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AMINOÁCIDOS Força-Tarefa de Alimentos Fortificados e Suplementos Júlio Sérgio Marchini Helio Vannucchi Vivian Marques Miguel Suen Selma Freire de Carvalho da Cunha © 2016 ILSI Brasil International Life Sciences Institute do Brasil ILSI BRASIL INTERNATIONAL LIFE SCIENCES INSTITUTE DO BRASIL Rua Hungria, 664 — conj.113 01455-904 — São Paulo — SP — Brasil Tel./Fax: 55 (11) 3035-5585 e-mail: ilsibr@ilsi.org.br © 2016 ILSI Brasil International Life Sciences Institute do Brasil Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) (Câmara Brasileira do Livro, SP, Brasil) Aminoácidos / Júlio Sérgio Marchini...[et al.]. -- São Paulo : ILSI Brasil-International Life Sciences Institute do Brasil, 2016. Outros autores: Helio Vannucchi, Vivian Marques Miguel Suen, Selma Freire de Carvalho da Cunha Vários autores. Bibliografia. ISBN 978-85-86126-57-4 1. Aminoácidos 2. Nutrição 3. Proteínas 4. Saúde - Promoção I. Marchini, Júlio Sérgio. II. Vannucchi, Helio. III. Suen, Vivian Marques Miguel. IV. Cunha, Selma Freire de Carvalho da. 16-05682 CDD-613.2 Índices para catálogo sistemático: 1. Alimentos : Nutrientes : Nutrição aplicada : Promoção da saúde 613.2 3 Aminoácidos / ILSI Brasil Esta publicação foi possível graças ao apoio da Força-Tarefa de Alimentos Fortificados e Suplementos, subordinada ao Comitê de Nutrição e este ao Conselho Científico e de Administração do ILSI Brasil. Segundo o estatuto do ILSI Brasil, no mínimo 50% de seu Conselho Científico e de Administração deve ser composto por representantes de universidades, institutos e órgãos públicos, sendo os demais membros representantes de empresas associadas. Na página 115, encontra-se a lista dos membros do Conselho Científico e de Administração do ILSI Brasil, e na página 117, as empresas mantenedoras da Força-Tarefa de Alimentos Fortificados e Suplementos em 2016. Para mais informações, entre em contato com o ILSI Brasil pelo telefone (11) 3035-5585 ou pelo e-mail: ilsibr@ilsi.org.br As afirmações e opiniões expressas nesta publicação são de responsabilidade dos autores, não refletindo, necessariamente, as do ILSI Brasil. Além disso, a eventual menção de determinadas sociedades comerciais, marcas ou nomes comerciais de produtos não implica endosso pelo ILSI Brasil. Índice Autores Prefácio I. Aminoácidos: funções e segurança 1. Aminoácidos: definição 1.1. Caracterização bioquímica dos aminoácidos 1.2. Aspectos gerais relacionados ao metabolismo de aminoácidos 1.3. Panorama geral sobre a segurança de uso dos aminoácidos 1.4. Métodos alternativos para avaliação da segurança de uso dos aminoácidos 1.4.1. Histórico das recomendações internacionais para o consumo de aminoácidos II. Aplicação dos aminoácidos na metabolômica 1. Genômica nutricional 2. Metabolômica III. Avaliação do perfil de aminoácidos no auxílio do diagnóstico e tratamento de distúrbios metabólicos 1. Derivatização ou reação pré-coluna 2. Derivatização ou reação pós-coluna IV. Consumo de aminoácidos no Brasil V. Aminoácidos, características gerais e teor no leite materno 1. Introdução e definição 2. Aminoácidos: dados gerais 3. Aminoácidos ramificados e metabolismo da amônia 4. Histidina 5. Arginina 6. Fenilalanina 9 13 15 15 15 16 22 23 28 39 39 39 45 46 48 53 57 57 64 66 67 67 68 7. Glutamina 8. Metionina 9. Taurina VI. Aminoácidos e exercício físico: aplicação para saúde e desempenho físico 1. Ação anabólica/catabólica dos músculos esqueléticos 2. Substrato para a gliconeogênese 3. Resposta imunológica 4. Retardo da fadiga central 5. Desempenho físico VII. Aminoácidos e obesidade 1. Perfil de aminoácidos livres no plasma 2. Aminoácidos de cadeia ramificada 3. O papel da taurina 4. Triptofano: o aminoácido sacietógeno VIII. O papel dos aminoácidos na nutrição, com ênfase em geriatria 1. População idosa IX. Fenilcetonúria 1. Tratamento da fenilcetonúria X. Dietas enterais e aminoácidos XI. Fórmulas de aminoácidos para terapia nutricional parenteral disponíveis no Brasil XII. Conselho científico e de administração do ILSI Brasil XIII. Empresas mantenedoras da Força-Tarefa de Alimentos Fortificados e Suplementos 2016 68 68 69 75 75 76 76 77 78 85 85 85 86 87 93 93 99 100 103 111 117 119 7 Aminoácidos / ILSI Brasil Coordenação Geral Júlio Sérgio Marchini, Helio Vannucchi, Vivian Marques, Miguel Suen, Selma Freire de Carvalho da Cunha Autores: Amanda Marcela Bono Nishida Nutricionista. Aprimoranda. Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. Bruno Affonso Parenti Nutricionista. Doutorando. Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. Camila Fernanda Brandão Educação Física. Doutoranda. Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. Carla Barbosa Nonino Nutricionista. Professora Doutora do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. Carlos Alexandre Fett Educação Física. Núcleo de Aptidão Física, Informática, Metabolismo, Esporte e Saúde (NAFIMES) da Universidade Federal do Mato Grosso. Carolina Hunger Malek Zadeh Nutricionista. Doutoranda da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. 8 Aminoácidos / ILSI Brasil Carolina Ferreira Nicoletti Nutricionista. Pós-doutoranda. Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. Eduardo Ferriolli Médico. Professor Associado. Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Clínica Médica Geral e Geriatria. Eline Hillesheim Nutricionista. Mestranda. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Gilberto João Padovan Químico. Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. Helena Fernandes Martins Tavares Nutricionista. Assuntos Regulatórios Corporativos Ajinomoto do Brasil. Helio Vannucchi Médico. Professor Titular do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. José Henrique Silvah Médico. Pós-Doutorando. Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. Jowanka Amorim Nutricionista. Mestranda. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Júlio Sérgio Marchini Médico. Professor Titular do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. 9 Aminoácidos / ILSI Brasil Karina Pfrimer Nutricionista. Pós-Doutoranda. Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Clínica Médica Geral e Geriatria. Márcia Varella Morandi Junqueira-Franco Farmacêutica e Bioquímica.Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. Marlene de Fátima Turcato Médica. Departamento de Neurologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo Mayara Perna Assoni Nutricionista. Unidade Metabólica. Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. Nancy Yukie Yamamoto Tanaka Nutricionista. Diretora do Serviço de Nutrição do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Selma Freire de Carvalho da Cunha Médica. Professora Doutora do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. Vivian Marques Miguel Suen Médica. Professora Doutora do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Disciplina de Nutrologia. 11 Aminoácidos / ILSI Brasil Prefácio A principal função dos aminoácidos é atuar como subunidades de estruturação de moléculas proteicas. Todas as proteínas de todos os organismos vivos são forma- das por uma combinação variada de apenas 20 tipos diferentes de aminoácidos: essenciais, não essenciais ou, ainda, condicionalmente essenciais. Aspectos da qualidade das proteínas em função da sua composição quantitativa de aminoácidos essenciais são encontrados nesta publicação. As funções fisiológicas em várias circunstâncias das etapas de desenvolvimento corporal em pessoas eutróficas, como também em alguns casos de doenças relacionadas aos teores de aminoácidos, são abordadas. Alguns aminoácidos são chamados de funcionais, tais como arginina, cisteína, glutamina, leucina, prolina e triptofano. Os 20 aminoácidos que ocorrem na natureza como substrato para síntese peptídica, proteica, são codificados a partir de quatro nucleotídeos presentes na molécula do DNA. A quantificação de aminoácidos livres em fluidos e tecidos biológicos pode fornecer importante informação bioquímica e nutricional que permite o diagnóstico de várias doenças, assunto abordado em um dos capítulos. Formulações de aminoácidos para terapia nutricional parenteral, encontradas no Brasil, também são apresentadas no capítulo correspondente. Conhecimentos dos níveis basais e pós-prandiais dos aminoácidos circulantes podem orientar sobre a necessidade imposta pelo exercício físico e a adequação da dieta para o atleta, o que é sugerido nesta revisão. A discussão sobre o papel dos aminoácidos na nutrição, com ênfase em geriatria, tam- bém é apresentada. A Resolução RDC nº 63 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde, de 6/7/2000, refere-se a dietas enterais e aminoácidos. Esta revisão oferecida pela Força-Tarefa de Fortificação e Suplementação relata, principalmente, particularidades dos aminoácidos contidos nos alimentos, seu papel fisiológico, funções, aspectos gerais e conteúdo nos alimentos habitualmente con- sumidos pela população brasileira. Esperamos, finalmente, que as informações possam contribuir para aprimorar o conhecimento e servir de base para outros eventuais estudos. Prof. Dr. Helio Vannucchi 13 Aminoácidos / ILSI Brasil AMINOÁCIDOS: FUNÇÕES E SEGURANÇA Helena Fernandes Martins Tavares Helio Vannucchi 1. AMINOÁCIDOS: DEFINIÇÃO Por definição, tem-se que os aminoácidos são compostos orgânicos formados por um grupo amino (—NH3) associado a um grupo carboxila (—COOH). A principal função dos aminoácidos é atuar como subunidades de estruturação de moléculas proteicas.1 Dependendo da capacidade de o organismo humano sintetizar endogenamente a quantidade de aminoácidos suficiente para suprir as necessidades metabólicas, tem-se a sua classificação em aminoácidos essenciais e não essenciais.1 Considerando que o organismo precisa da ingestão dietética desses aminoácidos essenciais, a ausência ou a ingestão inadequada de qualquer um desses aminoáci- dos leva a um balanço de nitrogênio negativo, podendo acarretar perda de peso, crescimento prejudicado (principalmente em crianças) e ainda alguns outros sin- tomas clínicos.1 1.1. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DOS AMINOÁCIDOS Todas as proteínas de todos os organismos vivos são formadas por uma combinação variada de apenas 20 tipos diferentes de aminoácidos, dos quais nove são aminoácidos essenciais e 11 não essenciais ou, ainda, condicionalmente essenciais, ou seja, ami- noácidos que, em determinadas condições metabólicas, deixam de ser sintetizados pelo organismo em quantidade suficiente para atender as necessidades fisiológicas. Os aminoácidos essenciais são isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano, valina e, para crianças, histidina.2 Conforme mencionado, todos esses aminoácidos podem ser definidos como sendo uni- dades monoméricas de estruturação de moléculas de proteína, caracteristicamente compostos por um grupo amino (—NH3) associado a um grupo carboxila (—COOH). 1 De acordo com a Figura 1, pode-se notar que, com exceção da prolina, todos os aminoá- cidos têm o grupo carboxila ligado ao grupo amino por um carbono, além de apresen- tar ainda uma cadeia R— variável.2 I 14 Aminoácidos / ILSI Brasil Figura 1. Os 20 aminoácidos presentes na natureza responsáveis pela formação das proteínas de todos os organismos vivos. 1.2. ASPECTOS GERAIS RELACIONADOS AO METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS De acordo com o Institute of Medicine, na publicação das suas Dietary References Intakes (DRI), a proteína é o principal componente estrutural e funcional de todas as células do organismo. Enzimas, transportadores de membrana, moléculas de trans- porte do sangue, matrizes intracelulares, cabelo, unhas, albumina de soro, queratina e colágeno, assim como muitos hormônios reguladores dos processos fisiológicos, são todos moléculas proteicas. Assim, uma oferta adequada de proteínas na dieta é essencial para manter não apenas a integridade, mas também a função celular, para saúde e reprodução (IOM, 2005).3 Por sua vez, além de atuar como subunidades estruturadoras das proteínas, os próprios aminoácidos também atuam como precursores de coenzimas, hormônios, ácidos nucleicos e outras moléculas essenciais para o funcionamento do organismo.3 15 Aminoácidos / ILSI Brasil Além de o perfil aminoacídico ser um aspecto importante para a qualificação nutricional das proteínas, a estrutura das moléculas proteicas também influência na digestibilidade dos aminoácidos. Na mesma publicação da IOM3, é detalhado o intercâmbio existente entre o pool de proteínas corporais presentes nos tecidos e na circulação e o pool de todos os aminoácidos livres presentes nos fluidos corporais (Figura 2). Figura 2. Turnover de proteínas reúne as trocas existentes entre as proteínas corpo- rais e o pool de aminoácidos livres.3 Na Figura 2, as setas indicam os processos contínuos de degradação e ressíntese do turnover das proteínas, assim como outras vias envolvendo o pool de aminoácidos livres, tais como: obtenção dos aminoácidos, seja a partir da dieta ou da síntese endógena de aminoácidos não essenciais, e perda por excreção, oxidação ou pela conversão a outros metabólitos não proteicos. De maneira geral, os aminoácidos absorvidos pelo organismo são utilizados para reconstituição das suas próprias proteínas, sendo, portanto, imprescindível o fornecimento de quan- tidade suficiente e balanceada dos diferentes tipos de aminoácidos essenciais.3 A partir de uma dieta desequilibrada, existe o risco de alguns aminoácidos necessários para a síntese proteica estarem em quantidades insuficientes, enquanto outros ami- noácidos aparecerem em excesso, seguindo para sua excreção sem mesmo terem sido utilizados ou, alternativamente,sendo desviados para o provimento de energia. Da mesma forma, quando determinados aminoácidos são consumidos em quantidade excessiva, existe a possibilidade que seja suprimida a absorção ou a utilização de outros aminoácidos, agravando ainda mais o quadro de desequilíbrio no pool de ami- noácidos livres.3 Portanto, para que tais riscos de desequilíbrio sejam evitados e a contínua síntese de proteínas do organismo seja garantida, é importante manter uma dieta que forneça quantidade e balanço adequados de aminoácidos. 16 Aminoácidos / ILSI Brasil A relevância da manutenção de quantidade e balanço adequados dos nutrientes para continuidade da vida já tem sido discutida pela Lei do Mínimo de Liebig (Liebig Law of the Minimum ou Liebig Law), princípio desenvolvido por Carl Sprengel, em 1828, e popularizado pelo químico alemão Justus Von Liebig, sendo mais utilizado pelas Ciências Agrárias. Justus Freiherr Von Liebig foi um dos cientistas mais respeitados e influentes do sé- culo XIX. As maiores contribuições de Liebig foram a química de fulminatos, química orgânica, química agrícola e fisiologia. Em meados de 1840, Liebig voltou sua atenção para o estudo da química de solos, plantas e animais que poderiam ajudar a aumentar a rentabilidade da agricultura. Os experimentos envolveram principalmente a conversão de terras de plantio estéril em terras férteis, dado que o crescimento da planta fica comprometido quando há falta de qualquer elemento essencial, mesmo se os demais estiverem presentes em excesso. Os resultados levaram à conclusão de que cada nutriente é essencial, e a deficiência de qualquer um pode ter efeito adverso. Por isso, concluíram que um “mínimo” de todos os nutrientes precisa estar disponível para se garantir o crescimento saudável das plantas.4 A fim de ilustrar a Lei do Mínimo de Liebig, Dobenecks pensou na imagem de um barril cheio de água, frequentemente conhecido como Teoria do Barril, vide Figura 3. Figura 3. Teoria do Barril, de Dobenecks, que ilustra a Lei do Mínimo de Liebig. Da mesma forma, aplicando a Lei do Mínimo de Liebig e a Teoria do Barril à nutrição humana e à ingestão proteica, quando uma dieta é formulada com uma fonte natural de proteínas, alguns tipos de aminoácidos essenciais podem estar presentes em quantidades insuficientes ou excessivas. Se determinado aminoácido estiver escasso, a eficiência da alimentação fica limitada ao nível desse aminoácido insuficiente (fator limitante). 17 Aminoácidos / ILSI Brasil Na Teoria do Barril, cada ripa representaria um tipo de aminoácido, sendo o com- primento das ripas representantes das quantidades individuais de cada aminoácido. Portanto, a capacidade do barril fica limitada pela ripa mais curta, assim como a sín- tese proteica e o crescimento ficam limitados pelos aminoácidos menos disponíveis. Por outro lado, os aminoácidos em excesso, correspondentes às ripas acima do nível de água, não serão utilizados para a síntese de proteínas, seguindo para excreção ou vias alternativas para produção de energia (Figura 4). O nitrogênio consumido como fonte de energia é usualmente excretado como amônia. Figura 4. Aplicação da Teoria do Barril para avaliar o aporte dietético de aminoáci- dos. A nutrição fica limitada pelo fornecimento do nutriente mais escasso, no exem- plo, a lisina (aminoácido limitante). Portanto, tem-se que, quando a dieta é deficiente em, pelo menos, um aminoácido, o corpo não consegue utilizar com eficiência todos os aminoácidos disponíveis no pool. No exemplo ilustrado pela Figura 4, apenas com a adição de lisina foi possível garantir um aproveitamento mais eficiente dos aminoácidos. Como mencionado anteriormente, apesar de o organismo ser capaz de sintetizar 11 de um total de 20 aminoácidos, ainda existem nove aminoácidos essenciais que o organismo não é capaz de sintetizar, devendo ser obtidos única e exclusivamente a partir da dieta.1 A fim de se garantir um padrão saudável de síntese de proteínas, músculos e tecidos, a adequação do consumo de aminoácidos, principalmente essenciais, dependerá do equilíbrio estabelecido entre seu consumo dietético e as necessidades fisiológicas do organismo, seja para um sujeito saudável, doente ou ainda passando por algum estado transitório que requer maior aporte proteico, por exemplo, de crescimento acelerado (crianças), gestação, lactação ou prática de atividade física.1 18 Aminoácidos / ILSI Brasil Portanto, considerando que os aminoácidos essenciais não são sintetizados pelo or- ganismo, muitas vezes são eles que limitam, de alguma forma, a síntese de proteínas, músculos e tecidos. Sendo assim, para garantir um padrão saudável e adequado de síntese proteica, faz-se necessário um consumo dietético satisfatório ou, em alguns momentos, até aumentado de aminoácidos essenciais. De acordo com o IOM3,a dieta humana padrão apresenta uma vasta gama de diferen- tes tipos de proteínas dietéticas (Tabela 1). Como consequência de um maior consumo dietético de proteínas, é de se esperar um aumento natural das concentrações de aminoácidos livres e de ureia, no sangue pós-prandial, e de compostos nitrogenados, tais como ureia, na urina. Tais mudanças fazem parte da regulação normal dos altos níveis circulantes de ami- noácidos e nitrogênio e que, quando sob níveis normais de ingestão por sujeitos saudáveis, não representam risco ou perigo à saúde. Tabela 1. Variabilidade no perfil aminoacídico de diferentes tipos de alimentos pre- sentes na dieta habitual.1 hh Altas quantidades de aminoácidos presentes no alimento. ii Baixas quantidades de aminoácidos presentes no alimento. P Balanço geral bom de aminoácidos no alimento. Q U EI JO , O VO , LE IT E E CA RN E M IL H O CE RE AL LE G U M ES G RÃ O IN TE G RA L (C O M G ER M E) N O ZE S, Ó LE O D E SE M EN TE S, S O JA SE M EN TE S D E G ER G EL IM E G IR AS SO L AM EN D O IM VE RD U RA S G EL AT IN A LE VE D U RA Metionina ! ! !! "" !! "" !! "" "" "" !! Isoleucina !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Leucina !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Lisina !! "" "" !! !! !! "" "" ! "" ! Fenilalanina ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! "" Treonina !! "" "" !! ! !! ! "" ! ! !! Triptofano ! "" ! "" "" ! !! ! ! "" ! Valina !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! AMINOÁCIDOS CATEGORIAS DE ALIMENTOS 19 Aminoácidos / ILSI Brasil Um sujeito adulto saudável que consome 70-100 g/dia de proteínas excreta cerca de 11-15 g/dia de nitrogênio pela urina, principalmente na forma de ureia e com algu- mas pequenas contribuições de amônia, ácido úrico, creatinina, ou ainda de alguns aminoácidos livres. Esses compostos nitrogenados correspondem aos produtos finais mais comuns obtidos a partir do metabolismo proteico. Enquanto o ácido úrico e a creatinina são derivados indiretos dos aminoácidos, a ureia e a amônia são obtidas a partir da sua oxidação parcial.3 A remoção do nitrogênio de cada aminoácido, bem como sua conversão a uma forma que possa ser excretada pelos rins, pode ser considerada um processo dividido em duas etapas principais. A primeira etapa normalmente ocorre através de reações enzimáticas de dois tipos, por transaminação ou desaminação.3 Transaminação corresponde a uma reação reversível que utiliza cetoácidos inter- mediários oriundos do metabolismo da glicose, por exemplo: piruvato, oxaloacetato e alfa-cetoglutarato, como destinatários do nitrogênio amino (alfa-amino). A maioria dos aminoácidos pode participar dessas reações, resultando em seus alfa-amino trans- feridos para formação de três aminoácidos: alanina, a partir do piruvato, aspartato, a partir do oxaloacetato, e ainda glutamato, a partir do alfa-cetoglutarato.3 Ao contráriode muitos aminoácidos, a transaminação dos aminoácidos de cadeia ramificada pode ocorrer em diferentes tecidos por todo o organismo, principalmente no músculo esquelético. Nessa ação, os principais receptores do grupo alfa-amino são alanina (piruvato) e glutamina (glutamato, alfa-cetoglutarato) que, em seguida, passam para a circulação. Eles servem como importantes carreadores de nitrogênio vindos da periferia (músculos esqueléticos) para o intestino e fígado. No intestino delgado, glutamina é extraída e metabolizada para amônia, alanina e citrulina, que, em seguida, são transportadas ao fígado através da circulação portal.3 O nitrogênio também pode ser removido dos aminoácidos por reações de desamina- ção, que resulta na formação de amônia. Certos aminoácidos podem ser desamina- dos, quer diretamente (histidina), por desidratação (serina e treonina), por meio do ciclo de purinas (aspartato) ou, ainda, por desaminação oxidativa (glutamato). Com isso, a síntese de ureia ocorre no fígado pelo ciclo de Krebs-Henseleit. Após a síntese, a ureia é transportada por meio da circulação do fígado para os rins, onde é, final- mente, excretada pela urina.3 Contudo, é possível notar que o organismo humano não mantém uma grande reserva de aminoácidos livres, sendo qualquer excesso rapidamente metabolizado e/ou ex- cretado. Portanto, o pool metabólico de aminoácidos encontra-se em um estado de equilíbrio dinâmico, nas próprias proteínas celulares e que pode ser requisitado a qualquer momento a fim de suprir qualquer nova necessidade fisiológica, tais como: incorporação em proteínas tissulares, neoglicogênese e síntese de novos compostos nitrogenados (ex.: creatina e epinefrina).1,2 20 Aminoácidos / ILSI Brasil A contínua dinâmica da proteína nas pessoas é necessária tanto para garantia do pool de aminoácidos livres como para atender as necessidades das mais diversas células e tecidos corporais. Com isso, os tecidos mais acionados para esse turnover são as proteínas do plasma, mucosa intestinal, pâncreas, fígado e rins, enquanto músculos, pele e cérebro apresentam uma participação muito menor.1 Cada célula do organismo é capaz de sintetizar um grande número de proteínas espe- cíficas a partir dos aminoácidos, sejam essenciais ou não essenciais. As características e a especificidade de cada proteína sintetizada pelo organismo são predeterminadas pelo código genético presente nas moléculas de DNA, que funciona como modelo para a síntese de várias formas de RNA que, então, participam da síntese proteica propriamente dita. No entanto, para que a síntese proteica ocorra, é preciso que to- dos os aminoácidos necessários estejam disponíveis, principalmente os aminoácidos essenciais, que devem vir única e exclusivamente da dieta.1 O Amino Acid Scoring Pattern, estabelecido pela joint FAO FAO/WHO/UNU, estabelece a quantidade mínima e o equilíbrio dos aminoácidos a serem consumidos a partir da dieta, recomendações essas estabelecidas para as mais diversas faixas etárias (estágios de vida) da população. 1.3. PANORAMA GERAL SOBRE A SEGURANÇA DE USO DOS AMINOÁCIDOS Os aminoácidos estão largamente presentes na natureza, havendo apenas 20 tipos para a síntese de todas as proteínas. Eles compõem aproximadamente 20% do cor- po humano e são naturalmente encontrados em uma série de alimentos, e tem-se que o consumo de aminoácidos é amplamente variável conforme o padrão da dieta. Portanto, devido a essa variabilidade, associada à incapacidade do organismo em armazenar o excedente, um desenvolvido sistema homeostático foi adquirido pelos grandes primatas a fim de garantir que altos níveis de aminoácidos, provenientes da alimentação, fossem manejados e excretados de forma eficiente. Enquanto estudos referentes à determinação das necessidades mínimas de aminoá- cidos evoluem com o tempo,5 sendo possível citar alguns exemplos como as DRI3 ou as recomendações da joint FAO/WHO/UNU6 e da FAO Expert Consultation7, níveis máximos tolerados de ingestão (upper levels — UL) são estabelecidos por estudos es- pecíficos realizados em animais e com humanos. No entanto, nenhum limite máximo pode ainda ser assumido como oficial devido à escassez de estudos clínicos específicos para a determinação de UL de aminoácidos, pois: existe um longo histórico de uso se- guro de aminoácidos, seja a partir de alimentos ou formas isoladas (suplementos), em países ocidentais e no Japão; os aminoácidos estão ampla e naturalmente presentes nos mais diversos alimentos; há também histórico de uso de aminoácidos especial- mente em pacientes sob tratamento, por exemplo, em aplicações terapêuticas da nutrição clínica para estados pós-operatórios ou de recuperação de grandes traumas. 21 Aminoácidos / ILSI Brasil Os Estados Unidos e o Japão foram países que destinaram os maiores esforços na tentativa de estabelecer limites de UL para aminoácidos em humanos saudáveis, já em meados dos anos 2000. Contudo, os pesquisadores concluíram que não existiam estudos clínicos suficientes ou mesmo necessidade prática, devido principalmente ao longo histórico de consumo seguro dos aminoácidos a partir da dieta. Atualmente, há esforços pontuais na ciência na tentativa de se estabelecerem valores de UL para determinados aminoácidos. Com isso, é possível citar o Norway Scientific Committee for Food Safety (VKM) que, em 2013, publicou documentos relacionados à segurança de uso de histidina, metionina e triptofano.8 Existe também o International Council on Amino Acid Science (ICAAS), que já organi- zou em torno de oito workshops internacionais com conteúdo científicos publicados no periódico Journal of Nutrition. Por sua vez, o ICAAS apoia diversos projetos de pes- quisa clínica, possuindo, atualmente, a posição de que os aminoácidos presentes nos alimentos e em suplementos são substâncias seguras e que sua toxicidade está fre- quentemente limitada por barreiras tecnológicas, tais como: estabilidade limitada; sabor e odor adversos, quando em altas doses, evitando o uso excessivo de aminoáci- dos em alimentos e suplementos; e ainda a maioria dos aminoácidos frequentemente aplicada para a nutrição humana (ex.: BCAA) não ser facilmente solúvel em água. Atualmente, o ICAAS permanece como uma das únicas organizações globais que trabalham ativamente em estudos de avaliação de níveis máximos tolerados de ingestão (UL) para os principais aminoácidos. No entanto, a ausência de um padrão sistemático de efeitos adversos em humanos em resposta à administração oral de aminoácidos não permite a definição de valores de UL para humanos com base nos dados de No Observed Adverse Effect Level (NOAEL) ou Lowest Observed Adverse Effect Levels (LOAEL) estabelecidos em roedores. Por isso, o principal objetivo do ICAAS é a revisão de dados obtidos a partir de estudos clínicos de investigação realizados com humanos. 1.4. MÉTODOS ALTERNATIVOS PARA AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DE USO DOS AMINOÁCIDOS No caso de aditivos alimentares, para avaliação da sua segurança de uso, geral- mente é determinada a Ingestão Diária Aceitável (IDA) através da multiplicação do valor de NOAEL, obtido em estudos toxicológicos feitos com animais, pelo fator de segurança de 1/100, sendo dez, pela diferença entre espécies, e em mais dez, por diferenças individuais (intraespécies). Caso esse mesmo método fosse aplicado para estimativa de valores de IDA para os ami- noácidos, os limites estariam incoerentemente abaixo das quantidades consumidas a partir da dieta habitual. Um exemplo pode ser feito para a glicina, pois, multiplicando o valor de NOAEL encontrado em estudos toxicológicos realizados com ratos, de 1.800 mg/kg p.c., pelo fator de segurança (1/100), tem-se uma IDA de 18 mg/kg p.c. 22 Aminoácidos / ILSI Brasil Considerando um sujeito de 60 kg p.c., a partir desse valor, o limite de consumo seria deapenas 1,08 g/dia de glicina. Uma vez que o consumo médio de glicina observado para a população norte-americana foi de 3,2 g/dia (Third National Healthy and Nutrition Examination Survey — NHANES III), nota-se uma ingestão segura equivalente a cerca de três vezes o valor estimado da IDA para glicina. Portanto, tem-se que esse método empregado para avaliação da segurança de uso e estabelecimento de valores de IDA para aditivos alimen- tares seria pouco aplicável para nutrientes cujo metabolismo já está muito bem estabelecido, seja em animais ou em humanos. Na literatura, estão disponíveis alguns dados toxicológicos de aminoácidos obtidos a partir de estudos experimentais realizados com animais. No entanto, pela dificuldade e devido à inconsistência observada durante a aplicação da metodologia toxicológica padrão (resultados de NOAEL e LOAEL em animais corrigidos para humanos), muitos dos estudos que avaliaram os efeitos de diferentes níveis de consumo de aminoácidos em humanos utilizaram outras metodologias alternativas de avaliação. Algumas envolveram abordagem com metabolômica e análise de clusters (CAMC: Cluster Analysis of Multivariate Correlations), como tratado por Noguchi, Sakai e Kimura9, ou, ainda, transcriptômica por DNA microrray e análise de CAMC, como realizado por Matsuzaki et al,10 Tais metodologias são estudos que visaram abordagens alternativas e diferenciadas para o estudo de ingestão adequada e segurança de uso de diferentes aminoácidos. Para conhecimento, enquanto a metabolômica trata da caracterização e entendi- mento do comportamento de todos os metabólitos relacionados ao metabolismo do organismo, por exemplo, ao metabolismo de aminoácidos, a transcriptômica caracteriza e procura explicar o comportamento e a transcrição de RNA-mensageiro. Das metodologias alternativas presentes na literatura, a mais aplicada em estudos clínicos com humanos e experimentos com animais foi a observação de níveis de consumo de aminoácidos que levaram a um nível máximo de oxidação pelo organismo (“limite metabólico”). De acordo com Pencharz, Elango e Ball11, genética e outros fatores podem influenciar as respostas do organismo ao consumo excessivo de aminoácidos, em diferentes es- pécies. A grande variabilidade na resposta a várias doses de aminoácidos, em seres humanos, torna ainda mais desafiador a identificação de um valor oficial de UL para aminoácidos. No mesmo artigo, Pencharz, Elango e Ball11 discutem e detalham ainda em quais situações o uso de doses elevadas de formas isoladas de alguns aminoácidos, acima dos níveis recomendados, poderia ser benéfico, buscando determinar, portanto, qual seria esse excedente de aminoácidos ainda seguro. Para tanto, os autores dis- correm sobre a ação de diferentes níveis de consumo sob os níveis de oxidação dos aminoácidos. 23 Aminoácidos / ILSI Brasil Pencharz, Elango e Ball11 mencionam ainda vários estudos na literatura que comparam os efeitos do consumo de doses elevadas de aminoácidos ligados à proteína versus aminoácidos livres. Tais estudos demonstram que os aminoácidos, quando ofertados em meio a uma matriz proteica, proporcionam um efeito muito menor nos níveis plasmáticos do aminoácido testado, provavelmente devido ao fato de a ingestão de proteínas estimular a síntese proteica, sendo uma maneira fisiológica de direcionar e, assim, dissipar o aumento da ingestão de dado aminoácido. Além disso, o consumo de aminoácidos, ligados à proteína ou como uma mistura de aminoácidos, também provoca menor impacto negativo, quando comparado ao con- sumo excessivo de aminoácidos isolados individualmente. De qualquer maneira, os autores acreditam que a principal dificuldade para se iden- tificar os níveis máximos tolerados de ingestão de aminoácidos deve-se ao fato de que os marcadores mais adequados do consumo excessivo possuírem características muito específicas de dose-resposta. Em particular, a resposta desses marcadores ao aumento da ingestão deveria demonstrar um ponto de inflexão que poderia ser uti- lizado para a identificação da situação de excesso.11,12 Contudo, os autores defendem que um possível marcador para definição desse limite máximo para aminoácidos seria o nível de ingestão que atingiria o maior nível de oxidação, ou seja, correspondente ao “limite metabólico”. Alguns aminoácidos têm funções metabólicas específicas, quando consumidos em concentrações além das necessidades para simples síntese proteica, por exemplo: estimulação da síntese de proteína pela leucina; síntese de catecolaminas, a partir dos aminoácidos aromáticos; doação do grupo metil e enxofre em diferentes reações fisiológicas, dos aminoácidos sulfurados; ou ainda produção de óxido nítrico a partir da arginina. Portanto, a suplementação dietética com aminoácidos específicos em excesso pode ter efeitos adversos ou benéficos, dependendo da situação. Por essa razão, é necessário que haja o conhecimento do mais alto nível de ingestão possível de cada um dos aminoácidos no qual não ocorre nenhum efeito adverso.13 Com isso, quando a ingestão de dado aminoácido estiver baixa, a síntese de pro- teínas, oxidação e excreção do próprio aminoácido, bem como de seus respectivos metabólitos, será igualmente baixa (Figura 5). 24 Aminoácidos / ILSI Brasil Figura 5. Representação esquemática da resposta fisiológica do organismo ao con- sumo excessivo de aminoácidos.11 Por outro lado, aumentando a ingestão do aminoácido limitante, há também um au- mento de sua retenção devido à sua maior utilização para a síntese de proteínas, além de quaisquer outras funções metabólicas necessárias. Portanto, um primeiro gradiente positivo de retenção do aminoácido pode ser observado (Figura 6). Figura 6. Padrão de resposta esperado para um aumento na ingestão de aminoácido. Com a elevação da ingestão do aminoácido, o nível de oxidação aumenta até atingir o “limite metabólico” de oxidação do excedente (saturação do sistema). O ponto de inflexão poderia ser identificado como o nível máximo tolerado de ingestão (UL) para o aminoácido, sendo que qualquer ingestão acima poderia aumentar o risco potencial de efeitos adversos.11 25 Aminoácidos / ILSI Brasil Uma vez que a necessidade do aminoácido é atendida para a síntese de proteínas, bem como para todas as outras funções relacionadas, o excesso do aminoácido será catabolizado proporcionalmente ao consumo adicional. O aumento do catabolismo será proporcional ao excesso ingerido, já que esse incremento adicional do aminoá- cido mobiliza o metabolismo oxidativo. Nessa fase, as vias catabólicas ainda são su- ficientes para manejar o excesso de ingestão, que é degradado para produção de energia. Para alguns tipos de aminoácidos, nessa etapa, um declive mínimo ou mesmo não significativo poderá ser observado na curva de retenção do aminoácido.11 Se for continuado o consumo do aminoácido, uma nova inclinação positiva da curva de retenção surgirá devido a uma maior retenção no pool de aminoácidos livres, já que o organismo atinge o seu “limite metabólico”, não sendo mais capaz de catabolizar o aminoácido em proporção direta ao volume ingerido. Esse ponto, em que a capa- cidade metabólica de catabolismo ou oxidação do excedente são excedidas, poderia ser assumido como uma estimativa do nível máximo tolerado de ingestão (UL), pois representa um nível de ingestão no qual os mecanismos reguladores normais já não são mais suficientes para metabolizar o excedente.11 No entanto, é válido destacar ainda que o consumo de aminoácidos nesse ponto de inflexão do “limite metabólico” não representa ainda um nível de ingestão propria- mente tóxico. Nesse nível, tem-se apenas uma sugestão de que quaisquer aumentos em sua ingestão aumentariam o potencial de risco de efeitos adversos. Além disso, qualquer consumo do aminoácido acima desse ponto é normalmentecaracterizado por aumento nos níveis circulantes na excreção de catabólitos secundários, pela urina.11 Embora essa abordagem descrita por Pencharz, Elango e Ball,11 não seja única e tam- pouco definitiva, o método de avaliação do carbono marcado com isótopo estável seria aplicável a todos os aminoácidos metabolizados em dióxido de carbono (CO2), quais sejam: fenilalanina, BCAAs (leucina, valina e isoleucina) e lisina. Por outro lado, para aminoácidos como metionina e cisteína, que são aminoácidos sulfurados, o catabolismo predominantemente leva à produção de sulfato e taurina, que são, em sua maioria, excretados pela urina. A avaliação de sulfato urinário tem sido validada como um método simples e não invasivo de mensurar o catabolismo dos aminoácidos sulfurados. Da mesma maneira, a excreção de sulfato alcançará um limite quando o excedente de aminoácidos sulfurados saturar a taxa metabólica.11 Segundo Pencharz, Elango e Ball,11 para alguns outros aminoácidos essenciais, incluindo treonina, histidina e triptofano, as vias catabólicas são mais complexas e o carbono não é liberado tão facilmente no pool de bicarbonato a fim de ser excretado como CO2. Para esses aminoácidos, a identificação do nível máximo tolerado de ingestão (UL) pode ser mais complexa. 26 Aminoácidos / ILSI Brasil Métodos alternativos também foram abordados por Kimura, Bier e Taylor.14 Em seu artigo, os autores reportaram sobre a discussão para estabelecimento de UL para aminoácidos no 8th Workshop on the Assessment of Adequate and Safe Intake of Dietary Amino Acids. Particular atenção foi dada à experiência do International Life Sciences Institute Research, com seu Key-Events Dose Response Framework (KEDRF), um quadro analítico que examina, sistematicamente, os principais eventos que ocorrem entre a dose inicial de uma substância ou nutriente e qualquer efeito de risco à saúde. No quadro, os principais eventos que influenciam a relação dose-resposta, bem como fatores subjacentes à variabilidade, são considerados. Uma abordagem baseada em evidências, e menos em suposições, quantificando a variabilidade e melhor caracteri- zando os limites biológicos, tem sido utilizada para estimativa dos níveis máximos tolerados de ingestão não apenas de alguns contaminantes, mas também da vitami- na A, que tem toxicidade conhecida, quando consumida em excesso.14,15 Desenvolvido como uma extensão do International Life Sciences Institute, International Program on Chemical Safety Mode of Action e Human Relevance Framework, o KEDRF permite uma melhor compreensão da relação dose-res- posta para cada desfecho.14,15 O KEDRF já foi utilizado no planejamento de alguns estudos mais recentes relaciona- dos à segurança de uso da leucina.12,16 1.4.1. Histórico das recomendações internacionais para o consumo de aminoácidos Em 2007, a World Health Organization (WHO), juntamente com a Food and Agricul- ture Organization of the United Nations (FAO) e a United Nations University (UNU), publicou o “Technical Report 935 — Protein and amino acid requirements in human nutrition”. As recomendações publicadas nesse documento resultaram do encontro do joint FAO/WHO/UNU Expert Consultation, ocorrido entre 9 e 16 de abril de 2002, em Genebra. No encontro, seus especialistas revisaram o documento “Technical Re- port 724 — Energy and protein requirements”, publicado em 1985.6,17 De acordo com o “Technical Report” 9356, estima-se que sujeitos adultos e saudáveis apre- sentam uma necessidade média de proteínas totais de 0,66 g/kg p.c./dia. Com isso, a necessidade média de aminoácidos essenciais seria de 0,48 g/kg p.c./dia e de aminoácidos não essenciais, 0,18 g/kg p.c./dia. O documento ressalta ainda que uma ingestão adequa- da, juntamente com um equilíbrio nos níveis de aminoácidos essenciais e não essenciais, contribui para o atendimento das necessidades diárias e homeostase de nitrogênio. 27 Aminoácidos / ILSI Brasil É importante ressaltar que, de acordo com as novas recomendações, o termo “dietary requirement” corresponde à quantidade de proteínas, aminoácidos constituintes, ou ambos, que deve ser obtida a partir da dieta, para atender a demanda metabólica e, com isso, manter o equilíbrio de nitrogênio.6 Tabela 2. Necessidades diárias de aminoácidos essenciais para adultos saudáveis (adaptado de FAO/WHO/UNU).6 a Necessidade média de nitrogênio de 105 mg/kg p.c./dia de nitrogênio (0,66 g/kg p.c./dia de proteínas) b SAA: Aminoácidos sulfurados c AAA: Aminoácidos aromáticos Na maioria dos casos, a necessidade é maior que a demanda metabólica, já que existem fatores que influenciam na eficiência do uso da proteína, como a digestão, a absorção e a biodisponibilidade celular aos aminoácidos absorvidos, em relação às necessidades, definindo a digestibilidade e, consequentemente, a perda diária de compostos nitrogenados pelas fezes. Sabe-se que, quando a ingestão dietética de nitrogênio é zero, acompanhada com adequação energética e dos demais nutrientes, existe uma contínua perda de nitrogênio pelo organismo, identificada como perda obrigatória de nitrogênio. Por outro lado, quando se aumenta a ingestão de proteínas, aminoácidos e ni- trogênio, existe um nível adequado que permite o balanço de nitrogênio, cujo valor corresponde à necessidade mínima de proteínas.6 Por definição, o nível adequado corresponde ao menor nível de ingestão ne- cessário para se alcançar o equilíbrio de nitrogênio, em curto e longo prazo. Na prática, as medições das necessidades mínimas de proteínas variam muito entre os indivíduos, por várias razões, sendo algumas já conhecidas, tais como: taxa de metabolismo basal, gasto energético, crescimento, fatores ambientais, estilo de mg/kg p.c./dia mg/g proteínaa mg/kg p.c./dia mg/g proteínaa Histidina 10 15 8 – 12 15 Isoleucina 20 30 10 15 Leucina 39 59 14 21 Lisina 30 45 12 18 Metionina + Cisteína (SAA)b 15 22 13 20 Metionina 10 16 - - Cisteína 4 6 - - Fenilalanina + Tirosina (AAA)c 25 38 14 21 Treonina 15 23 7 11 Triptofano 4 6 3,5 5 Valina 26 39 10 15 AMINOÁCIDOS ESSENCIAIS RECOMENDAÇÕES DE 2007 RECOMENDAÇÕES DE 1985 28 Aminoácidos / ILSI Brasil vida, tipo de alimentação, qualidade da proteína dietética etc.6 Em 2013, foi publicada a “FAO Expert Consultation (FAO Food and Nutrition Paper 92) — Dietary Protein Quality Evaluation in Human Nutrition”, na qual foi reunido um conjunto de conclusões obtidas a partir de discussões de especialistas realizadas no período de 31 de março a 2 de abril, de 2011, em Auckland, na Nova Zelândia. O principal objetivo do fórum foi revisar o uso do método de avaliação da qualidade de proteínas pelo método do Protein Digestibility Corrected Amino Acid Score (PD- CAAS), estabelecido pela FAO/WHO, em 1989.7 Contudo, chegaram à conclusão de que deveria ser recomendado um novo modelo de mensuração da qualidade de proteínas denominado Digestible Indispensable Amino Acid Score (DIAAS). Além disso, na publicação também foi recomendado o uso de dois scoring patterns, para fins regulatórios:7 − Para lactentes, até 6 meses de idade, adotar o padrão da composição de aminoáci- dos do leite materno. − Para crianças de 6 meses a 3 anos de idade, seguir o padrão de aminoácidos estabelecidos para 6 meses. − Para demais grupos populacionais (> 3 anos), seguir o padrão de aminoácidos estabelecidos para crianças de 3-10 anos. Nas Tabelas 3 e 4, estão resumidas as principais recomendações da FAO7, bem como as pequenas adequações feitas às recomendações da FAO/WHO/UNU.7 29 Aminoácidos / ILSI Brasil Tabela 3. Padrão para estimativa das necessidades de aminoácidos para lactentes, crianças, adolescentes e adultos (valores revisados e alterados das recomendações da FAO/WHO/UNU).6,7 a Os valores para lactentes são baseados no padrão da composição de aminoácidos do leitematerno. b Os valores para crianças de 6 meses a 3 anos são baseados no padrão de aminoácidos estabelecidos para 6 meses. c Os valores para crianças (> 3 anos), adolescentes e adultos são baseados no padrão de aminoácidos estabelecidos para crianças de 3-10 anos. H IS TI D IN A IS O LE U CI N A LE U CI N A LI SI N A AM IN O ÁC ID O S SU LF U RA D O S AM IN O ÁC ID O S AR O M ÁT IC O S TR EO N IN A TR IP TO FA N O VA LI N A FAIXA ETÁRIA Lactentes (0 a 6 meses) a 21 55 96 69 33 94 44 17 55 Crianças (6 meses a 3 anos) b 20 32 66 57 27 52 31 8,5 43 Crianças, adolescentes e adultos c 16 30 61 48 23 41 25 6,6 40 PADRÃO DE AVALIAÇÃO DAS NECESSIDADES PROTEICAS (mg/g) 30 Aminoácidos / ILSI Brasil Tabela 4. Padrão para estimativa das necessidades de aminoácidos, segundo faixa etária (valores revisados e alterados das recomendações da FAO/WHO/UNU).6,7 a Composição de aminoácidos da proteína corpórea íntegra. b Padrão de manutenção para adultos. c Calculado como valores médios para a faixa etária: crescimento ajustado para uti- lização proteica de 58%. d Soma dos aminoácidos correspondentes às necessidades dietéticas para manutenção (manutenção proteica × scoring pattern adultos) e crescimento (deposição de tecidos ajustados para 58% da eficiência de aproveitamento da dieta × scoring pattern adultos). e Necessidades de aminoácidos/necessidades proteicas para determinadas faixas etárias. Note-se que os valores, alguns são ligeiramente alterados do relatório 2007, são os valores calculados corretamente. No relatório publicado, o valor para a necessidade de aminoácidos sulfurados para crianças de 3-10 está incorreto (18 mg/kg/d), bem como os padrões para crianças em idades pré-escolar e escolar maiores de 10 anos (28, 26 e 24 mg/g de proteína). H IS TI D IN A IS O LE U CI N A LE U CI N A LI SI N A A M IN O Á CI D O S SU LF U RA D O S A M IN O Á CI D O S A RO M Á TI CO S TR EO N IN A TR IP TO FA N O VA LI N A 27 35 75 73 35 73 42 12 49 15 30 59 45 22 38 23 6 39 IDADE (anos) MANUTENÇÃO CRESCIMENTOc 0,5 0,66 0,46 22 36 73 63 31 59 35 9,5 48 1-2 0,66 0,20 15 27 54 44 22 40 24 6 36 3-10 0,66 0,07 12 22 44 35 17 30 18 4,8 29 11-14 0,66 0,07 12 22 44 35 17 30 18 4,8 29 15-18 0,66 0,04 11 21 42 33 16 28 17 4,4 28 > 18 0,66 0,00 10 20 39 30 15 25 15 4 26 0,5 20 32 66 57 27 52 31 8,5 43 1-2 18 31 63 52 25 46 27 7 41 3-10 16 30 61 48 23 41 25 6,6 40 11-14 16 30 61 48 23 41 25 6,6 40 15-18 16 30 60 47 23 40 24 6,3 40 > 18 15 30 59 45 22 38 23 6 39 NECESSIDADES PROTEICAS (g/kg p.c./dia) NECESSIDADES DE AMINOÁCIDOS (mg/kg p.c./dia)d SCORING PATTERN mg/g DE NECESSIDADE PROTEICAd PADRÃO DE AMINOÁCIDOS DE MANUTENÇÃO (mg/g proteína)b PADRÃO DE AMINOÁCIDOS DO TECIDO (mg/g proteína)a 31 Aminoácidos / ILSI Brasil De maneira geral, especialistas da FAO7 ressaltaram que faltam estudos prospectivos de longo prazo especificamente desenvolvidos para examinar determinados desfechos em saúde, assumindo, portanto, os valores estabelecidos em 2007.6 Ressaltaram ainda não existir qualquer evidência relacionando a ingestão de proteínas ou aminoácidos com riscos à saúde de forma substancial que permitisse a identificação de níveis óti- mos de ingestão e/ou de redução do risco de desenvolvimento de doenças crônicas.7 Para proteínas e aminoácidos, assim como para os outros nutrientes, a relação com efeitos sobre a saúde limita-se principalmente a alguns estudos de caso com poucos exemplos ou evidências, ainda insuficientes para garantir uma meta-análise ou uma revisão sistemática que estabeleça qualquer tipo de relação significativa. Teorica- mente, nenhum desses pequenos estudos inclui dados de dose-resposta suficientes para a identificação de uma dose de ingestão adequada ou até mesmo de níveis máxi- mos tolerados de ingestão (UL).7 Por fim, a FAO7 reconhece as limitações inerentes aos valores atualmente aceitos e publicados por seus especialistas, inclusive nas recomendações de proteínas e ami- noácidos identificados no documento como Amino Acid Scoring Patterns, ressaltando que mais estudos precisam ser conduzidos. Contudo, apesar de todas essas limita- ções, as recomendações da FAO7 ainda são as mais recentes publicadas e aceitas pela literatura. Ainda em relação às recomendações nutricionais para um adequado consumo de proteínas e aminoácidos, não se pode deixar de mencionar a importância da publicação do Food and Nutrition Board, do Institute of Medicine (IOM) “DRI – Dietary Reference Intakes for Energy, Carbohydrate, Fiber, Fat, Fatty Acids, Cholesterol, Protein, and Amino Acids”, de 2005, que estabelece valores de EAR (Estimates Average Requirement) e RDA (Recommended Dietary Allowance) para os aminoácidos essenciais (Figura 7).3 32 Aminoácidos / ILSI Brasil Figura 7. Relação entre os valores de EAR, RDA/AI e UL.3 De acordo com o IOM3, tem-se os seguintes critérios de recomendação: − Estimates Average Requirement (EAR): corresponde ao nível de ingestão diária mé- dia estimada que atende as necessidades de metade dos indivíduos (50%) de uma população saudável, em dado estágio de vida e faixa etária. − Recommended Dietary Allowance (RDA): é a ingestão diária média estimada que atende as necessidades de, aproximadamente, todos os indivíduos (97%-98%) de uma população saudável, em dado estágio de vida e faixa etária. − Tolerable Upper Intake Level (UL): é a média do nível máximo tolerado de ingestão estimado que não oferece risco de efeitos adversos a, aproximadamente, todos os sujeitos de uma população em geral. Sendo assim, a ingestão de qualquer dose acima da UL poder aumentar os riscos potenciais de efeitos adversos. − Adequate Intake (AI): corresponde ao nível de ingestão diária média estimada com base em estudos de observação ou, ainda, em aproximações determinadas experi- mentalmente de nutrientes que atende a um ou mais grupos de pessoas, aparente- mente saudáveis, assumido como adequado. O valor de AI é usado quando não se pode estabelecer uma RDA. De acordo com o IOM3, as necessidades nutricionais poderiam ser definidas como os menores níveis de ingestão contínuos necessários dos nutrientes, para indicadores es- pecíficos de adequação, que irão manter definidos um nível de nutrição no indivíduo. Portanto, tais necessidades são variáveis de acordo com o estágio de vida e faixa etária da população. 33 Aminoácidos / ILSI Brasil Especificamente em relação aos níveis máximos tolerados de ingestão (UL) dos ami- noácidos, o documento do IOM3 reconhece que o modelo de UL baseia-se principal- mente em dados de consumo crônico. Ou seja, para permitir o estabelecimento de uma UL, fazem-se necessários mais dados de estudos crônicos, em longo prazo, de aminoácidos. 35 Aminoácidos / ILSI Brasil REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. MAHAN LK, ESCOTT-STUMP S. Proteínas. In: Krause: Alimentos, nutrição e dietote- rapia. 9. ed. São Paulo: Roca, 1998; pp. 63-76. 2. WAITZBERG DL, LOGULLO P. Proteínas. In: WAITZBERG, D. L. Nutrição oral, enteral e parenteral na prática clínica. 3ª edição. São Paulo: Atheneu, 2000; pp. 35-54. 3. [IOM] INSTITUTE OF MEDICINE (2005). Dietary References Intakes for Energy, Car- bohydrates, Fiber, Fat, Fatty Acids, Cholesterol, Protein and Amino Acids. 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KIMURA T, RENWICK AG, KADOWAKI M, CYNOBER LA The 7th Workshop on the Assessment of Adequate Intake of Dietary Amino Acids: Summary of Gen- eral Discussion. 7th Amino Acid Assessment Workshop. The Journal of Nutrition 2008;138:2050S-2052S. 16. PENCHARZ PB, RUSSELL RM. Application of Key Events Dose Response Framework to Defining the Upper Intake Level of Leucine in Young Men. Supplement: 8th Work- shop on the Assessment of Adequate and Safe Intake of Dietary Amino Acids. The Journal of Nutrition 2012;142:2225S-2226S. 17. [WHO] WORLD HEALTH ORGANIZATION. 9.3 – Calculation of “extreme” intakes. In: Guidelines for the Study of Dietary Intakes of Chemical Contaminants. WHO Off- set Publication n° 87. Geneva, 1985;pp. 52-56. 37 Aminoácidos / ILSI Brasil APLICAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS NA METABOLÔMICA Carolina Ferreira Nicoletti Bruno Affonso Parenti de Oliveira Julio Sergio Marchini Carla Barbosa Nonino 1. GENÔMICA NUTRICIONAL Os estudos em nutrição nos últimos anos estão passando por uma profunda modifi- cação, uma vez que sua área de pesquisa era focada em epidemiologia e fisiologia molecular, mas agora englobam biologia e genética.1 Após o advento das tecnologias ômicas e do sequenciamento do genoma humano, os estudos genômicos possuem como objetivo principal caracterizar as funções dos genes e sua interação com os fatores ambientais.2 A genômica nutricional busca uma compreensão genética de como a nutrição influencia o equilíbrio entre saúde e doença por meio da alteração genética.3,4 2. METABOLÔMICA Na biologia da era pós-genoma, a metabolômica surgiu para a avaliação de metabólitos em sistemas humanos,5 incluindo a análise das mudanças no perfil bioquímico em fluidos biológicos, células e tecidos,6 sendo considerado o ponto final da análise molecular de humanos (Figura 1).7 II 38 Aminoácidos / ILSI Brasil Figura 1. Metabólitos como produtos finais da interação entre gene, transcritos e proteínas. Os estudos de metabolômica podem avaliar grupos de metabólitos relacionados com uma via específica do metabolismo ou comparar modificações nos padrões de metabólitos em respostas a estímulos do meio ambiente,8-9 inclusive a dieta. A aplicação dos estudos do metaboloma de aminoácidos na nutrição inclui a avaliação do perfil e das características dos aminoácidos da dieta, dos mecanismos de digestão, absorção e metabolismo, dos processos de regulação no crescimento e saúde, além dos níveis recomendados de ingestão, segurança e toxidade.10-16 Nesse contexto, o metaboloma de aminoácidos parece ser especialmente relevante em estudar os efeitos da ingestão excessiva de proteínas e aminoácidos,9 auxiliando na identificação do estado nutricional proteico e do balanço de aminoácidos no organismo.17,18 Alterações no perfil de aminoácidos plasmáticos após ingestão de refeições com diferentes conteúdos proteicos têm sido estudadas.19,20 Pesquisa realizada em seres humanos encontrou níveis urinários mais elevados de car- nitina, acetilcarnitina, taurina e glutamina associados ao consumo de dieta rica em carne quando comparados com dieta com alto teor de proteínas de origem vegetal.6 Assim, a quantificação dos aminoácidos livres em fluidos e tecidos pode fornecer informação bioquímica e nutricional que auxilia no diagnóstico de várias doenças, es- pecialmente de deficiências metabólicas,21 obesidade e diabetes,7 doenças hepáticas e intestinais.22 Do mesmo modo, o fenótipo metabólico de humanos pode facilitar a avalição da resposta metabólica de cada paciente ao tratamento, tornando possível uma dieta personalizada (Figuras 2 e 3).23,24 39 Aminoácidos / ILSI Brasil Figura 2. Diagrama da aplicação de aminoácidos na metabolômica. Figura 3. Representação de aminoacidograma obtido pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência. 1: Aspartato; 2: Cisteína; 3: Glutamina; 4: Serina; 5: His- tidina; 6: Glicina; 7: Treonina; 8: Arginina; 9: Taurina; 10: Alanina; 11: Tirosina; 12: Valina; 13: Metionina; 14: Fenilalanina; 15: Isoleucina. 41 Aminoácidos / ILSI Brasil REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Muller M, Kersten S. Nutrigenomics: goals and strategies. Nature reviews Genetics 2003;4:315-322. 2. Fialho E, Moreno FS, TP O. Nutrição no pós-genoma: fundamentos e aplicações de ferramentas ômicas. Rev Nutr Campinas 2008;21:757-766. 3. Kaput J, Rodriguez RL. Nutritional genomics: the next frontier in the postgenomic era. Physiological genomics 2004;16:166-177. 4. Subbiah MT. Understanding the nutrigenomic definitions and concepts at the food- genome junction. Omics: a journal of integrative biology 2008;12:229-235. 5. Garcia-Canas V, Simo C, Leon C, Cifuentes A. 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Protein and amino acid status before and after bariatric surgery: a 12-month follow-up study. Surgery for obesity and related diseases: official journal of the American Society for Bariatric Surgery 2013;9:1008-1012. 43 Aminoácidos / ILSI Brasil AVALIAÇÃO DO PERFIL DE AMINOÁCIDOS NO AUXÍLIO DO DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS METABÓLICOS Márcia Varella Morandi Junqueira-Franco Gilberto João Padovan Júlio Sérgio Marchini A quantificação de aminoácidos livres em fluidos e tecidos biológicos nos fornece importante informação bioquímica e nutricional que permite o diagnóstico de várias doenças, especialmente deficiências proteico-metabólicas, tornando-se uma ferra- menta importante no direcionamento do tratamento de diversas doenças, tais como desnutrição, obesidade, pacientes críticos, sepse, estresse metabólico, doença celía- ca, aminoacidopatias, entre outras. Os aminoácidos desempenham papel importante tanto como substratos básicos como reguladores em muitas vias metabólicas.1,2 Hoje, a determinação de perfis de aminoácidos (aminogramas) em amostras biológicas é geralmente analisada por cromatografia de troca iônica de alta eficácia (CLAE=HPLC), na qual se consegue analisar 40 ou mais aminoácidos e compostos relacionados. Anormalidades específicas nas concentrações de ami- noácidos são associadas com condições fisiológicas e relatadas no contexto de várias doenças, incluindo insuficiência hepática, insuficiência renal, câncer, diabetes, disfunção muscular, aminoacidemia e assim por diante. O equilíbrio entre aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) e aminoácidos aromáti- cos, conhecido como a relação de Fischer, está estabelecido como um marcador de diagnóstico e é usado para monitorar a progressão da fibrose hepática e a eficácia do tratamento com medicamentos. As informações do aminograma exceto para a relação de Fischer e aminoacidemia, no entanto, não tem sido suficiente- mente utilizadas para monitorização de estados fisiológicos, controle nutricional ou diagnóstico clínico.3 Os métodos mais utilizados para determinação dos aminoácidos são por cromato- grafia: Cromatografia Liquida de Alta Eficiencia (CLAE) com modificações, como a Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UPLC), utilizada com o intuito de diminuir o tempo de análise; Cromatografia Gasosa (GC/FID); Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massa (HPLC-MS).4,5 III 44 Aminoácidos / ILSI Brasil A CLAE é um dos métodos mais utilizados para a análise do perfil de aminoáci- dos.6,7 Em relação aos detectores, é necessário que a instrumentação apresente uma série de características desejáveis. Para um detector tido como “ideal”, poderíamos listar: — alta sensibilidade e baixo limite de detecção; — resposta rápida a todos os solutos; — estável a mudanças de temperatura e da vazão da fase móvel; — resposta independente da fase móvel; — pequena contribuição ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector; — resposta que aumente linearmente com a quantidade de soluto; — não destruição do soluto; — segurança e conveniência para uso; — informação qualitativa e quantitativa da substância desejada. Infelizmente, não existem detectores com todas as características, mas os de- tectores atuais procuram abranger a maior parte delas, podendo-se escolher de- tecção por UV ou fluorescência. Como o número de aminoácidos de interesse é grande e estes possuem estruturas químicas muito semelhantes, é necessária a utilização de gradientes das fases móveis (normalmente, uma das fases é compos- ta por tampão fosfato e a outra, por metanol ou acetonitrila ou tetraidrofurano etc., ou misturas entre elas). Para a quantificação dos aminoácidos constituintes da amostra, pela cromatogra- fia líquida, estes, se sólidos, precisam ser hidrolisados antes de analisados, e para os aminoácidos livres circulantes no sangue e/ou qualquer outro fluido biológico, devem ser desproteinizados antes da análise, enquanto pela cromatografia gasosa devem ser derivatizados. O objetivo da derivatização na CG é aumentar a volatilização da substância, a sensibilidade de detecção e a seletividade da separação na coluna, enquanto na CLAE é transformá-lo em outro composto que possa ser detectado em fluorescên- cia ou outro tipo de detector. Na cromatografia líquida, podemos optar pela rea- ção pré-coluna (Figura 1) ou reação pós-coluna (Figura 2), utilizando-se reagentes específicos para cada situação. 1. DERIVATIZAÇÃO OU REAÇÃO PRÉ-COLUNA Para a reaçãopré-coluna, os aminoácidos sofrem uma reação com o reagente antes da injeção e, em seguida, os produtos da reação são separados pela coluna em uso e detectados posteriormente. As vantagens do método são as seguintes: 45 Aminoácidos / ILSI Brasil — A quantidade de consumo de reagente é minimizada, pois utiliza-se um volume muito pequeno, e a reação pode ocorrer em temperatura ambiente, sendo bas- tante rápida dependendo do reagente a ser usado. — Permite o aumento da sensibilidade, utilizando reagentes específicos que ofereçam baixos níveis de ruído no sistema, quando comparados à reação pós-coluna. — Como o reagente é colocado em excesso, o restante do reagente não causa maiores problemas em relação à análise, pois utiliza-se um volume muito pequeno. Por outro lado, uma desvantagem é que o reagente de derivatização é misturado diretamente com a amostra antes da injeção. A eficiência da reação (rendimento) é facilmente influenciada pela matriz da amostra (tal como componentes coexis- tentes e tipos de solventes). A coluna utilizada terá uma vida útil menor que no caso da reação pós-coluna. Por outro lado, não necessitamos de outra bomba para bombear o reagente e também não utilizaremos um sistema de aquecimeto para que a reação possa ocorrer. Portanto, a reação pré-coluna pode ser considerada apropriada quando se pretende analisar uma variedade de amostras sem prejudicar a sensibilidade de detecção. Os reagentes de derivatização pré-coluna mais comumente usados para a análise de aminoácidos, entre outros, são: — orto-ftalaldialdeído (OPA); — fenilisotiocianato (PITC); — fluorescamina; — cloreto de Dansilo (Dansyl chloride); — FMOC-chloride; — reagente de Marfey (FDAA). Os procedimentos das reações variam amplamente a partir de uma simples mis- tura em temperatura ambiente até uma reação que necessita de aquecimento. Em muitos casos, a cromatografia de fase reversa é utilizada para produtos de reação a serem separados pela coluna em que se tem vários aminoácidos a serem quantificados. Normalmente, a cromatografia de fase reversa não é um procedi- mento adequado para separação de substâncias altamente hidrofílicas, como os aminoácidos. No entanto, no uso da derivatização pré-coluna, os aminoácidos podem ser modifi- cados para grupos funcionais altamente hidrofóbicos, habilitando a cromatografia de fase reversa, uma vez que os métodos para uso da fase reversa proporcionam excelente separação, permitindo a análise de alto rendimento. 46 Aminoácidos / ILSI Brasil Figura 1. Derivatização pré-coluna. 2. DERIVATIZAÇÃO OU REAÇÃO PÓS-COLUNA A reação pós-coluna envolve a separação dos aminoácidos na coluna e, em seguida, o contato destes com os reagentes de derivatização, transformando-se em compostos para serem detectados. Pode ser automatizada, o que oferece maior desempenho quantitativo e reprodutibilidade. As vantagens são as seguintes: — Uma vez que os componentes da amostra são separados antes da reação, a eficiên- cia desta é menos propensa aos efeitos da matriz biológica, o que lhe permite ser usada para uma vasta gama de amostras. — Como o reagente de reação flui continuadamente para o detector, a reação pós-coluna é limitada às amostras, não permitindo a detecção do reagente que não reagiu, limitando os tipos de reagentes que podem ser utilizados. Atualmente, existem dois tipos de reagentes disponíveis para utilização na análise de aminoácidos: ninidrina e orto-ftalaldialdeído. O primeiro é para a detecção de absor- ção no visível e o segundo é para a detecção em fluorescência. 47 Aminoácidos / ILSI Brasil Figura 2. Derivatização pós-coluna. A avaliação do perfil de aminoácidos tem sido determinada em diversos estudos atuais. No estudo realizado por Nicolleti et al,8 foi avaliado o perfil sérico de aminoácidos em pacientes obesas submetidas à cirurgia bariátrica, que mostrou um aumento nas concentrações na maioria dos aminoácidos após três meses de cirurgia; aos seis meses, ácido glutâmico, serina, arginina, alanina, metionina, valina, fenilalanina, isoleucina e as concentrações de tirosina diminuíram. Após 12 meses, as concentrações de proteína total e albumina caíram. No final do es- tudo, foi demonstrada a deficiência de aminoácidos essenciais, indicando a baixa ingestão proteica associada ao fator desabsortivo. A análise de aminoácidos também é fundamental no entendimento das consequências do câncer no metabolismo energético e auxilia na definição de estratégias para pre- venir e tratar a desnutrição. Rabito et al,9 relacionaram a medida dos níveis pré-cirúr- gicos de carnitina plasmática em pacientes com câncer e a associação com ingestão dietética, antropometria, bioimpedância, calorimetria indireta, níveis plasmáticos de aminoácidos, níveis de carnitina e nitrogênio urinários. Contudo, os pacientes com câncer apresentaram deficiência e baixos estoques de carnitina, mas não houve correlação com gasto energético, ingestão de alimentos ou nos níveis dos aminoácidos lisina e metionina. Vários pesquisadores encontraram decréscimo nos níveis plasmáticos de taurina e a expressão reduzida de uma enzima importante na síntese de taurina em animais obesos. 48 Aminoácidos / ILSI Brasil As evidências, acompanhadas do desequilíbrio metabólico na obesidade e os possíveis efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes da taurina, destacam-na como um possível suplemento no tratamento da obesidade. Rosa et al,10 investigaram se a suplementa- ção de taurina, associada com orientação nutricional, modula o estresse oxidativo, a resposta inflamatória e a homeostase da glicose em mulheres obesas. Os níveis plasmáticos de taurina foram diminuídos significativamente nas voluntárias obesas. Oito semanas com a suplementação de taurina junto a orientação nutricio- nal foi capaz de aumentar os níveis de adiponectina e diminuir os marcadores in- flamatórios e a peroxidação lipídica em mulheres obesas. Corsetti et al,11 identificaram a relação entre esforço metabólico, lesão muscular/ índices de atividade e perfil de aminoácido urinário ao longo de uma atividade de resistência prolongada de alta performance, a fim de identificar possíveis marcadores de fadiga. A taurina e o dipeptídeo carnosina (β-alanil-L-histidina) foram significativa- mente correlacionados com os índices de marcadores de atividades musculares e de esforço, concluindo que o perfil metabólico é modificado com o esforço físico intenso. Os índices urinários de taurina e carnosina são, portanto, ferramentas úteis para avaliar os danos musculares e o estado de fadiga em provas longas de esforço. A biologia molecular pós-genômica está caminhando para novas tecnologias ex- perimentais, que permitem um exame paralelo e em larga escala na identificação de fenótipos dos diferentes estágios de desenvolvimento celulares. As análises de transcrição servem para definir o transcriptoma ou, no nível de tradução, para definir o proteoma. Nogushi et al,3 desenvolveram um modelo de algoritmo combinatório, fazendo uma correlação com as razões molares de aminoácidos, podendo ser característicos de condições ou estados fisipatológicose, revelando novas possibilidades da utilização de análise de aminoácidos como biomarcadores do plasma, gerando índices de diag- nóstico junto à bioinformática. Concluindo, o perfil de aminoácidos de amostras biológicas pode ser usado para gerar índices que poderiam ser utilizados para o diagnóstico clínico, sendo uma fer- ramenta útil para a compreensão de implicações metabólicas, sob várias condições fisiológicas. Novos estudos no desenvolvimento e melhoria de métodos analíticos, juntamente com a biologia molecular na avaliação do perfil aminoacídico, poderão ser indicadores úteis para facilitar a gestão nutricional de estados fisiológicos e patológicos específicos. 49
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