Manual de métodos de análise bacteriológica da água

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INSTITUTO FEDERAL DA PARAÍBA 
DEPARTAMENTO DE ENSINO MÉDIO 
CURSO TECNOLOGICO A NIVEL MÉDIO EM CONTROLE AMBIENTAL 
CAMPUS JOÃO PESSOA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manual de métodos de análise bacteriológica da água 
 
 
 
 
 
 
 
Renata Ellen Clemente da Silva 
 
 
 
 
João Pessoa – PB 
2016 
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Renata Ellen Clemente da Silva 
 
 
 
 
Manual de métodos de análise bacteriológica da água 
 
 
 
 
Manual de métodos de análise 
bacteriológica da água apresentado 
como parte do componente curricular 
Análise Bacteriológica da Água, do 
Curso tecnológico a nível médio em 
Controle Ambiental. 
 
 
 
Orientador: Prof. Maria Deise das Dores Costa Duarte; 
maria.costa@ifpb.edu.br 
 
Pesquisador: Renata Ellen Clemente da Silva; renata.ellen03@outlook.com 
 
 
 
 
João Pessoa – PB 
2016 
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SUMÁRIO 
1. INTRODUÇÃO .........................................................................................4 
2. OBJETIVO ................................................................................................5 
3. DESCRIÇÃO DOS PROCEDIMENTOS E MÉTODOS ............................6 
3.1 Procedimentos e cuidados no laboratório ...........................................6 
3.2 Preparação de material .......................................................................7 
3.3 Técnica e procedimentos de coleta de água ....................................10 
3.4 Técnicas colimétricas ........................................................................11 
3.4.1 Tubos múltiplos ......................................................................11 
3.4.2 Membrana filtrante .................................................................14 
3.4.3 Substrato definido (substrato cromogênico)...........................15 
3.5 Técnicas de plaqueamento ...............................................................17 
3.5.1 Pour Plate ..............................................................................17 
3.5.2 Spread Plate ..........................................................................18 
3.6 Técnica de coloração de Gram .........................................................20 
3.7 Análise de alimentos .........................................................................22 
3.8 Metodologia para quantificação de fungos (bolores e leveduras) ....24 
3.9 Legislação .........................................................................................26 
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................27 
5. REFERÊNCIAS ......................................................................................28 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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1. Introdução 
A água é um recurso natural essencial para a sobrevivência de qualquer 
ser vivo. Seus usos vão desde o abastecimento público, preservação da fauna e 
flora, até navegação, recreação, e geração de energia elétrica. 
As fontes de água no mundo são abundantes, porém, mal distribuídas. 
Aproximadamente 97% está nos oceanos, e 2% em forma de geleiras. Dos 1% 
restantes, grande parte está abaixo de uma profundidade de 800 m, indisponível 
para uso, restando cerca de 4 milhões de km³, de onde retiramos a água que 
consumimos e lançamos os efluentes provenientes da utilização. (Philippi, 
Pelicioni 2005) 
Dessa pequena parcela que temos disponível para o consumo, grande 
parte está comprometida por poluição e/ou contaminação, prejudicando um ou 
mais de seus usos preestabelecidos. Um rio em que estejam sendo despejados 
efluentes poderá estar contaminado por microrganismos e substâncias químicas, 
o que o impede de ser utilizado para abastecimento público, por exemplo. Para 
isso, os corpos hídricos são divididos em classes, que definem para que fins 
poderá ser utilizada a água. 
Nas águas destinadas ao abastecimento público também pode haver 
microrganismos patogênicos, que veiculam doenças e podem comprometer a 
saúde de quem a consumir. Para que isso seja evitado, é importante que a água 
passe por um tratamento antes da distribuição, visando a remoção desses 
microrganismos e de substâncias químicas nocivas, eventualmente presentes 
na água bruta. Esse tratamento é feito pelas estações de tratamento de água 
(ETAs), que têm a tarefa de enquadrar a água aos padrões de potabilidade, 
definidos pela Portaria 2914, do Ministério da Saúde. 
O monitoramento da qualidade da água é feito através da análise de seus 
parâmetros físicos, químicos e biológicos. O controle da qualidade 
microbiológica é geralmente realizado através da quantificação de bactérias do 
grupo coliforme, indicador de contaminação mais utilizado em todo o mundo. 
Densidades bacterianas elevadas podem deteriorar a água, pois favorecem o 
desenvolvimento de cor e odor na água, facilitam a eutrofização e dificultam a 
autodepuração. 
Neste trabalho estão descritas as principais metodologias para análise 
bacteriológica da água e de alimentos, desde a preparação do material utilizado 
nas análises, até as técnicas para determinação de bactérias heterotróficas, 
coliformes totais e termotolerantes, e fungos (bolores e leveduras). 
 
 
 
 
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2. Objetivo 
Descrever os procedimentos metodológicos utilizados na análise 
bacteriológica e monitoramento da qualidade da água e de alimentos, para a 
elaboração de um manual para consulta pessoal e como requisito de conclusão 
da disciplina de análise bacteriológica da água, do IFPB – Campus João Pessoa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3. Descrição dos procedimentos e técnicas 
3.1 Procedimentos e cuidados no laboratório 
Para a garantia da segurança pessoal e das análises, são necessários que 
algumas atitudes cautelosas sejam tomadas. 
 Procedimentos relacionados ao laboratório: 
As bancadas devem ser mantidas sempre limpas e livres de materiais 
estranhos ao trabalho. Caso algum produto seja derramado, deve ser limpo 
imediatamente, para evitar outros acidentes. Os reagentes, soluções, e amostras 
devem ser rotulados, e os produtos corrosivos devem ser diluídos antes de 
serem descartados na pia. Para trabalhos com líquidos inflamáveis ou voláteis, 
deve ser utilizada a capela de exaustão. 
 
 Procedimentos de ordem pessoal: 
Não se deve pipetar nenhum tipo de liquido com a boca. Enquanto estiver 
manuseando produtos químicos, não levar as mãos à boca ou aos olhos. Devem 
ser lavadas cuidadosamente com bastante água e sabão, após todo trabalho. 
Não se deve fazer refeições e nem guardar alimentos na geladeira do laboratório, 
para evitar contaminações. Além disso, o uso do jaleco é obrigatório para 
qualquer trabalho em laboratório. 
 
 Procedimentos para o uso de vidrarias: 
Antes de utilizar qualquer vidraria, deve-se certificar que ela esteja limpa e 
não esteja quebrada. Vidrarias trincadas ou quebradas devem ser colocadas 
para descarte. Os recipientes de vidro não devem ser aquecidos em chama 
direta, deve-se sempre usar tela de amianto, e não deixar os frascos quentes 
sem proteção sobre a bancada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3.2 Preparação de material 
Para garantir que o material a ser utilizado na análise esteja livre de resíduos 
químicos e orgânicos, são necessários alguns cuidados quanto à lavagem, 
secagem e esterilização das vidrarias. 
 Lavagem 
Todo o material descontaminado presente nas vidrarias deve ser removido 
antes de iniciar a lavagem. Se necessário, o material deve ficar de molho em 
solução detergente por 2 horas. Lavar as vidrarias com o auxílio de escovas e 
esponjas. Enxaguar o material com agua corrente, e a seguir, com água 
destilada. 
 Esterilização 
 
Frascos de coleta de amostra, pipetas, placas de Petri de vidro, frascos e 
tubos com água de diluição e meios de cultura devem ser esterilizados. 
As tampas rosqueáveis dos frascos devem ser afrouxadas antes de serem 
colocados para esterilização.Procedimentos: 
 
1. Esterilização úmida 
Preparar todo o material, e verificar se o nível da água dentro da autoclave 
está acima das resistências. Colocar todo o material dentro do depósito 
metálico e tampar a autoclave, apertando as travas da tampa duas a duas 
para não permitir saída de vapor pela borda do aparelho. Ligar o aparelho na 
tomada, e a chave seletora de temperatura na posição “Máximo”, e abrir 
imediatamente a válvula de escape de vapor. Quando começar a sair vapor 
por esta válvula, esperar três minutos e fechá-la. Neste instante, o ponteiro 
do manômetro começará a subir. Quando o ponteiro atingir a marca de 
1Kg/cm² de pressão, a temperatura deverá estar em 121ºC, deixar nesta 
posição durante 15 minutos. Caso a pressão continue subindo, colocar a 
chave seletora de temperatura da autoclave na posição “média“ e observar. 
Após 15 minutos, o material já estará esterilizado. 
Após a esterilização ser completa, desligar o aparelho e esperar que o 
ponteiro do manômetro atinja a posição “0”. Este procedimento poderá ser 
acelerado abrindo-se lentamente a válvula de escape de vapor. Atenção: Não 
abrir essa válvula de uma vez! Quando o ponteiro do manômetro atingir a 
posição “0” e não estiver mais saindo vapor pela válvula, abrir a tampa do 
aparelho e retirar o material. 
 
2. Esterilização seca 
O material deve ser preparado e colocado em estufa de esterilização, a 
180ºC por cerca de 2 horas. 
 
 Acondicionamento 
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Tubos de ensaio: colocar o tubo de Durhan na posição invertida dentro no tubo, 
para a verificação da formação de gases. Os tubos de ensaio devem ser 
guardados agrupados, em estantes ou cestos. 
Frascos de coleta: quando na água a ser analisada houver adição de cloro, 
colocar duas gotas (0,1 ml) de Tiossulfato de Sódio a 10% dentro do frasco. 
Envolver a boca e tampa do frasco em papel alumínio. 
Pipetas e Placas de Petri: envolvê-las em papel alumínio para vetar 
contaminantes externos. 
Espátulas, pinças e demais utensílios: para esterilização, devem ser 
embrulhados individualmente em papel alumínio. 
 
 Meios de cultura 
 
1. Caldo lactosado – etapa presuntiva para verificação da presença de 
bactérias fermentadoras de lactose. 
Caldo lactosado de concentração dupla 
Pesar 26 gramas do meio de cultura e dissolver em 1000 ml de água 
destilada. Distribuir 10 ml em cada tubo de ensaio, e esterilizar a 121º C (1 
Kg/cm2 de pressão) em autoclave durante 15 minutos. Após esfriar, guardar na 
geladeira por até uma semana. 
Caldo lactosado de concentração simples 
Pesar 13 gramas do meio de cultura e dissolver em 1000 ml de água 
destilada. Distribuir 10 ml em cada tubo de ensaio, e esterilizar a 121º C (1 
Kg/cm2 de pressão) em autoclave durante 15 minutos. Após esfriar, guardar na 
geladeira por até uma semana. 
2. Caldo lactosado verde brilhante Bile a 2% - etapa confirmativa, para 
detecção de coliformes totais. 
Pesar 40 gramas do meio de cultura e dissolver em 1000 ml de água 
destilada. Distribuir 10 ml em cada tubo de ensaio, e esterilizar a 121º C (1 
Kg/cm2 de pressão) em autoclave durante 15 minutos. Após esfriar, guardar na 
geladeira por até uma semana. 
3. Meio EC – etapa confirmativa, seletiva para bactérias de origem fecal 
que sobrevivem a 44,5°C. 
Pesar 37 gramas do meio de cultura e dissolver em 1000 ml de água 
destilada. Distribuir 10 ml em cada tubo de ensaio, e esterilizar a 121º C (1 
Kg/cm2 de pressão) em autoclave durante 15 minutos. Após esfriar, guardar na 
geladeira por até 96 horas. 
4. Plate Count Agar – utilizado para contagem de bactérias em placa. 
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Pesar 20,5 gramas do meio de cultura e dissolver em 1000 ml de água 
destilada. Deixar repousar durante 5 minutos e aquecer (não deixar entrar em 
ebulição), agitando frequentemente até a completa dissolução do meio. Se 
necessário, ajustar o pH para 7,0 com Hidróxido de Sódio solução normal (NaOH 
1N). Distribuir 12 ml em cada tubo de ensaio, e esterilizar a 121º C (1 Kg/cm2 de 
pressão) em autoclave durante 15 minutos. 
Notas: 1. Este meio, depois de frio, se solidifica. Fundir em banho maria antes de usá-lo. 2. 
Devido à variedade de meios de cultura existentes no mercado, seguir sempre as instruções do 
fabricante, que vem estampada no rótulo do frasco. 
 
 
 Água de diluição 
Solução 1 - Pesar 34 gramas de Fosfato de Potássio Monobásico (KH2PO4) 
e dissolver em 500 ml de água destilada, ajustar o pH para 7,2 com Hidróxido de 
Sódio, solução normal (NaOH 1N) e diluir a 1 litro com água destilada. 
Normalmente são necessários 175 ml de NaOH 1N para elevar o pH. 
Solução 2 - Pesar 81,1 gramas de Cloreto de Magnésio hexahidratado 
(MgCl2 .6H2 O) e dissolver em 1 litro de água destilada. 
Solução 3 - Adicionar 1,25 ml da solução 1 e 5 ml da solução 2 a 1 litro de 
água destilada. Distribuir em tubos de ensaio em quantidade que, após 
autoclavação, assegurem um volume de 9 ± 0,2 ml. - Esterilizar em autoclave a 
121º C (1Kg/cm2 de pressão) durante 15 minutos. 
 
Modo de usar a água de diluição quando for determinar o NMP de coliformes: 
Adicionar 9 ml da água de diluição e 1 ml da amostra em um tubo de 
ensaio, e agitar. Esta é a diluição 1:10. Desta diluição, tirar 1 ml e inocular no 
tubo contendo caldo lactosado simples (diluição 1:100). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3.3 Técnica e procedimentos de coleta de água 
É importante que sejam tomados cuidados no momento da coleta, para 
que o material coletado represente de forma fiel o local de amostragem. Além 
disso, deve ser observado se o local pode ser fonte de contaminação, e, se 
possível, deve ser desinfectado antes da amostragem. 
As amostras devem ser coletadas em frasco de vidro esterilizado, com 
capacidade de pelo menos 100 ml. 
 Procedimentos para coleta em residências 
Deve-se lavar as mãos, e limpar a torneira com algodão embebido em álcool, 
de dentro para fora, para que sujeiras não sejam levadas para a parte interna da 
torneira. Deve-se abri-la para que a água escorra durante alguns segundos. 
Coletar a amostra de água, e identificar no frasco a hora e data da coleta, local, 
e o responsável pela coleta. Para coleta de água clorada, deve ser adicionado 
ao frasco 0,1 ml (duas gotas) de tiossulfato de sódio a 10%, antes da 
esterilização, para a inibição do efeito do cloro. 
 
Nas estações de tratamento de água, as amostras são coletadas na captação 
(água bruta), nos decantadores, na saída dos filtros e nos reservatórios de água 
tratada. 
Após coletadas, as amostras devem ser imediatamente acondicionadas em 
isopor com gelo e transportadas ao laboratório. A análise deve ser feita em, no 
máximo, 24 horas após a coleta, para que sua representatividade não seja 
comprometida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3.4 Técnicas colimétricas 
 Método dos tubos múltiplos 
1. Coliformes totais 
Material: 
a. Tubo de ensaio com tubo de Durhan; 
b. Estante para tubos de ensaio; 
c. Pipetas graduadas de 1 e 10 ml; 
d. Bico de Bunsen; 
e. Caldo lactosado de concentração simples e dupla; 
f. Caldo lactosado verde brilhante Bile; 
g. Alça de platina; 
h. Estufa bacteriológica. 
 
Execução: 
Teste presuntivo 
Tomar uma bateria contendo 15 tubos de ensaio distribuídos de 5 em 5. 
Nos primeiros 5 tubos, adicionar o caldo lactosado de concentração dupla e 
inocular, com pipeta esterilizada, 10 ml da amostra de água em cada tubo 
(Diluição 1:1); nos 10 tubos restantes adicionar caldo lactosado de concentração 
simples e inocular, nos 5 primeiros, 1 ml da amostra (Diluição 1:10) e nos 5 
últimos tubos, 0,1 ml da amostra em cada tubo (Diluição 1:100). Incubar a 35 ± 
0,5º C durante 24/48 horas. Ao final desse tempo, se houver formação de gás 
dentro do tubo de Durhan, significa que o teste presuntivo foi positivo. Neste 
caso, fazer o teste confirmativo. Se não houver a formação de gás durante o 
período de incubação, o exame termina nesta fase e o resultado do teste é 
considerado negativo.Teste confirmativo 
Tomar o número de tubos do teste presuntivo que deram positivos 
(formação de gás), e tomar igual número de tubos contendo o meio de cultura 
verde brilhante bile a 2%. Com a alça de platina, previamente flambada e fria, 
retirar de cada tubo positivo uma porção de amostra e inocular no tubo 
correspondente contendo o meio verde brilhante. Identificar os tubos, e incubar 
durante 24/48 horas a 35 ± 0,5ºC. Se no final do período de 24/48 horas houver 
a formação de gás dentro do tubo de Durhan o teste é considerado positivo. 
Caso não haja formação de gás, o teste é considerado negativo. 
Os resultados são expressos em N.M.P (Número Mais Provável) /100 ml 
de amostra. Para se determinar o N.M.P, verifica-se a combinação formada pelo 
número de tubos positivos no teste confirmativo. 
Exemplo: 
Nos 5 tubos da diluição 1:1, obtiveram-se 3 tubos positivos; nos 5 tubos 
da diluição 1:10, obtiveram-se 2 tubos positivos; e nos 5 tubos da diluição 1:100, 
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obteve-se 1 tubo positivo. Formou-se, portanto, a combinação 3-2-1. Determina-
se o N.M.P consultando a tabela 1. Nesta amostra, tivemos um NMP de 70 
coliformes totais em 100 ml. 
 
Combinação de 
positivos 
NMP/100 ml Limite inferior Limite superior 
0-0-0 <2 - - 
0-0-1 2 1.0 10 
0-1-0 2 1.0 10 
0-2-0 4 1.0 13 
1-0-0 2 1.0 11 
1-0-1 4 1.0 15 
1-1-0 4 1.0 15 
1-1-1 6 2.0 18 
1-2-0 6 2.0 18 
2-0-0 4 1.0 17 
2-0-1 7 2.0 20 
2-1-0 7 2.0 21 
2-1-1 9 3.0 24 
2-2-0 9 3.0 25 
2-3-0 12 5.0 29 
3-0-0 8 3.0 24 
3-0-1 11 4.0 29 
3-1-0 11 4.0 29 
3-1-1 14 6.0 35 
3-2-0 14 6.0 35 
3-2-1 17 7.0 40 
4-0-0 13 5.0 38 
4-0-1 17 7.0 45 
4-1-0 17 7.0 46 
4-1-1 21 9.0 55 
4-1-2 22 12 63 
4-2-0 26 9.0 56 
4-2-1 26 12 65 
4-3-0 27 12 67 
4-3-1 33 15 77 
4-4-0 34 16 80 
5-0-0 23 9 86 
5-0-1 30 10 110 
5-0-2 40 20 140 
5-1-0 30 10 120 
5-1-1 50 20 150 
5-1-2 60 30 180 
5-2-0 50 20 170 
5-2-1 70 30 210 
5-2-2 90 40 250 
5-3-0 80 30 250 
13 
 
5-3-1 110 40 300 
5-3-2 140 60 360 
5-3-3 170 80 410 
5-4-0 130 50 390 
5-4-1 170 70 480 
5-4-2 220 100 560 
5-4-3 280 120 690 
5-4-4 350 160 820 
5-5-0 240 100 940 
5-5-1 300 100 1300 
5-5-2 500 200 2000 
5-5-3 900 300 2900 
5-5-4 1600 600 5300 
5-5-5 ≥1600 - - 
Tabela 1 – NMP com limite de confiança de 95% para várias combinações de resultados 
positivos quando 5 tubos são usados para cada diluição (10 ml, 1,0 ml e 0,1 ml). 
 
 
Imagem 1: Tubos com caldo VB positivos. 
 
2. Coliformes termotolerantes 
Material: 
a. Tubos de ensaio com Meio EC; 
b. Bico de Bunsen; 
c. Alça de platina; 
d. Estufa bacteriológica. 
 
Execução: 
14 
 
Tomar todos os tubos do teste presuntivo que deram positivos e todos os 
tubos negativos em que houve crescimento após 48 horas, nas 3 diluições (1:1; 
1:10 e 1:100), e transferir, com alça de platina flambada e fria, uma porção para 
os tubos de ensaio contendo o meio EC e incubar a 44,5 ± 0,2º C durante 24 ± 
2 horas. Se no final de 24 horas ou menos houver a formação de gás, está 
indicado a presença de coliformes de origem fecal. Calcular o N.M.P consultando 
a tabela 1. 
Nota: Este ensaio deve ser realizado simultaneamente com o Teste Confirmativo para 
Coliformes Totais. 
 
 Método da membrana filtrante 
1. Coliformes totais 
Material: 
a. Equipamento de filtração com porta filtro; 
b. Placa de Petri esterilizada; 
c. Filtros de membrana com porosidade de 0,45µm, com cartão absorvente; 
d. Meio de cultura (m Endo Broth MF); 
e. Água de diluição estéril; 
f. Pinça e copo de aço inox; 
g. Bico de Bunsen; 
h. Bomba de vácuo (seringa); 
i. Estufa bacteriológica. 
Execução: 
Com a pinça, colocar cuidadosamente na placa de Petri um cartão 
absorvente. Pipetar 1,8 ml do meio de cultura, colocar no cartão absorvente e 
tampar a placa. Colocar a membrana filtrante no porta-filtro, com a pinça 
flambada e fria. Agitar o frasco contendo a amostra, destampar e flambar a boca 
do frasco, e verter, cuidadosamente, 100 ml de amostra noporta filtro, evitando 
que a água respingue sobre as bordas superiores. Ligar a bomba de vácuo 
(seringa) e fazer a sucção. Depois de filtrada a amostra, lavar 3 vezes as paredes 
do funil com água de diluição estéril com porções de 20 ml aplicando vácuo. 
Após a lavagem e filtração, aliviar o vácuo e remover o funil do suporte. Com a 
pinça flambada e fria, remover o filtro do suporte e colocá-lo na placa de Petri, 
antes preparada, com o lado quadriculado para cima. Tampar a placa de Petri e 
incubá-la invertida a 35º C durante 24 ± 2 horas. Após o período de incubação, 
examinar o filtro fazendo a contagem das colônias. 
As colônias indicativas de coliformes totais típicas têm uma cor rosa a 
vermelho escuro, com brilho metálico. O brilho pode aparecer no centro ou na 
periferia da colônia. As não coliformes aparecem com coloração vermelho-clara 
ou escura sem o brilho metálico característico. 
Observação: Às vezes, quando o disco está muito úmido e a fonte de luz é muito 
intensa, as colônias de não coliformes podem aparecer com um brilho falso, 
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causando erros. Isto poderá ser contornado usando-se fonte de luz mais difusa 
ou secando-se o filtro antes de ser examinado. 
Preparo do meio de cultura 
Pesar 4,8 gramas do meio desidratado, e transferir para um erlenmeyer. 
Adicionar aos poucos 100 ml de água destilada contendo 2 ml de álcool etílico a 
95%. Aquecer em banho-maria ou no bico de Bunsen até o início da fervura (não 
deixar ferver), e deixar esfriar. Distribuir 1,8 ml em cada placa. 
2. Coliformes termotolerantes 
Os materiais utilizados são os mesmos da análise para coliformes totais, 
alterando apenas o meio de cultura para m FC Broth Base. 
Preparo do meio de cultura 
Pesar 3,7 gramas do meio desidratado, e transferir para um Erlenmeyer. 
Dissolver o meio pesado em 100 ml de água destilada. Adicionar 1 ml da solução 
de ácido rosólico a 1%, aquecer até a ebulição e deixar esfriar. Distribuir 2,0 ml 
em cada placa. 
Observação: Para preparar o ácido rosólico a 1% dissolver 1 grama do ácido em 100 ml de 
NaOH 0,2 N; Para preparar o NaOH 0,2 N diluir 20 ml da solução 1N para 100 ml de água 
destilada. O ácido rosólico dura 2 semanas ou menos, quando guardado na geladeira (2 a 
10ºC). Descartar quando a coloração mudar de vermelho-escuro para marrom. Este meio pode 
ser solidificado adicionando 1,2 a 1,5% de agar antes da ebulição. 
Execução: 
Com a pinça, colocar cuidadosamente na placa de Petri um cartão 
absorvente. Pipetar 2,0 ml do meio de cultura, colocar no cartão absorvente e 
tampar a placa. Colocar a membrana filtrante no porta-filtro, com a pinça 
flambada e fria. Agitar o frasco contendo a amostra, destampar e flambar a boca 
do frasco. Verter, cuidadosamente, 100 ml de amostra no porta filtro, evitando 
que a água respingue sobre as bordas superiores. Ligar a bomba de vácuo 
(seringa) e fazer a sucção. Depois de filtrada a amostra, lavar 3 vezes as paredes 
do funil com água de diluição estéril com porções de 20 ml aplicando vácuo. 
Após a lavagem e filtração, aliviar o vácuo e remover o funil do suporte. Com a 
pinça flambada e fria, remover o filtro do suporte e colocá-lo dentro da placa de 
Petri, com o lado quadriculado para cima. Tampar a placa de Petri e incubá-la 
invertida a 44,5 ± 0,2º C durante 24 ± 2 horas. Encerrado o período de incubação, 
examinar o filtro fazendo a contagem das colônias. 
As colônias indicativas de coliformes termotolerantes aparecem de cor 
azul. As não coliformes, aparecem com coloração clara ou rósea. 
 
 Método do substrato cromogênico 
Teste de presença/ausência 
Material: 
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a. Recipiente de coleta de vidro ou de plástico; 
b. Substrato cromogênico; 
c. Estufa bacteriológica; 
d. Lâmpada ultravioleta de 365 nm. 
Execução: 
Coletar a amostra em um frasco estéril ou saco de coleta contendo 
tiossulfato de sódio a 10% para água tratada. No próprio frasco ou saco adicionar 
o conteúdo de um frasconetecontendo o substrato cromogênico. Fechar o frasco 
ou o saco e agitar levemente, não precisa dissolver totalmente, essa dissolução 
ocorrerá de forma natural. Incubar a 35,0 ± 0,5º C durante 24 horas. Passado o 
tempo de incubação, retirar da estufa o material. Ao observar a cor amarela, o 
resultado é presença de coliformes totais na amostra. 
Com o auxílio de uma lâmpada ultravioleta 365 nm, observar se existe 
fluorescência azul no frasco amarelo, aproximando a lâmpada do frasco. Caso 
isso aconteça, significa que há presença de Escherichia coli na amostra 
examinada. Caso a amostra permaneça transparente, o resultado é negativo, 
tanto para coliformes totais como para E. coli. 
Expressar o resultado como: Presença ou Ausência de Coliformes Totais 
ou Escherichia coli. 
Nota: A fluorescência azul ocorre somente na presença da luz ultravioleta, ao tirar o frasco da 
frente da luz ele volta a ficar amarelo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
3.5 Técnicas de plaqueamento 
Na microbiologia, são utilizadas várias técnicas para quantificação de 
bactérias e indicação da qualidade da água. Dentre esses métodos, está o de 
contagem em placa, em que bactérias heterotróficas (bactérias que necessitam 
de compostos orgânicos diferentes do CO2 para a síntese de seu protoplasto) 
são detectadas por crescimento em meios de cultura não seletivos. Os 
resultados são expressos em Unidades Formadoras de Colônia (UFC/ml). 
A contagem de microrganismos em placa apresenta algumas vantagens 
e desvantagens em relação a outros métodos. Essa técnica permite o isolamento 
das colônias, que podem ser sub cultivadas em meios de cultura seletivos, para 
serem facilmente identificadas e estudadas. Por outro lado, a necessidade de 
muita manipulação pode originar alterações na contagem das colônias, devido a 
erros de diluição ou plaqueamento. 
 
A técnica de contagem em placa pode ser subdividida em duas técnicas: 
1. Pour Plate 
Pela metodologia de “Pour Plate” verte-se o meio fundido sobre a amostra, o 
que permite o crescimento bacteriano no interior do ágar. Essa metodologia 
apresenta algumas desvantagens, pois alguns microrganismos sensíveis ao 
calor podem ser danificados pelo ágar fundido, resultando em um número inferior 
de colônias do que o verdadeiro. (Domingues et al, 2007) 
Material: 
1. Placas de Petri; 
2. Pipeta graduada; 
3. Bico de Bunsen; 
4. Meio plate count agar; 
5. Estufa bacteriológica; 
6. Contador de colônia. 
Execução: 
Transferir, com pipeta estéril, 1 ml da amostra para uma placa de Petri 
esterilizada. Entreabrir a placa e adicionar o meio de cultura, previamente 
fundido e mantido a uma temperatura entre 44 °C e 46°C. Homogeneizar o 
conteúdo da placa em movimentos circulares moderados em forma de (∞). 
Quando o meio de cultura se solidificar, incubar a placa em posição invertida a 
35 ± 0,5º C durante 48 ± 3 horas, e ao final do período, fazer a contagem das 
colônias com o auxílio de um contador de colônias. Os resultados são expressos 
como número de colônias de bactérias/ml ou Unidades Formadoras de Colônias 
(UFC)/ml. 
 
 
18 
 
2. Spread Plate 
A amostra é depositada na superfície do meio de cultura já solidificado, e 
uniformemente espalhada. Nesse método, não há a limitação do choque térmico, 
e todas as colônias se desenvolvem na superfície do meio, porém, a limitação 
dessa técnica é quanto ao volume de amostra a ser utilizado, que chega ao 
máximo de 0,5 ml. 
 
Imagem 2: Crescimento de bactérias em placa com método Spread Plate. 
Material: 
1. Placas de Petri; 
2. Pipeta graduada; 
3. Bico de Bunsen; 
4. Meio plate count agar; 
5. Estufa bacteriológica; 
6. Contador de colônia. 
Execução: 
Transferir, com pipeta estéril, 0,1 ml da amostra para uma placa de Petri 
contendo o meio de cultura. Espalhar o inoculo com auxílio de uma alça ou 
bastão estéreis. Incubar a placa a 35 ± 0,5º C durante 48 ± 3 horas, e ao final do 
período, fazer a contagem das colônias com o auxílio de um contador de 
colônias. Os resultados são expressos como número de colônias de bactérias/ml 
ou Unidades Formadoras de Colônias (UFC/ml). 
19 
 
 
Figura 1: Pour Plate x Spread Plate. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
3.6 Técnica de coloração de Gram 
A técnica de coloração de Gram foi desenvolvida em 1884, pelo médico 
dinamarquês Cristian Gram. Ele notou que, quando submetidas a diferentes 
corantes, as bactérias adquiriam cores diferentes. Com isso, ele as classificou 
em dois grupos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram positivas, 
e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram negativas. Essa técnica de 
coloração é uma importante ferramenta para a classificação, diferenciação e 
estudo das propriedades das bactérias, já que naturalmente estas são 
praticamente incolores. 
 A diferenciação de coloração se dá devido a diferença na estrutura das 
bactérias. As Gram positivas possuem uma parede celular constituída por uma 
espessa camada de peptidioglicano, e seu teor de lipídios é nulo, ou, em 
algumas espécies, muito baixo. A camada de peptidioglicano atua como uma 
barreira, que impede a saída do corante primário, fazendo com que as células 
fiquem coradas de violeta. Nas Gram negativas, há um alto teor de lipídios em 
sua membrana externa, e uma fina camada de peptidioglicano que envolve a 
membrana plasmática. Com isso, durante a diferenciação pelo álcool, parte dos 
lipídios é dissolvida, e formam-se poros na parede celular que permitem a saída 
do corante primário (violeta) das células, que tornam-se transparentes e 
permitem a entrada do corante secundário (safranina). 
 
Material: 
a. Corante primário (violeta de genciana); 
b. Solução de lugol (iodeto de potássio - KI); 
c. Corante secundário (safranina); 
d. Álcool; 
e. Suspensão bacteriana; 
f. Lâminas; 
g. Alça bacteriológica; 
h. Bico de Bunsen; 
i. Pipeta; 
j. Pinças; 
k. Microscópio; 
l. Óleo de imersão. 
 
Execução: 
 
1. Preparação do esfregaço bacteriano 
Limpar bem uma lâmina de vidro, com algodão embebido em álcool. Quando 
for uma cultura em meio sólido, colocar uma gota de água destilada sobre a 
lâmina e com uma alça bacteriológica, colher uma pequena quantidade do 
crescimento bacteriano e espalhar na lâmina. Fixar o esfregaço no ar, ou 
passando três vezes sobre a chama, e esperar esfriar. 
21 
 
2. Coloração 
Cobrir o esfregaço seco com o corante primário (violeta de genciana), e 
esperar um minuto. Lavar com água corrente ou destilada, para remover o 
excesso da solução. Cobrir o esfregaço com solução de lugol, deixar agir por um 
minuto, e lavar novamente com água corrente. Adicionar álcool à lâmina, até que 
o corante não se desprenda mais, e lavar com água. Cobrir o esfregaço com o 
corante secundário (safranina), deixar agir por 30 segundos, e lavar novamente. 
Esperar a lamina secar naturalmente, ou 
enxuga-la delicadamente com papel filtro, 
através de leve compressão. Para a 
observação, deve ser colocada uma gota 
de óleo de imersão sobre a lâmina, e ler 
em objetiva de imersão (100x). 
Examinar a lâmina ao microscópio, 
usando objetiva de imersão. As bactérias 
coliformes são bacilos, gram-negativos 
(coradas de vermelho) e podem aparecer 
aos pares ou raramente em pequenas 
colônias. As bactérias gram-positivas são 
coradas de roxo (violeta azulado). 
 
A imagem a seguir mostra a reação das bactérias com a aplicação de 
cada reagente: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Imagem 3: Lâmina colorida. 
Figura 2: Bactérias Gram positivas x Gram negativas. 
22 
 
3.7 Análise de alimentos 
 Dentre os parâmetros que definem a qualidade de um alimento, o 
microbiológico é um dos mais importantes, pois a contaminação por 
microrganismos patogênicos pode comprometer desde a qualidade e vida útil de 
um alimento, até a saúde do consumidor. A análise da contaminação pode 
fornecer informações sobre as condições de produção,armazenamento, e vida 
útil do alimento, já que alguns microrganismos deterioram o alimento. 
Há vários tipos de microrganismos que podem comprometer a qualidade 
de um alimento, e a distribuição destes pode não ser uniforme em todo o 
alimento. Para que o resultado das análises seja representativo do alimento 
como um todo, é importante que os procedimentos de análise sejam executados 
com cuidado. 
É mais comum encontrar contaminação em alimentos crus, pois estes 
apresentam uma microbiota natural. Por isso, é importante cozer bem os 
alimentos antes de ingeri-los, evitando o comprometimento da saúde do 
consumidor. 
Material: 
a. Processador de alimentos (liquidificador); 
b. Peneira; 
c. Béquer; 
d. Tubos de ensaio; 
e. Placas de Petri; 
f. Pipetas; 
g. Água peptonada; 
h. Meios de Cultura: Caldo lactosado, Caldo verde brilhante, Caldo EC, Ágar 
SS (Agar Salmonela-Shigella). 
 
Execução: 
Para alimentos sólidos, pesar 25 g do alimento, colocar no liquidificador com 
225 ml de água peptonada, bater por 60 segundos, e coar. Para alimentos 
líquidos, diluir 1 ml em 9 ml de água peptonada. Esta é a diluição 10-1. Proceder 
com as diluições seriadas (10-2 e 10-3). Para as diluições seguintes, adiciona-se 
9 ml de agua peptonada e 1 ml da diluição anterior. 
Preparar os tubos com CLD (caldo lactosado duplo) e colocar, em cada três 
tubos, 1 ml de cada diluição. Incuba-los a 350C (+/- 2), por 48 horas. Decorrido 
o tempo de observação, inocular os tubos que deram positivo em VB e EC, 
seguindo o mesmo procedimento de análise de água. 
 
Determinação de salmonela 
23 
 
Inocular cada diluição em três placas de Petri, utilizando a técnica “Pour 
Plate” (1 ml do inóculo) ou “Spread Plate” (0,1 a 0,5 ml do inóculo), e incubar as 
placas à 350C (+/- 2), por 24 horas. Decorrido o tempo de incubação, contar as 
colônias com o auxilio de um contador de colônias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
3.8 Metodologia para quantificação de fungos (bolores e 
leveduras) 
 Os fungos são organismos heterotróficos que se desenvolvem em 
ambientes úmidos. Apresentam formas unicelulares ou filamentosas, como em 
alguns cogumelos. Para obtenção de alimento, agem como sapróbios, parasitas, 
ou simbiontes. Alguns, principalmente as leveduras, obtêm energia através da 
fermentação, produzindo álcool etílico a partir da glicose. 
Eles têm grande importância comercial: são utilizados na fermentação 
alcóolica de vinhos e cervejas, alimentos, e na fabricação de fármacos como a 
penicilina e cefalosporina. Também são importantes na ciclagem de nutrientes 
no solo, com as micorrizas, por exemplo, que são associações simbióticas de 
fungos e raízes. Por outro lado, algumas espécies são patógenas e podem trazer 
problemas para a agricultura e para a saúde do homem, devido a uma toxina por 
eles produzida. 
A presença de bolores e leveduras é um indicador de poluição. A 
contagem desses microrganismos nos traz informações sobre a pureza e 
qualidade da água, e a conservação dos alimentos, pois estes deterioram sucos 
de fruta, queijos, alimentos congelados, desidratados e em conserva, frutas, e 
outros alimentos. Boas práticas de higiene e o correto armazenamento desses 
alimentos são algumas das medidas que evitam essa contaminação. 
O meio de cultura para quantificação de fungos deve ser escolhido de 
acordo com a amostra ou o agente etiológico pressupostamente presente nela. 
Alguns meios de cultura dispõem de antibióticos, para evitar que bactérias 
cresçam e dificultem a quantificação dos fungos. Dentre os meios de cultura 
utilizados, estão Ágar Sabouraud Dextrose (ASD), Ágar Fubá, e Ágar batata. 
A metodologia para quantificação de fungos em água e alimentos se 
assemelha à de quantificação de bactérias em alimentos. 
 
Material: 
a. Processador de alimentos (liquidificador); 
b. Peneira; 
c. Béquer; 
d. Tubos de ensaio; 
e. Placas de Petri; 
f. Pipetas; 
g. Água peptonada; 
h. Meios de Cultura: Ágar Sabouraud Dextrose (ASD), Ágar Fubá, e/ou Ágar 
batata. 
 
Execução: 
Para alimentos sólidos, pesar 25 g do alimento, colocar no liquidificador com 
225 ml de água peptonada, bater por 60 segundos, e coar. Para água ou 
25 
 
alimentos líquidos, diluir 1 ml em 9 ml de água peptonada. Esta é a diluição 10-
1. Inocular cada diluição em placas de Petri com o meio de cultura adequado, 
utilizando a técnica “Pour Plate” (1 ml do inóculo) ou “Spread Plate” (0,1 a 0,5 ml 
do inóculo), e incubar as placas à 300C (+/- 2), por 8 dias. Decorrido o tempo de 
incubação, observar o crescimento e fazer o isolamento das colônias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Imagens 4, 5, 6: Crescimento de fungos. 
26 
 
3.9 Legislação 
 
 Portaria Nº 2.914, de 12 de dezembro de 2011 – Ministério da Saúde 
Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da 
água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. Aplica-se à água 
destinada ao consumo humano proveniente de sistema e solução alternativa de 
abastecimento de água. 
 
 Resolução N° 357, de 17 de março de 2005 – CONAMA 
Dispõe sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para 
o seu enquadramento, bem como estabelece as condições e padrões de 
lançamento de efluentes, e dá outras providências. 
 
 Resolução N° 274, de 29 de novembro de 2000 – CONAMA 
Define os critérios de balneabilidade em águas brasileiras, considerando que 
a saúde e o bem estar humano podem ser afetados pelas condições de 
balneabilidade. 
 
 Resolução RDC Nº 12, de 2 de janeiro de 2001 - Anvisa 
Estabelece os Padrões Microbiológicos Sanitários para Alimentos 
especificados no Anexo I e determina os critérios para a Conclusão e 
Interpretação dos Resultados das Análises Microbiológicas de Alimentos 
Destinados ao Consumo Humano especificados no Anexo II. Este Regulamento 
se aplica aos alimentos destinados ao consumo humano. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
4. Considerações finais 
A presença de microrganismos patógenos na água prejudica 
sua qualidade e a saúde de quem a consome. A análise e 
monitoramento da qualidade da água é essencial para assegurar que 
esta água que é distribuída para consumo esteja dentro dos padrões 
de potabilidade. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
5. Referências 
 
 
Manual prático de análise de água. 3° ed. rev. Brasilia: Fundação Nacional de 
Saúde, 2009. 144p. Disponível em: <http://www.funasa.gov.br/site/wp-
content/files_mf/eng_analAgua.pdf> 
 
 
PROJETO BRASIL DAS ÁGUAS. Revelando o azul do verde e amarelo. Brasil, 
2013. Disponível em: <http://www.brasildasaguas.com.br/educacional/a-
importancia-da-agua>. Acesso em: 23 mar. 2016. 
 
 
PHILIPPI JR, Arlindo; PELICIONI, Maria Cecília Focesi. Educação Ambiental e 
Sustentabilidade. 1° ed. Barueri, SP: Manoele, 2005. 
 
BRASIL. RESOLUÇÃO N° 357, de 17 de março de 2005. CONAMA. Disponível 
em: <http://www.mma.gov.br/port/conama/legiabre.cfm?codlegi=459>. Acesso 
em: 23 mar. 2016. 
BRASIL. RESOLUÇÃO N° 274, de 29 de novembro de 2000. CONAMA. 
Disponível em: 
<http://www.mma.gov.br/port/conama/legislacao/CONAMA_RES_CONS_2000_
274.pdf>. Acesso em: 25 mar. 2016. 
BRASIL. PORTARIA Nº 2914, de 12 de dezembro de 2011. Ministério da 
Saúde. Disponível em: 
<http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/gm/2011/prt2914_12_12_2011.html
>. Acesso em: 25 mar. 2016. 
BRASIL. RESOLUÇÂO RDC N° 12, de 02 de janeiro de 2001. ANVISA. 
Disponível em: 
<http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2001/res0012_02_01_2001.
html>. Acesso em: 25 mar. 2016. 
Análise microbiológica de alimentos: importância do plano de amostragem. 
Disponível em: <http://foodsafetybrazil.org/analise-microbiologica-de-alimentos-
importancia-do-plano-de-amostragem/>. Acesso em: 27 mar. 2016.