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MANUAL PARA EXAME ANDROLÓGICO E AVALIAÇÃO DE SÊMEN ANIMAL CAPÍTULO 1 1. INTRODUÇÃO AO EXAME ANDROLÓGICO Fundamentos: A avaliação da aptidão reprodutiva de um macho destinado à reprodução fundamenta-se na observação da saúde geral, saúde genética e saúde do sistema genital, ou seja, na avaliação da potentia coeundi e potentia generandi. Indicações: Seleção e comercialização de reprodutores; avaliação do potencial reprodutivo pré e durante a estação de monta; diagnóstico de problemas de fertilidade; ocorrência da puberdade; preservação do sêmen in vitro; etc. Identificação: Informações sobre o proprietário/ propriedade (nome, endereço, e-mail) e o animal (espécie, raça, nome, tatuagem, número de registro, data de nascimento, filiação). A inclusão de sinais externos que identifiquem o reprodutor, inclusive fotografia, é recomendável. Anamnese ou história clínica: Dirigida de acordo com o motivo do exame e registrada no laudo. Deve contemplar dados relativos ao indivíduo, aos contemporâneos do rebanho, ao estabelecimento e ao manejo a que está submetido o animal na propriedade. Poderão ser questionados, entre outros: data da constatação das alterações; evolução do processo em curso; tratamentos executados e resposta clínica; situações sanitária e reprodutiva do rebanho ou grupo de animais; regime de atividade sexual (monta natural/ doador de sêmen); regime recente de ejaculação; índice de retorno ao cio; índice de prenhez; condições de manejo e alimentação; data e cláusulas contratuais da aquisição e procedência do reprodutor ou de sua comercialização. Exame clínico geral: Inspeção, em estação e em movimento, com avaliação preliminar do sistema nervoso, respiratório, circulatório, digestivo e locomotor, com verificação da condição dos aprumos, das articulações e dos cascos, assim como da condição corporal (determinar escore de 1 a 5)*. Caso haja suspeita de alteração num dos sistemas, o exame clínico deverá ser aprofundado, utilizando-se outros procedimentos semiológicos mais específicos. Atenção especial deve ser dada à existência de defeitos genéticos como, por exemplo, prognatismo, microagnatismo, paresia espástica, determinadas hérnias e outros. *Pode ainda ser utilizado índice de massa corporal (IMC) que leva em conta as aferições da altura da cernelha (A), do comprimento esterno isquiático (CEI) em cm e do peso em kg. O IMC é calculado pela seguinte fórmula: Exame especial dos órgãos reprodutivos: Utilizam-se a inspeção e a palpação, podendo ser complementado com o exame ultrassonográfico que é uma ferramenta que auxilia no diagnóstico e no prognóstico da afecção do reprodutor. Verificam-se no(s) órgão(s) a sua presença ou ausência, dimensões, consistência, simetria, mobilidade (quando aplicável) e sensibilidade de cada segmento, avaliando-se a compatibilidade dos achados com o que é esperado para a espécie em foco, com o desenvolvimento corporal e com a idade, registrando-se quaisquer alterações encontradas. Escroto: O escroto e estruturas adjacentes, como túnicas e espaços entre túnicas, devem ser examinados com o animal em estação, na maioria das espécies. Devem ser consideradas, inicialmente, as condições da pele quanto à existência de lesões, maleabilidade, sensibilidade, espessura, temperatura e aderências. Qualquer alteração de forma, consistência e tamanho deve ser registrada. Testículos: Para avaliação adequada os testículos deverão ser fixados, um ao lado do outro, levemente tracionados, procurando deixar o escroto distendido. Devem ser consideradas as seguintes características: • Presença: o reprodutor deve apresentar ambos os testículos no escroto (exceto as aves, entre outras); • Forma: oval, alongada, de acordo com a espécie; • Simetria: devem ser simétricos quanto ao tamanho e a forma. Quando assimétricos, a biometria deve ser realizada e registrada. Sugere-se que a diferença no volume não deve ser maior que 10%; • Consistência: deve ser fibroelástica, com variações entre espécies caracterizando adequadamente as alterações flácidas a firmes. Alterações de consistência em áreas delimitadas do testículo devem ser registradas; • Mobilidade: quando deslocados por toque digital os testículos devem apresentar mobilidade dentro do escroto em todas as direções; • Sensibilidade: o reprodutor não deve apresentar sinais de dor ao toque ou à ligeira pressão sobre os testículos. A interpretação desse exame deve ser cuidadosa, pois é necessário diferenciar a sensibilidade dolorosa da simples reação do animal; • Temperatura: importante lembrar que, em condições fisiológicas, a Tº intratesticular é de 2 a 4ºC inferior a corporal (exceto aves, entre outras); • Posição: característica intrínseca de cada espécie. A posição dos testículos pode ser alterada pela existência de pregas escrotais ou encurtamentos dos cordões espermáticos. As rotações dos testículos podem ser simplesmente anatômicas quando são definidas como ectopias, sem maiores consequências clínicas. Transtornos no posicionamento (anterior ou posterior) devem ser considerados e objetos de investigação semiológica em decorrência da possibilidade de serem transtornos da diferenciação sexual (o quadro seminal sempre deve ser averiguado nestes casos). • Tamanho e biometria testiculares: a aferição do tamanho testicular pode ser considerada sob dois aspectos: diagnóstico de alterações e seleção de indivíduos de maior volume testicular. São aferidos o perímetro ou largura escrotal (dependendo da espécie). A largura é aferida na região mediana no ponto de maior diâmetro dos testículos. Medidas adicionais de comprimento (excluído o epidídimo), largura e espessura (altura) dos testículos podem complementar o laudo. Estas medidas podem ser realizadas com fita métrica ou com auxílio de paquímetro; a precisão de algumas medidas pode ser maior se for realizada por meio de US. O tamanho testicular pode ser afetado pela idade, raça, sistema de criação, peso corporal, processos inflamatórios, subnutrição, anormalidades de desenvolvimento adquiridos ou congênitos – hereditários ou não, entre outros. Importante lembrar que, nas espécies que sofrem influência estacional, o tamanho dos testículos pode variar conforme o fotoperíodo. O perímetro escrotal é uma das características reprodutivas de maior herdabilidade. Epidídimos: constituídos de cabeça, corpo e cauda, estão ligados aos testículos pelo mesoepidídimo e pelo ligamento testicular próprio. De modo de geral as características a serem avaliadas nos epidídimos são as mesmas descritas para o exame testicular, resguardando os aspectos forma, tamanho e posição, característicos de cada espécie. Aumentos de volume do epidídimo, mudanças de consistência e simetria de cauda devem ser registrados. As cabeças dos epidídimos estão justapostas ao polo da gônada localizado próximo à inserção do funículo espermático, enquanto os corpos epididimários se estendem medialmente aos testículos e são de difícil palpação em virtude de sua pequena espessura. A cauda, localizada no polo oposto à cabeça do epidídimo, apresenta mobilidade variável. Cordões espermáticos: o acesso aos cordões espermáticos é variável entre as espécies. Os cordões devem ser avaliados quanto a aumentos de volume, sensibilidade, torções, com especial atenção à integridade do plexo pampiniforme. Um aumento de volume nos cordões espermáticos pode indicar a existência de cistos, varicocele, hérnias ou processos inflamatórios. Um encurtamento afeta a posição testicular, assim como a incapacidade de retração e pode prejudicar a termorregulação testicular. Deve-se considerar a adequação do grau de distensão dos cordões espermáticos com a condição climática no momento do exame. Glândulas sexuais acessórias: tamanho e forma diferentes dependendo da espécie, bem como algumas podem estar ausentes. • Ampolas: são simétricas, comconsistência tensoelástica e superfície lisa; • Glândulas vesiculares: apresentam no adulto tamanho variável - consistência mais flácida e tamanho menor nos jovens e mais firmes e maiores nos adultos. Geralmente são simétricas; qualquer assimetria deve ser considerada como achado clínco; • Próstata: apresenta uma porção determinada corpo e outra disseminada ao longo da região pélvica, exceto no cão que a possui bem proeminente. Apenas o corpo é palpável. Alterações clínicas são raras, com exceção na espécie canina; • Glândulas bulbouretrais: quando presentes localizam-se justapostas à porção mais caudal da uretra pélvica, podendo estar ausentes e ter tamanho variável entre espécies. Nem sempre são palpáveis via retal. *Fração gel: equino – vesícula seminal/ glând. vesicular | suíno – glând. bulbouretral. Pênis: deve-se considerar a avaliação clínica do pênis em repouso (retraído) e exposto (após excitação sexual). Verificam-se compatibilidade de tamanho, mobilidade, mucosa, secreções e eventual presença de anormalidades. Prepúcio: considera-se a situação da pele, da mucosa e do tecido subcutâneo quanto a aumentos de volume, temperatura, existência de ferimentos ou cicatrizes. O óstio prepucial deverá permitir a passagem livre do pênis. O tamanho e o formato apresentam características variáveis conforme a espécie. Comportamento sexual: demanda bom conhecimento dos sinais expressos por cada espécie; é um recurso que deve ser utilizado pelo médico veterinário para verificar dificuldade ou incapacidade do animal de realizar a cópula, sem ou com evidências clínicas. Tal comportamento é influenciado por inúmeros fatores, tais como endócrinos, sociais, genéticos, estacionalidade, raça e idade dos animais. Uma avaliação preliminar pode ser feita por ocasião da coleta de sêmen com a vagina artificial. As avaliações da libido realizadas apenas durante as coletas de sêmen ou durante um número restrito de cópulas deve ser considerado com ressalva, pois podem não representar o verdadeiro potencial do reprodutor, principalmente após um período de descanso sexual ou uso excessivo. Fazem parte do cortejo sexual, na maioria das espécies, os seguintes comportamentos: demonstrar interesse ou atenção pela fêmea; aproximar-se frontalmente e fazer abordagem; cheirar diversas regiões do corpo; realizar o reflexo de flehmen e algumas tentativas de monta sem ereção. É importante ressaltar que existem particularidades no cortejo sexual nas diferentes espécies. Coleta e avaliação seminal: os métodos de coleta de sêmen utilizados são: vagina artificial, eletroejaculação, massagem retal das glândulas vesiculares e ampolas dos condutos deferentes, coleta no fundo de saco vaginal e, ainda, mão enluvada* e massagem abdominal; a escolha do método depende da espécie e das circunstâncias de cada avaliação. O método de eleição para a maioria das espécies é o da vagina artificial, em animais previamente condicionados; a coleta pode ser realizada em manequim artificial ou fêmea no cio. *ppt em cães. Características do ejaculado Volume: é expresso em mililitros (mL) e depende do método de coleta de sêmen, do regime de serviços, do tempo de excitação, entre outros; Cor: variável de acordo com a espécie, podendo ser branco, marfim, acinzentado ou amarelo citrino. Pode apresentar variações conforme a presença de sangue, pus, urina, células epiteliais, sujidades, entre outras; Odor: sui generes (semelhante à quiboa); Aspecto/ aparência: depende fundamentalmente da concentração de espermatozoides e poderá ser classificada em cremosa (requeijão cremoso), leitosa (leite), serosa (água de coco) ou aquosa (água); Turbilhonamento/ movimento de massa: é o movimento em forma de ondas observado em uma gota de sêmen puro. A intensidade do movimento é resultante da motilidade, do vigor e da concentração espermática. A avaliação do turbilhonamento é realizada colocando-se uma gota de sêmen sobre uma lâmina previamente aquecida a 37ºC. O movimento é observado em microscópio óptico ou de contraste de fase utilizando-se a objetiva de 10x (o que, com ocular de 10x, resultará em 100x). A interpretação é subjetiva e é expressa usando-se uma classificação de 0 (ausência de turbilhonamento) a 5 (valor máximo dado a um acentuado movimento de massa). Quando o ejaculado se encontra dentro dos limites fisiológicos, o turbilhonamento é observado somente nas espécies que apresentam maior concentração espermática, por exemplo, nos ruminantes (sêmen fresco). É afetado por fatores intrínsecos, como método de coleta, condições de preservação e temperatura da amostra. Motilidade: representa o número de espermatozoides móveis, expressa em porcentagem. E uma avaliação subjetiva. Avaliações objetivas podem ser efetuadas por meio de análises computadorizadas. O exame é realizado em microscópio óptico de campo claro ou microscópio de contraste de fase, utilizando-se objetiva de 20 ou 40x (o que, com ocular de 10x, resultará em 200 ou 400x), sendo usada uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula previamente aquecidas e mantidas a 37ºC. Devem-se observar as particularidades de cada espécie, por exemplo, nas aves, a avaliação deve ser realizada em temperatura ambiente. Nas espécies em que a concentração espermática é elevada, recomenda-se diluir o sêmen com extensores previamente aquecidos. Vigor: representa a intensidade do movimento espermático. É classificado de 1 a 5, sendo: • Escore 1 = exclusivamente oscilatório; • Escore 2 = lento; • Escore 3 = intermediário; • Escore 4 = progressivo retilíneo rápido; • Escore 5 = progressivo retilíneo e muito rápido. Concentração: representa o número de espermatozoides por mililitro (mm³) ou centímetro cúbico (cm³ = mL). O procedimento mais comum para se obter a concentração espermática consiste na contagem das células na câmara de Neubauer; pode-se utilizar ainda a espectrofotometria ou métodos computadorizados. Deverá constar no laudo o número total de espermatozoides por ejaculado, que é a resultante da concentração multiplicada pelo volume. A concentração sofre variações devido a fatores extrínsecos, como o método da coleta, a frequência da atividade sexual do reprodutor, o condicionamento e a fatores intrínsecos, como a idade, o tamanho e o estado de higidez testicular. Para a contagem na câmara de Neubauer o sêmen poderá ser diluído em solução de formal-salina, citrato de sódio formolado ou água destilada. A diluição utilizada depende da concentração dos espermatozoides no ejaculado. Pode variar entre espécies e ejaculados dentro da mesma espécie. Deverá ser tal que, na contagem em câmara de Neubauer, o número de espermatozoides em cada retículo não seja excessivo ou diluído demais, dificultando a sua contagem e aumentando a margem de erro. É necessária a perfeita homogeneização da amostra diluída antes de colher a alíquota. Preenche-se a câmara de Neubauer, após a montagem com a lamínula específica (hiperplana), depositando o líquido sob a lamínula até completar toda a superfície de um lado. Outra alíquota deve ser usada no lado oposto da câmara. Esta câmara deve permanecer em repouso horizontal (5 minutos) para que as células se sedimentem no fundo dela. Para a contagem utiliza-se um microscópio ou de contraste de fase com objetiva de 40, 100 ou 200x. os espermatozoides devem ser contados em cinco quadrados grandes, cada um composto de 16 pequenos quadrados, em cada lado da câmara, totalizando 10 quadrados grandes. Uma diferença na contagem acima de 10% entre os dois retículos pode ser indicativa de preenchimento ou homogeneização inadequada. Caso o número de espermatozoides por quadrado seja muito baixo é indicado contar todos os quadrados de cada retículo e calcular a média para 10 quadrados. O valor encontrado expressará a concentração por mm³. Para obter a concentração por mL o resultadoobtido por mm³ deverá ser multiplicado por 1000. Características morfofisiológicas dos espermatozoides Poderão ser utilizados esfregaços corados em microscópio óptico ou preparação úmida, em microscópio de contraste de fase ou de interferência diferencial, associados ou não. O método de preparação úmida usando microscopia de interferência diferencial ou contraste de fase, pela ordem, é mais indicado que esfregaços corados por técnicas convencionais. Também pode-se utilizar métodos de coloração específicos para determinadas partes do espermatozoide, por exemplo: acrossoma (coloração de Karras, entre outras) e as sondas fluorescentes, quando indicadas como método complementar de avaliação, desde que sejam reconhecidas cientificamente. Deverá(ão) ser referenciada(s) no laudo a(s) técnica(s) utilizada(s) para avaliação da morfologia espermática. ▪ Esfregaços corados Após a coleta do sêmen preparam-se dois ou três esfregaços bem delgados em lâminas limpas e previamente aquecidas a 37ºC. A gota de sêmen pode ser associada (ex. eosina-nigrosina) ou não ao corante. A metodologia para preparação do esfregaço é visualizada na imagem. O esfregaço deve ser imediatamente examinado ao microscópio (400x) para avaliar a distribuição das células na lâmina e deve ser identificado. Quando corado no laboratório podem ser utilizados diversos corantes. A lâmina corada é analisada sob imersão a um aumento de 1000x em microscópio óptico. Deverão ser contadas, no mínimo, 200 células e anotados os defeitos de forma e estrutura. ▪ Preparação úmida Serão depositadas tantas gotas de sêmen quantas necessárias até obtenção de um aspecto leitoso em um frasco contendo solução de formol-salina tamponada (1 mL), previamente aquecido à temperatura de 37ºC. É aconselhável a preservação da amostra a 5ºC e ressuspensão periódica das células mediante agitação até o exame, minimizando, assim, a ocorrência de aglutinação espermática. A preparação úmida consiste na colocação de uma alíquota de sêmen diluído sobre lâmina cobrindo-a com uma lamínula. O excesso de líquido deverá ser retirado aplicando-se pressão suave sobre a lamínula recoberta com papel-filtro. A lâmina deve ser levada a um microscópio de contraste ou interferência diferencial de fase, com objetiva de 100x (o que, com a ocular 10x, resultará em 1000x), sob óleo de imersão. A morfologia espermática é avaliada em, pelo menos, 200 células, analisando-se os defeitos de forma e estrutura. As anormalidades da morfologia espermática podem ser classificadas em defeitos maiores ou menores, primárias ou secundárias ou, ainda, considerando-se o segmento espermático afetado (cabeça, peça intermediária e peça principal). Exames complementares: utilizados a critério do técnico responsável. Dependendo da finalidade do exame andrológico poderá ser necessária a realização de exames microbiológicos do sêmen ou uretra, conforme a espécie. Diagnóstico e conclusão: ao final dos exames e da análise dos resultados obtidos é necessário que se elabore um diagnóstico e o laudo deve ser conclusivo, refletindo o parecer técnico do médico veterinário sobre a condição reprodutiva naquele momento. Os reprodutores podem ser classificados em aptos, questionáveis ou inaptos para a reprodução. É importante lembrar que a classificação de um reprodutor nem sempre é permanente. Os reprodutores serão classificados como inaptos quando um ou mais exames caracterizarem condição indesejável irreversível. Os demais casos que não apresentarem as condições desejáveis do sistema genital, do comportamento sexual, da qualidade seminal e/ou da capacidade de executar a monta serão incluídos na categoria questionáveis; esta condição pode ser temporária ou permanente e deverá ser confirmada por meio de exames adicionais. Cabe mencionar que, para a maioria das espécies domésticas, a duração da espermatogênese mais o trânsito pelo epidídimo são de, aproximadamente, 60 dias. Este intervalo deve ser considerado para reavaliação do reprodutor até emissão de laudo conclusivo. Verificada a estabilidade do quadro, o reprodutor classificado como questionável poderá ser reclassificado como inapto. Quanto ao reprodutor classificado como inapto, deverá ser recomendado seu afastamento da reprodução. O nível de exigência para fins de utilização de um reprodutor poderá diferir dependendo da finalidade para a qual ele será utilizado, por exemplo, doador de sêmen para comercialização ou monta natural. Validade do exame andrológico: dentro de padrões fisiológicos, os achados do exame andrológico expressam o potencial o potencial reprodutivo, ao término do exame. Qualquer prazo de validade estipulado será mera especulação sem fundamentação científica. Cabe a cada técnico ou instituição que requer laudo de avaliação andrológica estipular a validade do documento. Algumas exposições e feiras de comercialização de reprodutores têm aceitado o prazo de 60 dias. Parâmetros de avaliação andrológica por espécie e padrões para julgamento de sêmen de doadores: os padrões andrológicos são características intrínsecas de cada espécie. Diversos são os fatores que podem alterar cada parâmetro, sem, contudo, indicar alteração do quadro de higidez do ponto de vista do potencial reprodutivo. Caberá ao técnico a correta interpretação dos resultados para chegar a um diagnóstico e prognóstico correto. Para efeito de comercialização de sêmen deverão ser seguidas as normas publicadas pelo MAPA.
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