Aula prática de cultura bacteriana

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Autora: Eduarda C.
Área de Estudo: Microbiologia
Propósito: Relatório
Aula Prática- Enterobactérias sp
Introdução
A microbiologia conforme
Trabulsi e Toledo (1996), é ramo da
biologia que estuda a morfologia,
reprodução, fisiologia, e taxonomia de
seres microscópicos e sua interação com
o ambiente e demais seres vivos. Dessa
forma foi efetuado análise microscópica
a partir de material amostral
previamente de animais atendidos na
clínica veterinária da Universidade.
Cultivando essas amostras em
placa de Petri com ágar de MacConkey e
CLED por sete dias, obtendo a formação
de colônias bacterianas. Extraindo em
seguida material com agulhas de
incubação das colônias bacterianas, para
realização de teste de Rugai Modificado
com Indol e Lisina e teste de Catalase,
permitindo identificação diagnóstica das
bactérias em questão auxiliando na
escolha do tratamento oferecido ao
animal ou a indicação de novos tipos de
testes.
Metodologia
A prática aconteceu em três dias,
no primeiro dia foram realizados os
preparos da placa de petri
CLED/Macconkey a partir da amostra nº
15 por técnica de espalhamento por
esgotamento.
No segundo dia -uma semana
depois- foi efetuado teste de Rugai
modificado, a partir da contaminação da
agulha na placa de Petri, fez semeadura
por incubação com picada central ao
tubo e estriamento na superfície do
material do tubo.
E prova de catalase, em que após
a contaminação de alça de Drigalski
metal com material das colônias,
despejo sobre lâmina do material
amostral e gota da solução para
verificação da formação ou não de
bolhas.
No terceiro dia, um dia após o
segundo, realizou-se a leitura das
diferentes provas no teste de Rugai
modificado.
Materiais
Placa de petri;
Meio de cultura Ágar CLED/ Ágar
Macconkey;
Agulha de inoculação;
Amostra nº 15;
Alça de semeadura em metal;
Tubo de provas Rugai Modificado
com Indol e Lisina;
Lâmina para microscopia;
Bico de Bunsen;
Peróxido de hidrogênio a 3%.
Cultivo e Identificação de Colônias
Todos os seres vivos possuem
suas especificidades quanto às
condições de vida, no caso das bactérias
não é diferente, para que elas possam
crescer, e entende-se como crescimento
o seu aumento populacional por divisão
binária (TRABULSI; TOLEDO, 1996), é
necessário que haja condições
adequadas.
No contexto laboratorial, o
crescimento é condicionado a um meio
de cultura, isto é, um conjunto de
substâncias, nutrientes, que atendem as
exigências para a multiplicação e
formação de colônias bacterianas.
Os meios de cultura podem ser
líquidos, sólidos ou semi-sólidos.
Tomemos neste momento o meio sólido
em placa de Petri. Eles podem ser
sintéticos, diferenciais, seletivos ou
complexos, dependendo do que se
deseja com a prática, meios complexos
possuem nutrientes que são
reconhecidamente importantes para
várias bactérias, enquanto que os
seletivos são voltados para um tipo de
bactéria determinada (TRABULSI;
TOLEDO, 1996).
A amostra de material biológico
semeada por espalhamento de
superfície em placa de petri com meio
de cultura sólido, após diluição 1:100, e
incubada por 24 horas a 36,5ºC
apresenta o crescimento bacteriano em
colônias.
As colônias de bactérias se
diferem entre si em alguns aspectos
como tamanho, estrutura, brilho, forma,
elevação, bordas e cor, este último tem
maior correlação com o meio de cultura,
não do tipo de bactéria exclusivamente.
O tamanhos das colônias varia de
grande (>1mm), médio (1mm) e
pequenas (<1 mm), já sua estrutura
pode ser lisa, granulosa, filamentosa e
rugosa.
De acordo com o brilho, são
segregadas em transparente, as quais se
pode enxergar do outro lado da placa,
opaca quando não se vê através da
colônia, e translúcida, quando com
auxílio da luz é possível visualizar o
outro lado (MOCELIN, 2016).
Relacionada a forma, se
apresentam em puntiforme, vários
pontos de diferentes tamanhos; Circular,
reunidas no formato de um círculo;
Filamentosa, com crescimento nas
bordas parecidas com filamentos;
Irregulares, não têm formato específico;
Rizoide, vários prolongamentos,
parecidos com raízes; e Fusiforme,
ovalados com pontas finas.
E sua elevação se dá em Plana,
reta e próximo ao meio; Elevada, reta e
mais alta que o meio; Convexa,
crescimento circular para cima;
Crateriforme, presença de “buracos”,
crateras na superfície; e Papilada com
pequenas protuberâncias (C MERA,
2013).
Por último, podem ser
diferenciadas também pelas suas
bordas, as quais podem ser inteira,
crescimento regular em toda extensão
da colônia e bordas bem definidas em
forma de círculo; ondulada, crescimento
regular em toda extensão da colônia e
bordas mal definidas próxima a um
círculo; lobulada, crescimento regular
em toda extensão da colônia e bordas
muito irregulares, sem apresentar
formato específico; ou filamentosa,
crescimento em riscos, filamentos, como
raízes. Espiral: como riscos em espiral (C
MERA, 2013).
Esfregaço e Coloração de Gram
A partir do crescimento de
colônias bacterianas na placa de Petri é
possível fazer o preparo de lâminas
microscópicas. Na realização de um
preparado de lâmina é necessário que se
escolham as colônias mais puras, isto é
aquelas que estão na última porção da
semeadura.
Com auxílio de alça de semeadura
em metal ou swaby, é possível fazer a
coleta de amostra da bactéria da colônia
pura e impugná-la na lâmina
(TRABULSI; ALTERTHUM, 2008) que
deve passa por processo de coloração
posteriormente.
A coloração justifica-se pelo fato
de os microrganismos serem
transparentes. O uso de técnicas de
coloração de Gram e de Ziehl-Neelsen,
por exemplo, tornam possível que seja
identificado a forma e arranjo das
bactérias presentes no esfregaço.
Essa identificação proporciona
informação sobre a periculosidade,
facilitando o diagnóstico e tratamento
de determinada doença (TRABULSI;
ALTERTHUM, 2008).
A partir da coloração é viável
observar formato, dimensão e
agrupamentos pelo microscópio.
O microscópio óptico composto é
um aparelho muito utilizado na prática
biomédica para análise precisa de
amostra de microrganismos. É um
instrumento composto por duas partes,
uma mecânica, representada por base
de sustentação e um corpo para
posicionar a lâmina, que comporta o
aparato óptico, a segunda parte do
instrumento, a qual detém um conjunto
de lentes e iluminação (OKURA, 2008).
No caso da coloração de Gram
desenvolvida pelo médico Hans
Christian Joachim Gram, com o
fundamento de que as bactérias, quando
coradas por derivados próximos da
rosanilina (violeta genciana,
cristal-violeta, etc.) e depois de tratadas
pelo iodo (iodo-iodetada, conhecida
como lugol), formam um composto de
coloração escura roxa ou azul escuro.
Este composto, nas bactérias
Gram-positivas, é fortemente retido e
não pode ser facilmente removível pelo
tratamento posterior com o álcool, ao
passo que nas Gram-negativas este
composto é facilmente descorado pelo
álcool (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1997).
Muitas explicações já foram
sugeridas na tentativa de elucidar o
mecanismo da reação de Gram, as mais
plausíveis dizem respeito à diferença na
estrutura química da parede celular.
Nas Gram-positivas há a
existência de uma espessa parede
celular (várias camadas de
peptidoglicano), além de outros
possíveis componentes, como: ácidos
teicóicos, proteínas, polissacáridos e etc,
substâncias não solúveis em álcool, que
atuam reduzindo a permeabilidade da
parede.
Já as Gram-negativas são
descoradas pelo tratamento com o
álcool, possuem uma delgada camada
de peptideoglicano, além de uma
membrana externa rica em lipídios
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1997).
Identificação do Caso
A semeadora do material
biológico nº 15 em meio sólido de ágar
CLED/Macconkey possibilitou o
crescimento de colônias nos dois meios,
indicando que se tratam de bactérias
gram-negativas, uma vez que o meio
Ágar MacConkey é seletivo para tal.
Desse modo foi possível a
visualização de aproximadamente 32
UFC/g. pequenas colônias, e uma
formação fúngica (flecha verde), no meio
Ágar MacConkey(amarelo).
No meio CLED (vermelho) foram
contabilizadas 27 UFC/g, sem
contaminação. A contagem poderia ser
maisprecisa com a utilização de
equipamento eletrônico, não disponível
na prática, a saber Contador de Colônias
eletrônico ou digital, que tem o
processamento manual, parcial ou
totalmente automatizado.
Imagem 02: Placa de petri com colônias.
Imagem 03: indicação dos pontos de
coleta de amostra.
As colônias em CLED
apresentaram forma puntiforme,
elevação convexa, margens inteiras,
tamanho pequeno, cor rósea e aspecto
granuloso. Já as colônias do MacConkey
também demonstraram formato
puntiforme e elevação convexa, mas
com margens ligadas e inteiras,
tamanho médio, cor esverdeada e
aspecto liso.
Após a contagem das colônias, foi
retirado amostra da mais protuberante e
distantes da porção contaminada por
fungos do meio MacConkey, indicada
pelo círculo roxo, para realização de
prova de catalase, a qual foi positiva,
pois houve a formação de bolhas na
lâmina.
Do CLED foi retirado amostra da
maior colônia e realizado teste em Tubo
de Rugai modificado.
O resultado do tubo de Rugai foi:
Lisina +; Movimento -; Glicose +; gás +;
Sacarose -; e indol -. Dessa forma
chegasse a conclusão que estamos
lidando com uma Enterobactéria oxidase
negativas, gram-negativa e sacarose
negativo.
Imagem 04: Prova de catalase.
Imagem 05: Provas em tubo de Rugai.
Referências
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Morfológica de Colônias em Microbiologia. [S.l.]:
Biomedicina Padrão, 2013. Disponível em:<
https://www.biomedicinapa drao.com.br/2013/0
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Acesso em:17 mar. 2021.
FEITOSA, Francisco Leydson
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São Paulo: Roca, e. 3, 2014. ISBN
978-85-4120454-5
MACVEY, Scott D.; KENNEDY, Melissa;
CHENGAPPA, M. M.. Microbiologia Veterinária.
Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, e. 3, 2016.
MOCELIN, Julio Cezar. Averiguação de
Microorganismos (Bactérias e Fungos) Presentes
em Objetos. Concórdia; FECITAC, 2016.
Disponível em:<http://fecitac.concordia.i
fc.edu.br/wp-content/uploads/sites/29/2017/10/
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OKURA, Mônica Hitomi; RENDE, José
Carlos. Microbiologia: Roteiro de Aulas Práticas.
São Paulo: Tecmedd, 2008. ISBN
978-85-99276-26-6.
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MINISTÉRIO DA SAÚDE. Programa Nacional de
Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS,
1997.
TRABULSI, Luiz Rachid, ALTERTHUM,
Flavio. Microbiologia. São Paulo: Atheneu, e. 5,
2008. ISBN 978-85-7379-981-1.
TRABULSI, Luiz Rachid; TOLEDO, Maria
Regina Fernandes de. Microbiologia. São Paulo:
Atheneu, e. 2, 1996