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São Cristóvão 2015.2 Universidade Federal de Sergipe Centro de Ciências Exatas e Tecnologia Departamento de Química Disciplina: Química de Biomoléculas AMINOÁCIDOS, PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS Universidade Federal de Sergipe 2 SUMÁRIO 1. Introdução Teórica .............................................................................. 3 1.1. Objetivos ................................................................................. 6 2. Procedimento Experimental 2.1 Materiais, reagentes e vidrarias .................................................... 6 2.2 Procedimento ................................................................................ 7 2.2.1. Teste de Nindrina................................................................ 7 2.2.2. Teste do Biureto ................................................................. 7 2.2.3. Teste de Heller .................................................................... 8 2.2.4. Reação Xantoprotéica ......................................................... 8 2.2.5. Reações de Precipitação de Proteínas ................................. 9 2.2.6. Isolamento das Proteínas do Leite .................................... 10 2.2.7. Isolamento da Lactose do Leite ........................................ 11 3. Resultados e Discussões ................................................................... 12 3.1. Teste de Nindrina ...................................................................... 12 3.2. Teste do Biureto ........................................................................ 12 3.3. Teste de Heller ........................................................................... 13 3.4. Reação Xantoprotéica ................................................................ 13 3.5. Reações de Precipitação de Proteínas ........................................ 14 3.6. Isolamento das Proteínas do Leite .............................................. 14 3.7. Isolamento da Lactose do Leite .................................................. 14 4. Conclusão ......................................................................................... 15 5. Referências Consultadas ................................................................... 15 Universidade Federal de Sergipe 3 1. INTRODUÇÃO TEÓRICA As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células vivas e ocorrem em todas as células e em todas as partes destas. Também ocorrem em grande variedade e de diversos tipos, desde peptídeos com tamanho relativamente pequeno, até grandes polímeros com pesos moleculares muito elevados. As subunidades monoméricas com relativa simplicidade fornecem a chave para a estrutura para a estrutura de milhares de proteínas das mais diversas formas. Todas as proteínas, sejam elas das linhagens mais antigas de bactérias, sejam das formas mais complexas de vida, são construídas com o mesmo conjunto de 20 aminoácidos ligados covalentemente em sequencias lineares características. Em virtude de cada um desses aminoácidos ter uma cadeia lateral distintiva, a qual determina as suas propriedades químicas, esse grupo de 20 aminoácidos pode ser considerado como o alfabeto com o qual a linguagem da estrutura proteica é escrita. As proteínas possuem estruturas espaciais bem definidas que, segundo o nível de complexidade, podem ser caracterizadas como estruturas secundária, terciária e quaternária. A função biológica está associada à estrutura espacial, que, por sua vez, depende da estrutura primária (a simples disposição dos aminoácidos na cadeia polipeptídica). Certos agentes podem alterar a conformação espacial original das proteínas, sem que ocorra alteração da estrutura primária, modificando, desta forma, algumas de suas propriedades biológicas. Este efeito, chamado de desnaturação, pode ser produzido pelo aumento da temperatura do meio, alteração do pH ou pela adição de solventes orgânicos. A alteração da estrutura primária das proteínas (quebra das ligações peptídicas) ocorre por tratamento à quente (100oC) em presença de ácido ou base forte ou através de adição de enzimas proteolíticas. Determinados agentes podem ser usados na precipitação de proteínas, o que é útil na desproteinização de materiais biológicos, como o sangue: ânions de ácidos complexos (tricloroacético, tânico, fosfotúngstico) formam sais insolúveis onde a proteína funciona como cátion; metais pesados (cobre, zinco, prata, mercúrio) em meio alcalino formam precipitados onde a proteína atua como ânion. As proteínas são macromoléculas coloidais, possuem uma camada de solvatação ou hidratação. Ao seu redor interagem moléculas de água, que permitem a sua solubilidade. Diversas substâncias, entre elas os sais inorgânicos ((NH4)2SO4, Na2SO4 e outros) podem alterar a camada de solvatação de proteínas, aumentando (“salting-in”) ou diminuindo (“salting-out”.) a solubilidade. Os aminoácidos componentes de uma proteína podem ser genericamente caracterizados se, após sua hidrólise, efetuarmos a reação da ninhidrina. A ninhidrina (hidrato de tricetoidrindeno) reage com aminoácidos produzindo cor púrpura. É uma reação inespecífica quanto à identidade do aminoácido, sendo a reação dependente da presença de grupos amina livres. O aminoácido prolina, na verdade um iminoácido, ao reagir com a ninhidrina produz coloração amarela. Alguns testes são utilizados para identificação de aminoácidos e proteínas como, por exemplo, o teste da ninhidrina e o teste do biureto. Universidade Federal de Sergipe 4 A realização do teste da ninhidrina baseia-se no fato de que a reação da ninhidrina detecta a presença do grupo α-amino livre dos aminoácidos, do grupo amino terminal de peptídeos e proteínas e do grupo ε-amino da lisina. Ela segue o mecanismo de adição do nitrogênio nucleofílico à aldeídos e cetonas, onde é formada uma imina como pode ser visto na figura 1 logo abaixo. Figura 1: Mecanismo de Formação da imina. A prolina, sendo uma amina secundária, reage de maneira distinta, uma vez que forma uma enamina ao invés da formar a imina como pode ser visto na figura 2. Figura 02 - Mecanismo da formação da enamina. Após a formação da enamina ocorre, em seguida, uma descarboxilação devido à presença do grupo carboxilato ligado ao C-α, gerando uma nova imina, que hidrolisa formando um derivado da ninhidrina aminado. Esse derivado da ninhidrina adiciona à outra molécula de ninhidrina formando como produto uma imina de coloração violeta como pode ser visualizado no mecanismo abaixo. Universidade Federal de Sergipe 5 Figura 03 - Mecanismo da reação da ninhidrina A coloração violeta do produto formado é proporcional à concentração. Iminoácidos prolina e 4-hidroxiprolina formam produtos amarelos, uma vez que a enamina é amarela e não sofre a reação com outra molécula de ninhidrina. Devido às ligações peptídicas e à presença de diferentes aminoácidos, as proteínas reagem com uma variedade de reagentes, formando produtos coloridos. A reação do Biureto é devida às ligações peptídicas, dando positiva para proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação é também positiva para as substâncias que contém 2 grupos carbamínicos (-CO-NH2) ligados diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio. Este é o caso do Biureto que dá reação positiva e de onde provém o nome da mesma. As proteínas ou peptídeos, quando tratados por uma solução de sulfato de cobre, em meio alcalino formam o complexovisto abaixo com uma coloração violeta característica. Figura 04 - Complexo formado entre o cobre II e peptídeos ou proteínas. Universidade Federal de Sergipe 6 1.1. Objetivos ✓ Identificar aminoácidos e proteínas; ✓ Diferenciar aminoácidos de peptídeos e proteínas; ✓ Verificar as propriedades das proteínas; ✓ Extrair as proteínas do leite. 2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 2.1. Materiais, Reagentes e Vidrarias ✓ Água Destilada ✓ Ácido Acético 10% ✓ Ácido Nítrico Concentrado ✓ Ácido Tricloroacético 10% ✓ Clara de Ovo ✓ Etanol ✓ Reativo de Biureto ✓ Solução de Acetato de Chumbo 5% ✓ Solução de Nindrina ✓ Solução saturada de (NH4)2SO4 ✓ Solução de Glicina ✓ Solução de Aspartato ✓ Solução de NaOH 2,5 mol/L ✓ Tubos de Ensaio ✓ Béquer de 250 mL ✓ Béquer de 100 mL ✓ Centrífuga ✓ Espátula ✓ Pipeta de Pasteur Universidade Federal de Sergipe 7 2.2. Procedimento 2.2.1. Teste da Nindrina *A solução de albumina 10% (v/v), foi preparada dissolvendo-se 10 mL de clara de ovo em tampão fosfato 0,01 mol/L, avolumando com o tampão para 100 mL de solução. 2.2.2. Teste do Biureto Universidade Federal de Sergipe 8 2.2.3. Teste de Heller 2.2.4. Reação Xantoprotéica Universidade Federal de Sergipe 9 2.2.5. Reações de precipitação de proteínas Universidade Federal de Sergipe 10 2.2.6. Isolamento das proteínas dos leite Universidade Federal de Sergipe 11 2.2.7. Isolamento da lactose do leite 2.2.8. Caracterização do Amido (Teste do Lugol) Universidade Federal de Sergipe 12 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 3.1. Teste da Ninhidrina A reação da ninhidrina detecta a presença do grupo α-amino livre dos aminoácidos, do grupo amino terminal de peptídeos e proteínas pelo aparecimento de coloração violeta, cuja intensidade é proporcional a coloração. Quanto realizado o teste de ninhidrina nas amostras de Glicina e aspartato (aminoácidos) e na amostra de albumina (proteína) todas mudaram a sua coloração para violeta, dando então teste positivo. A diferença nas reações dessas amostras com a ninhidrina se deu no tempo de reação, em que a glicina reagiu mais rapidamente, pois não apresenta cadeia lateral, o que reduz o impedimento estérico. O aspartato reage em seguida e por último a albumina. Aspartato Figura 5: Imagens do teste da ninhidrina. 3.2. Teste do Biureto Ao realizar o teste de Biureto nas amostras de água, glicina e albumina, observou- se que as amostras de água e glicina apresentaram coloração azul clara e a amostra de albumina apresentou coloração violeta. A solução de Biureto, já apresenta coloração azul clara, sendo assim, água serviu apenas como um branco para demonstrar essa característica. A partir desse fato, pode-se confirmar que a amostra de glicina não sofreu reação ao contrário da amostra de albumina. Como o teste do Biureto é um teste geral para proteínas e peptídeos com mais de dois aminoácidos, e consiste na formação de um, complexo de Cu+2 de coloração violeta, deu teste positivo para a albumina, que é uma proteína, e negativo para a glicina que é um aminoácido. Figura 6: Imagens do teste do biureto. Albumina Glicina Aspartato Albumina H2O/dest. Glicina Universidade Federal de Sergipe 13 3.3. Teste de Heller Ao realizar o teste de Heller na amostra de albumina observou-se a formação de duas fases: a superior um anel branco e a inferior solução amarela. O fato ocorrido demonstra a desnaturação da proteína promovida pela acidez do meio. O meio ácido quebra as ligações eletrostáticas entre os íons positivos e negativos de aminoácidos pela protonação dos íons carboxilato, desorganizando a estrutura da proteína e expondo dessa maneira os grupos hidrofóbicos, tornando a proteína Insolúvel. Figura 7: Teste de Heller na amostra de albumina. 3.4. Reação Xantoprotéica Ao acidificar a solução de albumina, assim como ocorreu no teste de Heller, observou-se a desnaturação da proteína. Quando submetida ao aquecimento o sistema tornou-se amarelo. Com a adição de NaOH observou-se a formação de duas fases: A superior de coloração alaranjado e a inferior com coloração amarela. Como o teste de Heller identifica a presença de aminoácidos de cadeia lateral aromática (Phe, Tyr e Trp), o aquecimento da proteína desnaturada promove nitração e a hidrólise desses aminoácidos de cadeia lateral, formando um produto amarelo (nitrocomposto). A adição de base transforma os nitrocompostos em sais, sendo estes de coloração laranja como pode ser visto na imagem abaixo. Figura 8: Reação Xantoproteica Universidade Federal de Sergipe 14 3.5. Reação de precipitação de proteínas A solubilidade de uma proteína depende da distribuição dos grupos apolares (hidrofóbicos) e polares (hidrofílicos). Para a proteína ser solúvel em água os grupos hidrofóbicos devem estar no interior da molécula onde interagem entre si, e os grupos hidrofílicos expostos onde interagem com as moléculas de água. Quando amostras de albumina foram submetidas às respectivas situações: Aquecimento, adição de ácido tricloroacético 10%, adição de acetato de chumbo 5%, adição de etanol e adição de solução saturada de (NH4)2SO4, observou-se a formação de um anel branco demonstrando a desnaturação da proteína (insolúvel). Todas essas situações, a qual a amostra de albumina foi submetida, promoveu a alteração na estrutura da proteína, expondo os grupos hidrofóbicos, tornando-a insolúvel (desnaturação). Todos os sistemas em que a albumina se encontra foram submetidas, foi a adicionado água e somente no sistema albumina + solução saturada de (NH4)2SO4, foi observada a solubilização da proteína. Nesse caso ocorreu o efeito o efeito “salting-out” e adição de mais água dilui o sal revertendo a desnaturação no efeito “saltin-in”. 3.6. Isolamento das proteínas do leite Existem no leite três tipos de proteínas: as caseínas, as lactoalbuminas e as lactoglobulinas. Ao adicionar ácido acético no leite aquecido à temperatura de 40°C, observou-se a formação de coágulos, que é a precipitação do caseinato de cálcio (caseína), sendo separada. No soro obtido após a separação da caseína, foi adicionado carbonato de cálcio e submetido à aquecimento numa temperatura de 75°C e observou-se a formação de outro precipitado. Esse precipitado é a lactoalbumina que é sensível ao calor precipitando, portanto, em 75°C. Ao soro que foi separado do precipitado da lactoalbumina, foi adicionado etanol e submetido a aquecimento até 60°C. Nesse processo verificou-se a formação de mais um precipitado, sendo este a lactoglobulina, que é desnaturada pelo etanol e é insolúvel tanto quente quanto fria, porém o fato da lactose ser insolúvel a frio, a lactoglobulina foi separada ainda quente e o soro restante foi deixado em repouso para resfriar durante uma semana. 3.7. Isolamento da Lactosedo Leite Uma pequena quantidade do soro do procedimento anterior (3.6) foi submetido ao teste de Molish e Benedcti, dando teste positivo. O soro sobrenadante foi deixado em repouso durante uma semana e decorrido esse tempo, observou-se a formação de cristais no fundo do recipiente que continha o soro, esse precipitado é a lactose. Figura 9 :Teste Molish e Benedict na amostra de soro 4. CONCLUSÃO Universidade Federal de Sergipe 15 Foram realizados vários testes qualitativos para identificação e diferenciação de aminoácidos e proteínas, bem como verificou-se as propriedades das proteinas e fez-se a extração das proteínas do leite. Os resultados obtidos foram satisfatórios uma vez que o teste da ninhidrina mostrou-se ser um bom método para identificação de aminoácidos, assim como o teste do biureto para identificação de proteínas e peptídeos com mais de dois aminoácidos. O teste de Heller mostrou-se eficiente na identificação da albumina por meio da desnaturação dessa proteína em meio ácido da mesma forma que a reação Xantoprotéica após aquecimento. REFERÊNCIAS CONSULATADAS 1 - LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica, 4ª. Edição, Editora Sarvier, 2006, capítulo 7. 2 - BRUICE, P. Y. Química Orgânica. 4ª. Ed. Pearson Prentice Hall, São Paulo – SP, 2006. Vol. 2.
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