Relatório - FERMENTO

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CRESCIMENTO DE MICRO-ORGANISMOS EM FERMENTO NATURAL
GEORG, A. S.; LESSA, I. L. B.; GOEDERT, J.; FLECK, M. E. K.
Unisul, Santa Catarina, 2021. 
Resumo
O fermento natural tem sido utilizado a muito anos, e proporciona boa qualidade no sabor e conservação dos produtos obtidos a partir dele. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi produzir um fermento natural e avaliar o crescimento e presença de micro-organismos no mesmo. Para a produção do fermento utilizou-se farinha de trigo e água filtrada, que foram inseridos em um pote de vidro diariamente, durante 5 dias. A partir disso, notou-se o crescimento da massa e a formação de bolhas, o que indica a fermentação da glicose, que forma etanol e gás carbônico. Já para a verificação do crescimento de micro-organismos, utilizou-se o método de placas de Petri, onde a amostra foi adicionada imersa em meio de cultura ágar MRS e PCA, e sob superfície de MRS e PCA solidificados, ambos foram deixados em estufa a 34 ºC por 72 h e 48 h, respectivamente. Feito isso, analisou-se as placas para verificação de bactérias e leveduras. Com isso, observou-se que houve o crescimento de lactobacilos e leveduras. Concluindo-se que é possível produzir um fermento natural e obter o crescimento de micro-organismos, assim sugerindo que a fermentação natural é uma técnica promissora a ser utilizada. 
Palavras-chave: crescimento, micro-organismos, fermento.
1. INTRODUÇÃO
O fermento natural tem sido utilizado há mais de 5.000 anos, e caracteriza-se como uma mistura de farinha de cereais composta por uma população heterogênea de bactérias láticas e leveduras, desenvolvida por fermentação espontânea ou iniciada através da adição de cultura starter (micro-organismos concentrados). Ou seja, qualquer massa de farinha após um tempo prolongado começará a fermentar e mudar suas características (TIRLONI, 2017; BIANCHINI, 2004).
O uso do fermento natural proporciona boa qualidade em sabor e conservação dos produtos obtidos. Por isso, essa técnica tem sido otimizada, e hoje sabe-se que, durante o processo, as leveduras e bactérias presentes produzem componentes que são responsáveis pelas características específicas de produtos feitos por fermentação natural como, por exemplo, formação de ácidos láticos e acético, e aromas específicos (BIANCHINI, 2004). 
Estudos mostram que o início da fermentação é dominado pelo desenvolvimento das leveduras que liberam gás carbônico, etanol e alguns aromas típicos. Em seguida, o gás carbônico liberado na massa gera uma solução saturada de ácido carbônico. Após isto, domina-se as atividades das bactérias láticas, micro-organismos que transformam glicose em ácido lático, ácido acético e aromas típicos. Por fim, os ácidos produzidos pelos lactobacilos diminuem o crescimento das leveduras (BIANCHINI, 2004). 
A microbiota presente na fermentação é complexa e variada, com a identificação de mais de 50 espécies de bactérias láticas, principalmente da Lactobacillus, e mais de 20 espécies de leveduras, Saccharomyces e Candida. A microbiota necessita de nutrientes e depende de fatores endógenos e exógenos. Fatores endógenos são determinados pela composição química e microbiológica do meio, e os fatores exógenos são determinados pela temperatura, pH e pressão osmótica. No geral, os principais efeitos são exercidos pela atividade de água, quantidade e composição do starter, número de etapas de propagação e tempo de fermentação (TIRLONI, 2017; APLEVICZ, 2013). 
Bactérias láticas (BAL) têm uma antiga história de uso em fermentações de cereais, principalmente em produtos de panificação. E são caracterizadas como organismos de biopreservação capazes de produzir diferentes tipos de moléculas bioativas, como ácidos orgânicos, ácidos graxos, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas. As BAL são gram-positivas, e quase sempre apresentam catalase negativa, acumulando ácido lático no ambiente em que crescem, como produto do metabolismo primário (APLEVICZ, 2013).
As leveduras são micro-organismos capazes de crescimento aeróbio ou anaeróbio facultativo, podendo utilizar o oxigênio ou um componente orgânico como aceptor de elétrons, o que os torna capazes de sobreviver em diferentes condições ambientais. Na ausência de oxigênio as leveduras fermentam os carboidratos e produzem etanol e dióxido de carbono. Assim com qualquer forma de vida, as leveduras necessitam de fatores físicos e químicos indispensáveis para o seu crescimento e reprodução, dentre eles a água, fontes de carbono, nitrogênio e minerais (APLEVICZ, 2013). 
Uma população microbiana em crescimento ativo, em um meio nutritivo, constitui uma cultura. Após o período de crescimento, os micro-organismos acumulam-se em colônias. As colônias são formadas a partir de uma única célula ou agregados de células microbianas e revelam a população microbiana viável do inóculo (ALVES, 2006). 
Existem diversas técnicas para realizar a quantificação do crescimento de micro-organismos. A contagem em placas de Petri com meios de cultura é um dos métodos mais utilizados em laboratórios, e ajuda a determinar o tamanho de uma população de bactérias. Este método é empregado para obter colônias isoladas pela mistura do inóculo com ágar liquefeito resfriado e distribuído em uma placa de Petri estéril. O meio nutritivo é mantido sob aquecimento para impedir a solidificação do ágar e é vertido sobre a amostra, seguido por um período de agitação. Ou também, esta metodologia permite o crescimento das colônias na superfície da placa de ágar nutriente solidificado, onde o inóculo é espalhado uniformemente na superfície do meio com o auxílio de um bastão especial (ALVES, 2006). 
Com base nisto, o objetivo deste estudo foi produzir um fermento natural e verificar a presença de micro-organismos presentes no mesmo, através do método de placas Petri em meios de cultura ágar MRS e PCA.
2. MÉTODO
2.1. Preparo do fermento natural
Para a preparação do fermento natural foi utilizado um pote de vidro com tampa, dentro do mesmo foi adicionado duas colheres rasas de farinha de trigo e uma colher de água filtrada, em seguida foi levemente misturado até que se formou uma mistura homogênea. No segundo dia, adicionou-se mais duas colheres de farinha de trigo e uma colher de água filtrada. Foi repedido esse processo durante mais três dias. Depois do quinto dia o fermento já estava pronto para ser utilizado. O fermento para estar pronto deve ter aumentado seu volume e possuir bolhas.
2.2. Crescimento de bactérias em meio de cultivo
Para o preparo da amostra, pesou-se aproximadamente 1 g da amostra e inseriu-se em 9 mL de água peptonada 0,1%, e assim foi homogeneizado por aproximadamente dois minutos em equipamento agitador de tubo de ensaio. Para o plaqueamento em profundidade foi semeado 1 mL da amostra, adicionou-se em uma placa de Petri o meio MRS e em outra o meio PCA e homogeneizou-se por aproximadamente um minuto. Feito isso, esperou solidificar e foi incubado a 35 ºC por 72 horas. Repetiu-se todo o procedimento com uma segunda amostra. Para o plaqueamento em superfície, foi semeado 0,1 mL da amostra nas placas de Petri contendo os meios PCA e MRS solidificados e espalhou-se bem com a alça de Drigalski. As placas foram colocadas em estufa a 35 ºC por 48 h. Para finalizar, foi feito a análise das placas para verificar a presença das bactérias. 
2.3. Materiais e equipamentos 
O Lactobacillus MRS Ágar (constituído por sulfato de magnésio, sulfato de manganês, fosfato dipotássico e ágar, com pH 6,5 ± 0,2), o Ágar Bacteriológico PCA e a água peptonada 0,1%, foram adquiridos das empresas Himedia, Oxoid e ACS, respectivamente. Os equipamentos utilizados para a realização do experimento (estufa incubadora, placas de Petri estéreis, tubos de ensaio, pipetas automáticas e ponteiras [100 e 1000 L], e outros materiais) estão localizados no Laboratório da Ambiental na Universidade do Sul de Santa Catarina (UNISUL) campus Pedra Branca. 
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O levain é uma massa fermentada por uma rica microbiota e o seu processo de fermentação é demonstradoa seguir na Imagem 1, onde nas primeiras duas imagens são do 1º e 3º dia da amostra AM, e nas últimas duas são do 1º e 3º dia da amostra AI. 
Imagem 1. Processo de fermentação do levain
Fonte: autores, 2021.
Os microrganismos que compõem a microbiota do levain são provenientes tanto da farinha que é rica em enzimas, como do próprio ambiente de produção. Leveduras e bactérias lácticas vão ao longo do processo sendo incorporadas ao fermento, com o passar do tempo as populações desses microrganismos vão estabelecendo uma relação duradoura que persiste no levain, ou seja, é uma cultura simbiótica de leveduras e lactobacilos que se beneficiam mutuamente. Pode-se observar na Imagem 1 o comportamento do levain em comparação ao primeiro e o terceiro dia de ambas amostras, no primeiro demonstra-se uma amostra mais líquida, enquanto no terceiro observa-se o crescimento e a formação de bolhas, indicando que o processo de fermentação apresentou resultados promissores.
Para o início do experimento para verificação de bactérias, diluiu-se a amostra do levain em água peptonada 0,1%, constituída por triptona, cloreto de sódio, fosfato dissódico e fosfato monopotássico. Isto é feito, pois, esta solução é um meio não seletivo para pré-enriquecimento no processo de isolamento de micro-organismos. A triptona presente na água peptonada fornece aminoácidos e proteínas aos micro-organismos, o cloreto de sódio mantém o balanço osmótico do meio, e o fosfato dissódico e o fosfato monopotássico servem como agentes tamponantes. 
Durante o experimento do crescimento de bactérias em meio de cultivo, utilizou-se o bico de Bunsen aceso e permanente durante todo o tempo, pois serve como um agente físico de controle de população microbiana. As alças, espátulas, e os equipamento utilizados no repique microbiano foram flambadas e esterilizados antes a sua introdução nas placas de cultura, para que não houvesse contaminações. 
Os meios de cultura utilizados para a prática foram o ágar MRS e PCA. O ágar é um polissacarídeo obtido de um grupo de algas, e é utilizado como um agente solidificante em meios de cultura para microbiologia, pois mantém sua firmeza em temperaturas necessárias para o crescimento de muitos patógenos e são mais resistentes a degradação por enzimas bacterianas. O ágar MRS é um meio de cultura seletivo para favorecer o crescimento de Lactobacillus, já o ágar PCA é um meio de cultura que favorece o crescimento bactérias em geral.
Os resultados provenientes da prática perante a análise da presença de bactérias lácticas e leveduras em meio MRA e PCA, são demonstrados na Imagem 2 e 3, analisadas 3 dias e 6 dias após o preparo, respectivamente.
Imagem 2. Crescimento de bactérias em meio MRS e PCA 3 dias após o preparo
Fonte: autores, 2021. 
Imagem 3. Crescimento de bactérias em meio MRS e PCA 6 dias após o preparo
Fonte: autores, 2021. 
A microbiota do levain pode variar significativamente dentro dos perímetros por conta das regiões, mas em geral predominam as bactérias lácticas especialmente do gênero lactobacillus tais como: Lb. Sanfranciscensis, Lb. Fermentum, Lb. Brevis. Assim como as bactérias lácticas do gênero: Leuconostoc, Weissela, Lactococcus, Pediococcus. Bem como as leveduras do gênero: S. cerevisiae, Candida, Kazachstania, Kluyveromyces, Pichia, Torulaspora.  Como pode-se ver na Imagem 2 e 3, houve o crescimento de Lactobacillus no meio MRS e no meio PCA, podendo-se observar, também, o crescimento de pequenas colônias de bactérias. A análise para leveduras não foi realizada em virtude do meio PDA estar vencido, porém, provavelmente pode-se contar com a presença de leveduras predominantes do tipo saccharomyces.
Toda energia que os microrganismos precisam, vem basicamente da farinha de trigo, tanto as leveduras quanto as bactérias lácticas consomem os carboidratos provenientes do amido, o qual é o principal componente da farinha de trigo. Esse polissacarídeo, a partir da hidratação com água, começa a ser quebrado pelas enzimas presentes naturalmente na farinha, principalmente as amilases. Desta forma, a glicose e a maltose ficam disponíveis para as células microbianas se desenvolverem e fermentarem. A levedura do gênero S. cerevisiae consegue consumir a maltose, porém, outras leveduras como a Candida, não conseguem utilizar esse dissacarídeo. No entanto, algumas bactérias lácticas como a Lb. Sanfranciscensis quebram a maltose em duas moléculas de glicose, disponibilizando esse carboidrato para as leveduras se desenvolverem. 
O amido inicialmente se transforma em ácido pirúvico, e em seguida, devido às leveduras, a glicose gera o etanol e o gás carbônico, após isto, as bactérias láticas formam o ácido lático. Pode-se observar na equação da reação como a fermentação da glicose produz álcool etílico e gás carbônico, e a liberação de energia. O gás carbônico liberado fica preso na massa do levain, fazendo com que cresça e forme os alvéolos típicos do miolo de um pão. 
EQUAÇÃO DE REAÇÃO
C6H12O6 + enzima →   2C2H2OH  + 2CO2 + 234kJ
Em geral, o fermento obtido apresentou resultados promissores, tanto no seu visual, que apresentou bolhas e dobrou de tamanho, na textura, que ficou mais encorpada, no cheiro, apresentando-se azedo, na cor, que passou de branco para bege claro, quanto na análise micro-organismos, que se mostraram presentes na amostra, e assim, demonstrando-se estar apto para o uso e confirmando o seu potencial fermentativo.
4. CONCLUSÃO
Com base nisto, foi possível produzir um fermento natural e verificar a presença de micro-organismos presentes no mesmo, através do método de placas Petri em meios de cultura ágar MRS e PCA. A microbiota do levain presente nas amostras foi devidamente ativada e posteriormente isolada em ágar por meio de técnicas de estrias, a amostra apresentou um crescimento considerável onde pode se observar o surgimento de pequenas colônias de bactérias (Lactobacillus) em meio MRS e em meio PCA (pontos brancos), Imagem 2 e 3. Esses resultados sugerem que a fermentação natural é uma tecnologia promissora a ser utilizada.
5. REFERÊNCIAS
ALVES, G. M. Método fundamentado em processamento digital de imagens para contagem automática de unidade formadoras de colônias. São Carlos: UFSCar, 2006. Disponível em: <https://repositorio.ufscar.br/bitstream/handle/ufscar/336/DissGMA.pdf?sequence=1>. Acesso em: 23 jun. 2021.
APLEVICZ, K. S. Identificação de bactérias láticas e leveduras em fermento natural obtido a partir de uva e sua aplicação em pães. UFSC: Programa de pós-graduação em Ciências dos alimentos. Florianópolis, 2013. Disponível em: <https://repositorio.ufsc.br/bitstream/handle/123456789/107460/319263.pdf?sequence=1&isAllowed=y>. Acesso em: 22 jun. 2021.
BIANCHINI, M. C. Desenvolvimento de fermento natural seco para produção de panetone. UNICAMP: Departamento de Tecnologia de Alimentos. Campinas, 2004. Disponível em: <http://repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/254180/1/Bianchini_MicheleCarolina_M.pdf>. Acesso em: 22 jun. 2021.
TIRLONI, L. Aplicação tecnológica de fermento natural “levain” em substituição ao processo tradicional de elaboração de pães. Centro universitário Univates, Lageado, 2017. Disponível em: <https://www.univates.br/tecnicos/media/artigos/Aplicacao_Tecnologica_de_Fermento_Natural_Levain_em_Substituicao_ao_Processo_Tradicional_de_Elaboracao_de_Paes_2017-A.pdf>. Acesso em: 22 jun, 2021.