e/ou anticorpos 
□ Detecção direta da partícula viral 
□ Amplificação de ácidos nucleicos virais 
 O diagnóstico clássico empregado para a confirmação da infecção viral consiste 
no isolamento e na identificação do vírus, juntamente com a sorologia para detecção 
de anticorpos. Atualmente, a sorologia para detecção de antígenos e a detecção direta 
da partícula viral ou a amplificação de ácidos nucleicos virais têm sido, em muitos 
casos, úteis para confirmar a suspeita clínica. 
 Para o isolamento e a identificação de vírus, utiliza-se sistemas vivos, como por 
exemplo as culturas de células, que constituem o sistema mais utilizado. Na sorologia, 
são utilizados métodos para detecção de antígenos virais e/ou anticorpos específicos, ex: 
métodos imunoenzimáticos, aglutinação, imunofluorescência, Western blotting, testes 
imunocitoquímicos. 
 O diagnóstico rápido, inclui na detecção direta dos vírus por microscopia 
eletrônica (ME), detecção de antígenos virais (imunofluorescência), sorologia para 
detecção de imunoglobulinas específicas (ELISA) e detecção do genoma viral 
(PCR). 
□ Isolamento e identificação do vírus 
 A propagação de vírus em laboratório é feita em sistemas hospedeiros 
obrigatoriamente vivos, que podem ser representados por animais de laboratório, ovos 
embrionados e/ou culturas de células. 
Apesar do desenvolvimento de técnicas novas e rápidas para o diagnóstico das 
infecções virais, o isolamento do vírus ainda permanece como o padrão de referência 
para a comparação dos novos métodos. 
O isolamento viral comparado a outros métodos de diagnóstico apresenta 
vantagens e desvantagens: 
Vantagens 
→ As culturas de células amplificam a quantidade de vírus 
→ Isolamento de vírus não considerados no momento 
→ Produção de partículas infecciosas (viáveis) 
→ Isolamento de vírus não conhecidos 
Desvantagens 
→ Sistema de isolamento não disponível 
→ Muito demorado para alguns vírus 
→ Sujeito a contaminação por outros microrganismos 
Um dos princípios mais importantes para o protocolo do isolamento viral é a 
escolha do sistema de propagação para o vírus pesquisado. Uma vez inoculados no 
sistema hospedeiro suscetível, os vírus provocam modificações fisiológicas nesse 
sistema, que são observadas como efeitos consequentes da biossíntese viral. Os 
fenômenos de alteração morfológica celular são denominados efeito citopático (CPE), 
como por exemplo desenvolvimento de paralisia e/ou lesões degenerativas e mortes 
em animais. 
 A propagação viral em animais de laboratório com a finalidade de 
diagnóstico não tem sido utilizada com frequência, exceto para testes vacinais e 
antivirais, devido ao advento das culturas de células as quais fornecem uma opção mais 
simples e prática. A grande maioria utiliza camundongos, principalmente pra isolamento 
de arbovírus e vírus da raiva. As vias de inoculação podem ser natural ou experimental. 
Na natural tem-se a ingestão e a inalação ; na experimental tem-se intramuscular, 
intravenosa, intraperitoneal, intracerebral e subcutânea. 
 A propagação viral em ovos embrionados, foi muito utilizada até a década de 
1950 e constituíram o sistema hospedeiro de escolha para propagação de muitos vírus. 
Entretanto, os ovos embrionados continuam sendo utilizados para isolamento de vírus 
aviários, FLUV e para a produção de alguns tipos de vacinas virais. A escolha da via de 
inoculação (saco vitelino, cavidade amniótica, cavidade alantoica, membrana 
corioalantoica ou embrião), assim como a idade do embrião, são determinadas pela 
especificidade do vírus que se quer isolar a uma dada membrana. A observação da 
propagação viral pode ser realizada a partir da técnica de hemaglutinação (HÁ), 
visualização de pocks (pústulas) e alterações no embrião. 
A propagação viral em culturas de células, foi possível devido emprego das 
técnicas assépticas cirúrgicas; a descoberta dos antibióticos; o desenvolvimento de um 
meio de cultura celular. Possui algumas vantagens como: é um sistema econômico, é de 
fácil manutenção, fornece preparações virais com títulos elevados, permite estudos da 
biologia molecular da infecção e possui permissividade e velocidade de replicação viral. 
Evidenciação da propagação viral em cultura celular 
→ Observação do efeito citopático 
 O efeito citopático ou CPE se refere a alterações na morfologia em células 
individuais ou grupos de células induzidas pela infecção viral, as quais são observadas 
ao microscópio óptico. Dependendo do vírus e do tipo de cultura de células, o CPE 
observado na cultura pode ser caracterizado pelo arredondamento celular, células 
refráteis, picnose, vacuolização, granulação, formação de células gigantes, degeneração 
granular onde o citoplasma torna-se refringente, formação de sincícios que resultam da 
fusão de células, agregação, perda da aderência ou lise. 
 O efeito citopático ou citopatogênico (CPE) pode variar entre diferentes culturas 
celulares, determinados vírus diferentes podem apresentar CPE muito semelhantes, a 
presença de CPE nem sempre é óbvia – depende do observador, o CPE não é sinônimo 
de destruição celular e nem todos os vírus levam a ocorrência de CPE. 
 A replicação de certos vírus em cultura de células pode ser muito lenta. Nas 
últimas décadas, foram desenvolvidos vários sistemas
para acelerar a evidenciação do 
isolamento desses vírus em cultura de células, como é o caso do sistema de shell vial, 
das linhagens celulares geneticamente modificadas e culturas de células mistas. 
→ Sistema de shell vial 
 A possibilidade de detecção da propagação de vírus em culturas de células no 
formato de shell vial, antes do surgimento do CPE, consiste na centrifugação em baixa 
velocidade para favorecer a infecção das cultuars células MRC-5 pelo citolomegavírus 
humano (HCMV), seguido por incubação para amplificação de proteínas específicas do 
vírus (localizadas no núcleo) e, finalmente, a detecção dessas proteínas é realizada por 
ensaio de imunofluorescência (IF), utilizando anticorpos específicos para uma proteína 
nuclear do HCMV. Esse sistema apresenta positividade de dias a semanas antes que o 
CPE do HCMV seja observado na cultura de células tradicional. Os resultados podem 
sair em até 24 horas. A velocidade no tempo de detecção do vírus e a sensibilidade 
desse sistema para o HCMV estimularam o desenvolvimento de sistemas similares para 
outros vírus, como HSV, adenovírus, enterovírus e etc. 
 
 
 
 
→ Interferência Viral 
 O teste de interferência viral (IV) baseia-se no fenômeno em que a cultura 
celular infectada por um vírus pode tornar-se resistente à infecção por outro vírus para o 
qual, originalmente, era permissiva. 
 
Esse teste baseia-se na capacidade de certos vírus interferirem com a replicação de um 
segundo vírus na mesma cultura. A amostra suspeita de conter vírus é inoculada em cultura de 
células e incubada por 24 h; após esse período, um segundo vírus, denominado vírus de 
referência, que sabidamente apresenta replicação rápida e citocida nessa cultura celular, é 
inoculado na mesma cultura do material suspeito e em uma nova cultura (controle). As culturas 
são novamente incubadas por 24 h e é realizada a observação do efeito citopático (CPE). Caso o 
material suspeito seja positivo, o vírus presente nesse material irá impedir a replicação do vírus 
de referência, não sendo observado o CPE; caso o material seja negativo, o vírus de referência 
será propagado rapidamente e induzir CPE na cultura de células. 
 
→ Teste de hemaglutinação 
 Certos vírus são capazes de aglutinar hemácias de animais de diferentes 
espécies; esse fenômeno é denominado hemaglutinação (HA) viral. Eles se ligam a 
receptores na superfície da hemácia, onde essa ligação resulta no agrupamento visível 
dessas hemácias que se depositam no fundo da placa, formando um tapete. Caso não 
haja de vírus hemaglutinante no material pesquisado, as hemácias irão depositar-se no 
fundo da placa em forma de botão. Assim, a hemaglutinação viral não é uma reação 
sorológica, porque esta não envolve a ligação antígeno-anticorpo. 
 
O teste de HA consiste na interação entre a hemaglutinina do vírus e o ácido siálico presente na 
superfície das hemácias. Quando se mistura uma suspensão de hemácias e partículas de vírus 
hemaglutinantes, haverá a formação de um agregado vírus-hemácias, que se deposita no fundo 
da placa em forma de tapete. Na ausência de vírus hemaglutinante as hemácias irão se depositar 
no fundo da placa em forma de botão. 
 A hemaglutinação (HÁ) viral pode ser usada para detecção qualitativa e 
quantitativa de vírus hemaglutinantes. Na forma quantitativa, a suspensão viral é 
submetida a diluições seriadas e testadas contra as hemácias. A determinação da maior 
diluição em que ocorre a hemaglutinação total das hemácias permite estimar o título 
viral na amostra. O título viral é definido como o inverso da maior diluição em que 
ocorre hemaglutinação total. Nessa diluição, encontra-se a quantidade mínima de 
vírus necessária para que ocorra a hemaglutinação total; a concentração de vírus 
nesta diluição é denominada uma unidade hemaglutinante (1UHA). Assim, se ao 
realizar uma reação de HA para quantificar o título viral em uma preparação, a maior 
diluição em que ocorrer a hemaglutinação completa for 1:32, o título dessa preparação é 
igual a 32 e nessa diluição, existe 1 UHA. Por conseguinte, na preparação original que 
está 32 vezes mais concentrada temos 32 UHA. A determinação desse valor é 
importante para a padronização de antígenos hemaglutinantes que serão utilizados na 
reação de inibição da hemaglutinação (HI). 
 
Nesse exemplo, uma preparação viral foi submetida a diluições seriadas (1:2 a 1:256) e testada 
contra uma concentração estabelecida de hemácias. A maior diluição em que ocorreu 
hemaglutinação total foi 1:32; logo, o título da preparação viral é de 32 UHA. A diluição em 
que se encontra a quantidade mínima de partículas virais – suficiente para induzir 
hemaglutinação total (1 UHA) – é 1:32, visto que em diluições maiores não ocorre a 
hemaglutinação (diluições de 1:64 até 1:256, formação de botão). 
Para todos os vírus, utiliza-se 8 unidades hemaglutinantes (8 UHA), exceto o 
da rubéola que utiliza-se 4 unidades hemaglutinantes (4 UHA) . Desse modo, para 
todos os vírus pega-se o teste original e dilui 1:4, enquanto o da rubéola dilui-se 1:8. 
Exemplo: se eu tenho 160 UHA para o vírus da dengue, quantas vezes terei que diluir? 
160 UHA dividido 8 UHA é 20, logo dilui 1:20 para usar no teste de HI. 
□ Sorologia para detecção de antígenos e/ou anticorpos – diagnóstico sorológico 
das infecções virais 
 As reações sorológicas são empregadas com as seguintes finalidades: 
• Confirmar a suspeita clínica, diagnosticando laboratorialmente uma enfermidade 
causada por vírus 
• Identificar o vírus isolado em cultura 
• Estudar epidemiologicamente o comportamento de uma virose em uma dada 
comunidade 
 A infecção pela maioria dos microrganismos, incluindo vírus, induz a formação 
de anticorpos específicos; estes, quando identificados no soro de um indivíduo, 
produzem evidências de que ele foi infectado por um determinado agente infeccioso. 
Qualquer reação sorológica pesquisasse o complexo antígeno-anticorpo. Caso eu 
não conheça o antígeno, utiliza-se anticorpo padrão e vice-versa. 
 A detecção de anticorpos da classe IgM em uma única amostra de soro do 
paciente possibilita o diagnóstico de infecção recente. A presença de IgG pode 
significar um contato prévio com o vírus ou infecção recente, se for demonstrado 
aumento significativo (conversão sorológica) no título de anticorpos (≥ 4 vezes) entre 
duas amostras de soro (sorologia pareada), uma da fase aguda e outra da fase 
convalescente. 
Para diagnosticar as infecções virais, a sorologia é frequentemente usada pois, muitas 
vezes, o isolamento viral é difícil, não estando amplamente disponível. A sorologia 
também é útil para determinar o estado imunológico do paciente, verificando se o 
indivíduo já foi infectado ou imunizado contra certos vírus, por meio da pesquisa de 
anticorpos específicos contra esse vírus. A detecção de anticorpos é a única opção 
para confirmar uma infecção aguda prévia, uma vez que o agente infeccioso não está 
mais presente, permanecendo apenas os anticorpos como prova de que a infecção 
ocorreu. Desse modo, a sorologia serve como um método indireto para o diagnóstico 
da infecção viral. 
Testes sorológicos utilizados 
→ Teste de neutralização (TN) 
 O teste de neutralização (TN) está fundamentado no princípio de que vírus 
infecciosos, quando interagem com o anticorpo específico, são neutralizados e, por 
conseguinte, perdem a capacidade de infectar células permissivas. O teste é 
realizado em 2 etapas: na primeira, o vírus infeccioso e o soro do paciente são 
misturados e incubados para que ocorra a formação do imunocomplexo (antígeno-
anticorpo); na segunda etapa, alíquotas da mistura vírus-soro são inoculadas em um 
hospedeiro permissivo, geralmente
cultura de células. Após incubação apropriada, a 
cultura é examinada para a observação do CPE. Se no soro do paciente houver 
anticorpos específicos contra o vírus pesquisado, este irá se ligar ao vírus, 
neutralizando-o na primeira etapa, e o vírus não irá infectar a cultura de células. 
Consequentemente, o CPE não será observado. Caso os anticorpos do paciente não 
sejam específicos para o vírus pesquisado, estes não se ligarão ao vírus na primeira 
etapa, o qual permanecerá infeccioso e irá infectar a cultura de células produzindo 
CPE. 
 
O teste baseia-se na capacidade de os anticorpos neutralizarem a infecciosidade dos vírus. 
Pode ser usado para identificação de vírus, utilizando-se soro padrão, ou para detecção de 
anticorpos no soro, utilizando-se vírus infeccioso. Inicialmente, vírus e anticorpos são 
misturados e, posteriormente, a mistura é inoculada em cultura de células. Se os anticorpos 
conseguirem neutralizar a infecciosidade do vírus, este não será capaz de infectar as células e, 
por conseguinte, não haverá a indução do efeito citopático (CPE), caso o vírus não seja 
neutralizado, o CPE será observado. 
 O teste de neutralização pode ser usado para identificação de vírus ou para 
avaliação do nível de anticorpos. Quando um vírus precisa ser identificado, uma 
suspensão desse vírus é misturada com uma suspensão de anticorpos específicos (soro 
padrão). Para a detecção de anticorpos, uma suspensão de um vírus conhecido é 
misturada ao soro do paciente que contém os anticorpos de especificidade desconhecida. 
O TN detecta anticorpos totais (IgM e IgG), sem discriminar a classe da 
imunoglobulina. Dessa maneira, o diagnóstico de uma infecção recente utilizando o 
TN para pesquisa de anticorpos somente pode ser realizado pela demonstração da 
conversão sorológica ou soroconversão. Nesse caso, testam-se as 2 amostras de soro 
do paciente (soro da fase aguda e soro da fase convalescente) simultaneamente, 
fazendo-se diluições seriadas dos soros para determinação do título de anticorpos. Se o 
soro da fase convalescente apresentar um título de anticorpos ≥ 4 vezes o da fase 
aguda (FC ≥ 4 x FA), ou se somente forem detectados anticorpos no soro 
convalescente, o paciente está apresentando uma infecção aguda ou recente. Caso seja 
detectada a presença de anticorpos, mas não houver variação de título entre os soros, 
diz-se que o paciente teve contato prévio com o vírus pesquisado; contudo, este não é 
o responsável pela infecção atual. Finalmente, se não forem detectados anticorpos 
contra o vírus pesquisado nos soros do paciente, diz-se que este é suscetível para o 
vírus, pois não possui imunidade contra o mesmo. 
 
Exemplos de titulação de anticorpos por meio de TN. Foram analisados soros da fase aguda 
(SFA) e da fase convalescente (SFC) de um paciente para a detecção de anticorpos contra um 
determinado vírus. O título de anticorpos do soro é definido como o inverso da maior 
diluição em que ocorreu a neutralização do vírus (ausência de CPE). O título do SFA foi 20 
e do SFC, de 160; ocorreu soroconversão ou conversão sorológica (título do soro da fase 
convalescente ≥ 4 vezes o título do soro da fase aguda). Assim, diz-se que o paciente está 
apresentando uma infecção recente pelo vírus testado. CC = controle de células não 
infectadas; CV = controle de vírus (células infectadas com o vírus usado na reação); CSFA = 
controle de soro da fase aguda (células inoculadas com o SFA); CSFC = controle de soro da 
fase convalescente (células inoculadas com o SFC). 
 O tratamento do soro do paciente é feito a 56ºC durante 30 minutos para inativar 
fatores do complemento. 
Diagnóstico: 
FA: T = 5 
FC: T = 10 
 
FA: T = 20 
FC: T = 160 
 
 
FA: T =  5 
FC: T = 5 
 
 
FA: T = < 5 
FC: T = < 5 
 
 
Infecção passada: não houve 
conversão sorológica 
Infecção recente: houve 
conversão sorológica (FC ≥ 4x 
FA) 
Repetir o teste, se mantiver o 
resultado a infecção é 
recente, pois não tinha 
anticorpos e passou a ter 
O indivíduo é suscetível, 
pois não há presença de 
anticorpo, apresentando 
CPE em todas as diluições. 
 
→ Teste de inibição da hemaglutinação (HI) 
No teste de inibição da hemaglutinação (HI), a capacidade de hemaglutinação de 
um vírus é bloqueada quando esse vírus reage com o anticorpo específico. O teste de 
HI também é executado em 2 estágios. No primeiro estágio, o vírus hemaglutinante e o 
soro do paciente são misturados e incubados. Se o soro do paciente possui anticorpos 
específicos para o vírus, haverá a formação do imunocomplexo (antígeno-anticorpo). 
No segundo estágio, são adicionadas hemácias à mistura do primeiro estágio; o vírus 
complexado ao anticorpo não tem a capacidade de produzir a hemaglutinação. 
Quando o anticorpo, no primeiro estágio, não é específico para o vírus, não há formação 
do complexo vírus-anticorpo, e o vírus mantém a sua capacidade de induzir 
hemaglutinação. A técnica é aplicável apenas a vírus com capacidade 
hemaglutinante, testada primeiramente pelo teste de hemaglutinação (HA). 
 
 
Teste de inibição da hemaglutinação (HI). A ligação dos anticorpos à hemaglutinina viral 
impede que esta consiga interagir com o ácido siálico na superfície da hemácia, inibindo assim o 
processo de hemaglutinação. Esse fenômeno é explorado no teste de HI. Inicialmente, vírus e 
anticorpos são misturados e posteriormente as hemácias são adicionadas à mistura. Se os 
anticorpos estiverem ligados à hemaglutinina viral, não haverá a formação do agregado vírus-
hemácias; as hemácias irão depositar-se no fundo da placa em forma de botão. Se não ocorrer a 
ligação vírus-anticorpos, a hemaglutinina viral estará livre para ligar ao ácido siálico da hemácia 
e haverá a formação de um tapete de hemácias no fundo da placa. Lembrar que na adição de 
hemácias ao soro + vírus, se for hemácia de mamíferos é 1%, se for de aves é 0,5%. 
Para a detecção de anticorpos, um vírus hemaglutinante conhecido é misturado 
com o soro do paciente. Se o soro inibir a hemaglutinação pelo vírus, o anticorpo no 
soro é detectado. O teste de HI também pode ser usado para identificação de vírus; 
nesse caso, o vírus é misturado com soros padrão contendo anticorpos específicos. Se os 
anticorpos inibirem a hemaglutinação, o vírus é identificado. Assim como o TN, a 
reação de HI detecta anticorpos totais (IgM e IgG) e o diagnóstico de uma infecção por 
pesquisa de anticorpos somente pode ser realizado pela sorologia pareada para a 
demonstração de soroconversão. 
 
Exemplos de titulação de anticorpos por meio do teste de HI. Foram analisados soros da fase 
aguda (SFA) e da fase convalescente (SFC) de um paciente para a detecção de anticorpos contra 
um determinado vírus. O título de anticorpos do soro é definido como o inverso da maior 
diluição em que ocorreu a inibição total da hemaglutinação (botão). Tanto o título do SFA 
quanto o do SFC foram 80; não ocorreu soroconversão, embora o paciente apresente anticorpos 
contra o vírus pesquisado. Assim, diz-se que o paciente não está apresentando infecção recente, 
mas já esteve em contato com o vírus pesquisado. CH = controle de hemácias; CV = controle de 
vírus (vírus hemaglutinantes + hemácias); CSFA = controle de soro da fase aguda (SFA + 
hemácias); CSFC = controle de soro da fase convalescente (SFC + hemácias). 
O diagnóstico é igual ao TN. O tratamento do soro do paciente, feito antes da 
realização do teste de HI, é a remoção de inibidores específicos com Caolin à 25% e 
remoção de aglutininas inespecíficas com suspensão de hemácias a 50%. Esse segundo 
tratamento, deve-se utilizar o mesmo tipo de hemácia que irá utilizar no HI. 
 
→ Imunofluorescência 
 A técnica
de imunofluorescência (IF) baseia-se na detecção de imunocomplexos 
(antígeno-anticorpo), através da utilização de substâncias fluorescentes ligadas a 
anticorpos marcados, também chamado de conjugados. 
Imunofluorescência direta (IF) 
 A imunofluorescência direta (IFD) é um método usado para identificação de 
muitos antígenos virais. Na IFD, um conjugado de especificidade conhecida é 
adicionado a células infectadas por vírus que estão fixadas em uma lâmina de 
microscópio. Se o anticorpo é específico para o antígeno, ocorre formação do complexo 
vírus-anticorpo, que é visualizado pela fluorescência observada ao microscópio de 
fluorescência. Se o conjugado não for específico para o antígeno, não há formação do 
imunocomplexo e a fluorescência não é observada. 
 
 
Imunofluorescência Indireta (IFI) 
 A imunofluorescência indireta (IFI) é uma técnica usada para a identificação de 
antígeno ou detecção de anticorpo. O teste é realizado em 2 etapas. Na primeira, o 
soro do paciente é adicionado a células infectadas fixadas a uma lâmina de microscópio. 
Após incubação, as lâminas são lavadas para remover anticorpos não ligados. Na 
segunda etapa, um anticorpo anti-imunoglobulina conjugado com fluoresceína é 
adicionado. O tipo do conjugado é determinado pela espécie do anticorpo usado na 
primeira etapa. Por exemplo, se uma imunoglobulina humana é usada na primeira 
etapa, então um conjugado anti-imunoglobulina de humano é usado na segunda etapa. 
Após incubação e lavagem, o esfregaço é observado ao microscópio de fluorescência. 
Se o soro do paciente apresentar anticorpos específicos para o vírus fixado à lâmina na 
primeira etapa, estes se ligarão ao antígeno e o conjugado irá se ligar ao complexo, 
possibilitando a observação da fluorescência. Caso o soro do paciente não contenha 
anticorpos específicos para o vírus, não irão se ligar a este e o conjugado não se ligará 
ao complexo na segunda etapa, não sendo observada fluorescência. Essa técnica pode 
ser usada para detecção de IgM ou IgG específicas para um determinado vírus. 
 
Aglutinação passiva ou aglutinação látex 
 A aglutinação passiva ocorre com a ligação artificial do antígeno a uma partícula 
carreadora, a qual, em geral, é uma partícula de látex. Essas partículas são agrupadas 
por ligação com os anticorpos específicos para o antígeno presente na sua superfície. 
Desse modo, o teste tanto é usado para detecção de vírus ou antígenos virais mas para 
isso, o componente artificialmente ligado ao carreador é um anticorpo de 
especificidade conhecida. As partículas cobertas com anticorpos são misturadas a 
uma suspensão contendo vírus e, quando os anticorpos ligados ao carreador se 
ligam ao antígeno, ocorre a aglutinação, que é visível a olho nu. 
 
 
 Essa reação de aglutinação também pode ser utilizada para detecção de 
anticorpos. Para esse propósito, antígenos virais conhecidos são adsorvidos ao 
carreador e as partículas são misturadas com soro de humano. Se o anticorpo presente 
no soro for específico para o antígeno viral, ligado ao carreador, haverá aglutinação. 
 
Teste de aglutinação do látex (AL). Nesse teste, partículas de látex são recobertas 
(sensibilizadas) com antígenos ou anticorpos. As partículas sensibilizadas são misturadas ao 
material-teste. Caso haja a presença de vírus no material colhido do paciente (A) ou anticorpos 
específicos contra o vírus pesquisado no soro do paciente (B), ocorrerá agregação das partículas 
de látex, visível a olho nu. 
 
Teste imunoenzimático 
 A reação imunoenzimática (EIA ou ELISA) é baseada na detecção de 
imunocomplexos através de reação enzimáticas e colorimétricas e pode tanto ser usado 
para identificação de antígenos ou para detecção de anticorpos. O sistema envolve a 
detecção do imunocomplexo fixo em um suporte, usando para isso um anticorpo 
conjugado a uma enzima. O resultado do teste é determinado pela observação ou 
medida espectrofotométrica da coloração produzida pela reação da enzima sobre o 
substrato. Assim, o teste envolve as seguintes etapas: formação do imunocomplexo 
(antígeno-anticorpo); adição do conjugado (anticorpo-enzima); e revelação (adição do 
substrato-reação colorida). A enzima geralmente utilizada é a peroxidase. 
 O processo ocorre do seguinte modo: um dos componentes do imunocomplexo 
(antígeno ou anticorpo) é fixado a um suporte sólido, ocorrendo a sensibilização do 
sistema. No teste para detecção de anticorpos, um antígeno viral é ligado ao suporte, ao 
passo que, para a identificação de antígeno, um anticorpo específico é ligado ao suporte. 
Em seguida, é adicionada a amostra-teste para formação do imunocomplexo. Após a 
reação do material-teste com a fase sólida e a lavagem do sistema para a remoção do 
material que não reagiu, o conjugado (anticorpo-enzima) é adicionado. Após a 
incubação e a lavagem, o substrato específico da enzima associado a um cromógeno é 
adicionado. A enzima presente no sistema irá reduzir o substrato e o produto de 
degradação do substrato irá oxidar o cromógeno, resultando em uma reação colorida. 
Por exemplo, se a enzima utilizada no teste for peroxidase, o substrato adicionado será 
H2O2; a peroxidase catalisa a reação de desdobramento da H2O2 em H2O e O2. À 
medida que a H2O2 é reduzida, o cromógeno é oxidado, produzindo o aparecimento de 
cor azul. Caso a amostra seja negativa, o conjugado não irá se ligar ao sistema e será 
subsequentemente removido na etapa de lavagem. Consequentemente, o cromógeno 
adicionado na etapa de revelação não será oxidado e, portanto, não haverá alteração de 
cor da reação que permanecerá incolor. 
 
Teste imunocromatográfico 
 É um imunoensaio em suporte sólido, que se baseia no fluxo lateral da amostra 
que ocorre por capilaridade em uma membrana de nitrocelulosa, detectado com 
anticorpo conjugado com ouro coloidal. 
 O teste é considerado positivo se as duas linhas (teste e controle) tornam-se 
visíveis; negativo se somente a linha-controle estiver visível; ou inválido, se nenhuma 
linha se tornar visível. 
 
Diagrama representativo do teste imunocromatográfico. A amostra-teste é aplicada no cassete e 
migra por capilaridade através da membrana de nitrocelulose até uma área contendo anticorpos 
contra o vírus que se quer detectar, marcados com ouro-coloidal (conjugado), formando o 
imunocomplexo que continuará migrando até a área de captura, na qual irá se ligar a um 
anticorpo de captura específico para o vírus, formando uma linha visível (linha T). Os 
conjugados não ligados a vírus continuarão migrando até encontrar a linha contendo o anticorpo 
de captura controle em que se ligarão (linha C). 
 
(B) Exemplo de um teste positivo; ambas as linhas, teste e controle, tornam-se visíveis. (C) 
Exemplo de um teste negativo; somente a linhacontrole torna-se visível.