Aula genomica (bloco 2)

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Estrutura de Genomas/Bioinformática
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O que é GENÔMICA?
Genoma: conjunto de genes de uma espécie
Investigar o genoma como um todo, com a intenção de catalogar todos os seus genes e a função de cada um deles.
Genômica estrutural
	- Mapas cromossômicos
	- Seqüenciamento genômico
Genômica funcional
	- Análise da expressão
		Transcriptoma
		Proteoma
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Genoma
Mapa
Seqüência Gênica
Transcritos
Proteínas
Genômica estrutural
Genômica funcional
Expressão Gênica
A
C
T
G
A
C
T
G
A
C
T
G
T
G
T
G
A
C
T
G
T
G
A
C
A
C
T
G
G
T
G
T
A
C
T
G
T
G
G
T
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MAPEAMENTO
Objetivo principal: 
Construção de uma série de mapas descritivos de cada cromossomo de diferentes espécies com resolução cada vez mais apurada.
Para isso é preciso:
Dividir os cromossomos em fragmentos pequenos que possam ser propagados e caracterizados. Em seguida ordená-los em suas respectivas posições nos cromossomos, ou seja, fazer o mapeamento. 
Genômica Estrutural
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Exemplo de Mapa de Cromossoma
Genômica Estrutural
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Após o mapeamento cada cromossoma do genoma será seqüenciado.
Tipos de Seqüenciamento:
Seqüenciamento de DNA genômico 
É a determinação da seqüência de todo o material genético de um organismo, compreendendo as regiões codificantes e regiões ainda não reconhecidas como codificantes, promotores, íntrons, sequências repetitivas, etc...
Feito a partir de bibliotecas genômicas, havendo o seqüenciamento das duas fitas do DNA (5’ e 3’).
Seqüenciamento de ESTs (Expressed Sequence Tags)
É a determinação da seqüência somente das regiões codificadoras (transcritos = mRNA).
Feito a partir de bibliotecas de cDNA, que refletem a expressão de genes naquele determinado organismo, tecido, órgão, tratamento, doença, etc... 
Genômica Estrutural
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Para mapear o genoma é necessária a construção de Bibliotecas Genômica e de cDNA.
Genômica Estrutural
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Construção de Biblioteca genômica
Sobreposição das regiões conhecidas dos vetores para caracterização do contig.
Genômica Estrutural
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Biblioteca Genômica
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Transcriptase reversa
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Biblioteca de cDNA
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Biblioteca de cDNA
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Biblioteca Genômica X Biblioteca de cDNA
A biblioteca de cDNA permite o sequenciamento dos genes que estão sendo expressos num dado momento - TRANSCRIPTOMA
STS 
(sequence-tag site)
EST 
(expressed sequence-tag)
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	Qualquer tipo de ácido nucléico pode ser seqüenciado, amostras de RNA, DNA genômico, plasmídeos, cromossomas artificiais e produtos de PCR.
	O primeiro método de seqüenciamento de DNA foi desenvolvido em meados dos anos 70 e ficou conhecido como Seqüenciamento Químico ou Maxam-Gilbert Sequencing. 
	O segundo método de seqüenciamento de DNA ficou conhecido como Seqüenciamento Enzimático, Dideoxi ou Sanger-Coulson Sequencing.
Seqüenciamento
Genômica Estrutural
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Seqüenciamento do DNA
Método de terminação da cadeia (Sanger et al., 1977)
Método de degradação química (Maxam and Gilbert, 1977)
MÉTODO DE SANGER
Dideoxinucleotídeo – nucleotídeo especial que NÃO contém a hidroxila livre no carbono 3´
Gel de poliacrilamida – separa fragmentos de DNA pelo tamanho com precisão de apenas 1 nucleotídeo.
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Seqüenciamento de Sanger
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Seqüenciamento de Sanger
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Método Enzimático, Dideoxi ou Sanger
Nesse método o princípio básico é a síntese de uma nova fita pela DNA polimerase. O primer é marcado na sua extremidade 5` com 32P. A Dna pol, os dNTPs e os ddNTPs são adicionados em quatro tubos juntamente com o DNA e o primer. A síntese da nova fita acontece até ser adicionado um dideoxinucleotídeo, que impede a continuidade da síntese. Os fragmentos resultantes são analisados pela migração eletroforética.
Genômica Estrutural
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Método Enzimático, Dideoxi ou Sanger
Exemplo de fragmentos resultantes:
Genômica Estrutural
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Seqüenciamento Automático
Ao longo dos anos o método Sanger se tornou o método mais reprodutível e utilizado. O avanço da tecnologia solucionou parte das limitações apresentadas por esse método. O que permitiu que fosse utilizado nos dias atuais.
O seqüenciamento automático utiliza os mesmos dideoxinucleotídeos utilizados em Sanger, marcados com fluorescência. Sendo que o seu maior avanço encontra-se no fato de utilizar laser e programas de computador específicos para detectar o sinal dos ddNTPs.
Quando os ddNTPs são excitados com laser, emitem fluorescência num comprimento de onda específico para cada ddNTP. Este comprimento de onda é detectado pelo Sequenciador, que gera a seqüência do DNA. Com isso, não a necessidade de reações em tubos diferentes para cada fragmento a ser seqüenciado.
Foto do Seqüenciador
Genômica Estrutural
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Seqüenciamento atual
Leitor eletrônico de seqüência!
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Exemplo de Eletroferograma 
Seqüenciamento Automático
Genômica Estrutural
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Sequenciamento de 2º Geração
Pirosequenciamento
Genômica
Roche (454) 
Solexa/Illumina
ABI SoliD 
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Sequenciamento de 2º Geração - Comparação
Genômica
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Sequenciamento de 3º Geração
Genômica
SMRT PacBIo
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 Uma vez obtida uma seqüência, as etapas seguintes são:
3. Montagem:
 Retirada das regiões correspondentes aos vetores de clonagem (plasmídeos, etc...).
Análise dos grupamentos formados: comparação entre as seqüências visando encontrar quais delas são idênticas ou contem regiões parecidas o suficiente para que sejam reunidas.
 Cada uma das seqüências deve ao final representar um gene (ou parte) distinto ou o membro de uma família gênica. 
BIOINFORMÁTICA
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 4. Anotação:
 A nível de nucleotídeos: localização física das sequências de DNA, descobrir onde os genes se localizam.
 A nível protêico: identificar a função dos genes (análise de domínios funcionais, configurações espaciais e presença de padrões conservados em proteínas já bem caracterizadas).
 A nível de processo: identificação de vias metabólicas, onde os genes podem estar atuando.
Crescimento exponencial do número de sequencias contidas no GenBank de 1992 a 2002
As bases de dados em biologia molecular disponibilizam os dados produzidos em todo o mundo
BIOINFORMÁTICA
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Projeto Genoma
O início...
As primeiras propostas para se mapear o genoma humano surgiram em 1985, quando um grupo de cientistas pretendiam detectar mutações em humanos. Com isso foi criado o Projeto Genoma Humano. 
Mais tarde Craig Venter funda a empresa Celera Genomics, tendo como um dos principais objetivos seqüênciar todo o genoma humano antes do Projeto Genoma Humano. Em 2000 a Celera anuncia a conclusão do sequenciamento.
A estratégia...
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Projeto Genoma
O projeto genoma humano é só uma parte da história, já que o genoma de outras espécies já foram ou estão sendo seqüenciados, num esforço para identificar novas proteínas, genes relacionados a doenças e de importância biotecnológica.
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Tipos de informações oriundas da genômica...
 
A nível de nucleotídeos: localização física das sequências de DNA, descobrir onde os genes se localizam.
 A nível protéico: identificar a função dos genes (análise de domínios funcionais, configurações espaciais e presença de padrões conservados em proteínas já bem caracterizadas).
 A nível de processo: identificação de vias metabólicas, onde os genes podem estar atuando.
Crescimento exponencial do número de sequencias contidas no GenBank de 1992 a 2002
As bases de dados em biologia molecular disponibilizam os dados produzidos em todo o mundo
Genômica e Bioinformática
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Genômica
Bioinformática
Análises em larga escala
Avanço da tecnologia
Databases
Estatística
Ciência da computação
Genomas
Moléculas biológicas
A genômica não pode existir sem a bioinformática...
Genômica significa grandes quantidades de dados.
Genômica e Bioinformática
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As informações são organizadas em bases de dados
nucleic acid sequence
protein sequence
protein structure
genomes
microarrays
others
Genômica e Bioinformática
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O que pensar??
Genômica fornece uma estrutura para a biologia. 
Inventário finito
Compilação das investigações detalhadas
Tem derrubado muitas suposições
Terá impacto direto
na sociedade
Remédios personalizados ( ↓ efeito colateral x ↑ eficiência).
Terapia gênica: substituição do gene defeituoso
Investigação criminal (sequência de DNA = impressão digital)
Decifrar mecanismos de vício (causas hereditárias)
Bioarqueologia: estudo da origem do homem 
Aconselhamento genético: prognóstico prévio de doenças, pré-natal
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