Precipitação Acetona-Etanol e Metanol-Clorofórmio

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Precipitação de Proteínas – Método Acetona/Etanol
· Adicionar 4 volumes de etanol icecold (-20°C) a um volume de amostra.
· Vortexar vigorosamente.
· Adicionar 4 volumes de acetona icecold (-20°C) à solução.
· Vortexar vigorosamente.
· Incubar a -20°C overnight.
· Centrifugar a 15.000 rpm a 4°C por 15 minutos.
· Remover o sobrenadante.
· Lavar o pellet 3 vezes usando solução 40% etanol/40% acetona/20% água (v/v) icecold (-20°C). Centrifugar novamente entre as lavagens.
· Deixar a acetona e o etanol residuais evaporarem.
Precipitação de Proteínas – Método Metanol/Clorofórmio
· Adicionar 4 volumes de metanol e vortexar vigorosamente por 30 s.
· Adicionar 1 volume de clorofórmio e vortexar vigorosamente por 30 s.
· Adicionar 3 volumes de água milli Q e vortexar vigorosamente por 30s.
· A turbidez deve-se ao fato de a água ser imiscível em clorofórmio.
· Centrifugar por 10 minutos a 14000 rpm.
· Após a centrifugação se observam duas camadas: a fração água/metanol acima e a fração clorofórmio abaixo.
· As proteínas estão flutuando na interface. Se você não estiver vendo as proteínas, você tem menos de 5 µg de amostra.
· Remover a fração superior com cuidado para não remover também as proteínas na interface.
· Se não estiver vendo as proteínas, deixar 5-10 µL da fração superior, por segurança.
· Adicionar 3 volumes de metanol.
· Se você der um peteleco no eppendorf deve ver o precipitado flutuando (caso seja visível).
· Misture bem com petelecos (não usar vórtex), tomando cuidado para não romper o precipitado.
· Centrifugar por 10 minutos a 14000 rpm.
· Remover o sobrenadante, deixando cerca de 10 µL de líquido.
· Repetir os dois passos anteriores.
· Deixar o solvente residual evaporar em fluxo laminar por cerca de 20 minutos.
· Quando tiver certeza de que o solvente todo evaporou, e ressuspenda as proteínas em um tampão adequado ao experimento seguinte.