RELATÓRIO - ESTUDO DA POLIFENOLOXIDASE (PPO) EXTRAÍDA DA BATATINHA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS 
INSTITUTO DE QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA 
PRÁTICA 04 – ESTUDO DA POLIFENOLOXIDASE (PPO) EXTRAÍDA DA 
BATATINHA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Disciplina: Laboratório de Bioquímica 
Prof.ª Dra. Sonia Salgueiro Machado 
Aluno: José Jorge Araújo E Silva 
 
 
Maceió, 16 de fevereiro de 2019 
OBJETIVOS 
Caracterizar bioquimicamente a ação da enzima polifenoloxidase 
presente na batata inglesa, bem como os efeitos de agentes catalítico e 
inibidores dessa ação enzimática. 
INTRODUÇÃO 
Todos estão familiarizados com a forma pela qual frutos e vegetais 
claros, como maçãs, bananas e batatas, tornam-se escurecidos quando suas 
superfícies entram em contato com o ar. As reações de escurecimento são 
alguns dos fenômenos mais importantes que ocorrem durante o 
processamento e armazenamento de alimentos. Estas reações, que provocam 
escurecimento dos alimentos, segundo Ribeiro e Seravalli (2007), podem ser 
oxidativas ou não oxidativas, sendo escurecimento oxidativo ou enzimático, 
uma reação entre o oxigênio e um substrato fenólico catalisado pela enzima 
polifenoloxidase e não envolve carboidratos. 
A deterioração de um alimento consiste geralmente em uma série de 
fenômenos fundamentais, seguidos cada um de fenômenos secundários, que, 
por sua vez, se manifestam como alterações dos atributos de qualidade. 
(FENNEMA,2000) Nesse sentido, o autor aponta golpes ou injúrias nas frutas 
como um fenômeno primário que segue-se de um fenômeno secundário, qual 
seja o rompimento das células que liberam enzimas e a acessibilidade ao 
oxigênio que acaba afetando a cor por meio do ‘pardeamento enzimático’. 
Tecidos danificados pelo corte ou retirada da casca, pelo ataque de 
fungos ou machucados, facilitam o contato da enzima com o substrato. 
(COULTATE,2004) 
A polifenoloxidase, também conhecida como catecol-oxidase, 
catecolase,oxidase difenol, fenolase e tirosinase, polifenolase, catecol oxidase, 
é encontrada na maioria das frutas e vegetais, sendo que a localização da 
enzima na célula vegetal depende da espécie, idade e grau de maturidade. 
(MAISTRO,2001) 
Em decorrência dessas ‘limitações’ dos tecidos vegetais, uma série de 
tratamentos são recomendados no sentido de inviabilizar o processo de 
escurecimento, como uso da técnica do branqueamento que segundo Silva 
(2000), é um tratamento térmico usualmente aplicado a vegetais antes do 
congelamento, desidratação ou enlatamento, com objetivo de inativação das 
enzimas; emprego de temperaturas para retardar a ação enzimática, ou ainda 
uso de ácido orgânicos. 
REVISÃO DA LITERATURA 
A polifenoloxidase (PPO, PFO, o-difenol: oxigênio oxido-redutase), 
também conhecida como catecol oxidase, catecolase, difenol oxidase, o-
difenolase, fenoloxidase, tirosinase, ou cresolase é uma enzima que contém 
íon Cu2+ no sítio ativo, catalisa a hidroxilação de monofenóis (atividade de 
cresolase) e a oxidação de o-difenol para sua correspondente quinona, na 
presença de oxigênio (atividade de catecolase). As o-quinonas formadas são 
instáveis e assim polimerizam-se rapidamente ou reagem com aminoácidos, 
peptídeos e proteínas, causando alterações estruturais e funcionais, diminuição 
do valor nutricional dos alimentos e dão origem a pigmentos escuros 
(melaninas) conforme reações descritas abaixo (MARTINEZ e WHITAKER, 
1995; ESCRIBANO et al., 1997;SERRADELL et al., 2000; CONCELÓN et al., 
2004). 
 
 
 
 
 
 
 
Escurecimento enzimático pela ação da polifenoloxidase. 
 
 
Em vegetais foi relatada a existência de polifenoloxidase tanto na forma 
solúvel quanto na forma ionicamente ligada, e estas localizam-se 
principalmente nos plastídios e cloroplastos das células intactas. Acredita-se 
que a fração solúvel da PPO aumenta à medida que os frutos amadurecem 
devido à solubilização e proteólise da enzima nos plastídios durante o 
amadurecimento e estocagem. Com a extração ou outro tratamento que 
danifique a estrutura celular, a enzima e o substrato entram em contato 
permitindo que a reação ocorra (MARTINEZ e WHITAKER, 1995; 
CONCELLÓN et al., 2004). Os substratos comuns da enzima cresolase são os 
monofenóis o-cresol, p-cresol, tirosina e ácido p-cumárico. Os substratos da 
enzima catecolase são os o-difenóis catecol, 4-metil catecol, catequina e 
epicatequina, ácido clorogênico, dopamina, ácido caféico, ácido gálico, ácido 3-
(3,4 dihidroxifenil) propiônico (DHPPA) e L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) 
(PARK e LUH, 1985; DINCER et al., 2002). MARTINEZ e WHITAKER (1995) 
relataram que todas as polifenoloxidases estudadas possuem a atividade de 
catecolase, mas nem todas podem hidrolisar monofenóis. A PPO está presente 
em algumas bactérias e fungos, na maioria das plantas, em alguns artrópodes 
e em todos os mamíferos. Em todos os casos essa enzima está associada à 
pigmentação escura no organismo, e parece ter uma função protetora para os 
mesmos (MAYER e HAREL, 1991). As quinonas formadas pela 
polifenoloxidase em plantas constituem o primeiro sinal de resposta fisiológica 
quando ocorrem danos aos tecidos ou ataque de patógenos, sendo que 
possuem propriedades antimicrobianas efetivas (SERRADELL et al., 2000). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Exemplos de escurecimento de alimentos 
 
Fatores que influenciam a atividade da polifenoloxidase 
 
Dentre os fatores mais importantes que determinam a velocidade da 
reação de escurecimento enzimático de frutas e vegetais, devido a ação da 
PPO, estão a concentração de PPO ativa e compostos fenólicos presentes. Em 
tecidos vivos, o substrato fenólico e a enzima estão separados dentro das 
células. Com a extração, ou outro tratamento que danifique a célula, a enzima 
e o substrato entram em contato permitindo que a reação ocorra rapidamente 
(DAWLEY e FLURKEY, 1993; ESCRIBANO et al., 1997). 
Outros fatores importantes que determinam a velocidade de 
escurecimento enzimático são o pH, a temperatura e a disponibilidade de 
oxigênio dos tecidos. O pH e a presença de oxigênio também influenciam o 
subseqüente escurecimento não enzimático (MARTINEZ e WHITAKER, 1995). 
A maioria das polifenoloxidases de frutas e vegetais apresentam atividade 
ótima em pH levemente ácido ou próximo a neutralidade, variando com a fonte 
e a pureza da enzima, o substrato fenólico e também com o tipo de tampão 
(ZHOU e FENG, 1991; VAMOS-VIGYAZO, 1981; MAYER e HAREL, 1979). Em 
geral, o tratamento térmico a 70-90ºC inativa a PPO, porém o emprego de 
tratamentos térmicos intensos pode produzir alterações de cor, textura e 
formação de off-flavors (VAMOS-VIGYAZO, 1981; MARTINEZ e WHITAKER, 
1995;). 
 
MATERIAIS UTILIZADOS 
 Liquidificador; 
 Algodão; 
 Espectrofotômetro; 
 Banho-maria; 
 Tubos de ensaio com tampa; 
 Micropipetas; 
 Béqueres; 
 Cuvetas. 
 
 
PROCEDIMENTO 
 
Preparo do extrato e observação da coloração 
 Foi preparado o extrato em um liquidificador utilizando 50,66g de batatinha e 
150mL de tampão fosfato em pH 6,5; 
 Em seguida, filtrou-se com algodão e ficou em repouso em banho de gelo por 5 
minutos; 
 Foram enumerados cinco tubos contendo conforme a seguir; 
 No tubo 1 foi adicionado 1 mL de água destilada; 
 No tubo 2 foi adicionado 1 mL de catecol 15 mM; 
 No tubo 3 foi adicionado 1 mL de hidroquinona 15 mM; 
 No tubo 4 foi adicionado 1 mL de catecol 50 mM; 
 No tubo 5 foi adicionado 1 mL de hidroquinona 50 mM; 
 Em seguida foi incubado em banho maria a 37°C por 5 minutos; 
 Em seguida foi adicionado 200 µL do sobrenadante do extrato da batatinha em 
cada um dos tubos; 
 Incubou-se novamente por mais 5 minutos e observou-se a coloração. 
 
Quantificação espectrofotométrica 
 As amostras foram preparadas diretamente na cuveta do espectrofotômetro 
conforme a seguir; 
 Amostra 1 foi adicionado 2,8 mL de água destilada e 200 µL de extrato; 
 Amostra 2 foi adicionado 2,8 mL decatecol 15 mM e 200 µL de extrato; 
 Amostra 3 foi adicionado 2,8 mL de hidroquinona 15 mM e 200 µL de extrato; 
 Amostra 4 foi adicionado 2,8 mL de catecol 50 mM e 200 µL de extrato; 
 Amostra 5 foi adicionado 2,8 mL de hidroquinona 50 mM e 200 µL de extrato; 
 Cada amostra foi preparada e imediatamente feito a leitura inicial e após 2 
minutos no espectrofotômetro utilizando um ʎ = 410nm. 
 
 
 
 
 
 
 
RESULTADOS 
 
Observação da coloração 
 
Com os resultados obtidos foi possível observar que assim como nas 
reações químicas, a velocidade das reações enzimáticas aumenta com o 
aumento da temperatura. A PPO apresentou maior valor de atividade sob 
temperatura de reação de 37°C nos tubos 2 e 4 que continham o catecol como 
substrato. O catecol (também conhecido como pirocatecol ou benzeno-1,2-diol 
com fórmula química C6H4(OH)2) que juntamente com a enzima 
polifenoloxidase ao serem expostos ao ar, permitem que se oxide, resultando 
desta reação a benzoquinona (de cor avermelhada-castanha). 
A benzoquinona, produto da oxidação do catecol, é um antimicrobial 
natural que previne na maior parte dos casos a infecção de plantas 
(principalmente nos seus frutos) por parte de microorganismos. 
Nos tubos 3 e 5 que continham a hidroquinona (também conhecido 
como quinol ou benzeno-1,4-diol com fórmula química C6H4(OH)2) 
permaneceram incolor devido a sua ação de inibição enzimática da oxidação 
da tirosina à 3,4 dihidroxifenilalanina, (tirosinase) precursora na formação da 
melanina que dá coloração escura. 
 
 
 
 
Observação espectrofotométrica 
 
TUBO AMOSTRA Δ ABS Δ TEMPO VOLUME ATIVIDADE 
1 Água + extrato (branco) - - 3 mL - 
2 Catecol 50mM + extrato 0,271 2 min 3 mL 45,1 U/mL 
3 Hidroquinona 50mM + extrato -0,019 2 min 3 mL -3,16 U/mL 
4 Catecol 15mM + extrato 0,240 2 min 3 mL 40,0 U/mL 
5 Hidroquinona 15mM + extrato -0,011 2 min 3 mL -1,83 U/mL 
 
Os resultados obtidos no teste da atividade da enzima PPO realizado no 
espectrofotômetro observamos que não houve atividade com a hidroquinona, já 
com o catecol observamos que a concentração maior reflete em uma atividade 
maior na absorbância. 
 
CONCLUSÃO 
Podemos concluir através dos experimentos realizados que a atividade 
enzimática do polifenoloxidase pode ser observada e comprovada em 
diferentes condições e meios, realizando em laboratório o que ocorre 
naturalmente em muitos vegetais, com isso podemos afirmar que obtivemos 
êxito naquilo que foi proposto na aula prática. 
REFERÊNCIAS 
Verificação de escurecimento enzimático na maçã e na batata. Disponível em: 
<https://www.ebah.com.br/content/ABAAAAcwkAG/verificacao-escurecimento-
enzimatico-na-maca-na-batata>. Acesso em 16/02/2019. 
 
Caracterização bioquímica da polifenoloxidase e da peroxidase de ameixa 
rubimel, polpa de cacau e estudo do efeito de agentes anti-escurecimento. 
Disponível em: < http://taurus.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/254353/1/Paz_ 
JanaiCristianeSantosNascimento_D.pdf> Acesso em: 16/02/2019. 
 
Avaliação da atividade e controle das polifenoloxidases em alimentos. 
Disponível em: < https://www.passeidireto.com/arquivo/2485490/relatorio-4-
polifenoloxidases>. Acesso em: 16/02/2019. 
Escurecimento enzimático em frutos: polifenoloxidase de atemóia (Annona 
cherimola Mill. X Annona squamosa L). Disponível em: 
<https://www2.fcfar.unesp.br/Home/Posgraduacao/AlimentoseNutricao/Izabella
ChavesME.pdf>. Acesso em: 16/02/2019