Isolamento e purificação de DNA genómico

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Ano letivo 2016/2017
Genética Molecular A
Docente: Alexandra R. Fernandes
Isolamento e purificação de DNA genómico
Resumo
	Na prática de investigação em biologia e na clínica é bastante importante a extracção de DNA genómico de forma eficiente. Tendo em conta a relevância da otimização deste processo, o nosso trabalho teve como objetivo avaliar o rendimento, pureza e integridade de gDNA extraído por métodos convencionais. Os resultados obtidos não permitiram concluir sobre a integridade final do DNA extraído, apenas indicando algum grau de impurezas e um baixo rendimento. Assim, algum erro na prática laboratorial terá de ser corrigido para obter uma extração mais eficiente.
Introdução 
A extração de DNA genómico é fundamental em laboratórios clínicos e de investigação1, havendo necessidade de otimizar o rendimento e custo do processo de extração/isolamento de DNA Genómico (gDNA)2. 
Existem diversos materiais biológicos que podem ser utilizados como fonte de material genético (tecidos de biopsias/secreções), sendo que o sangue periférico é de fácil obtenção. Para evitar questões éticas e burocracia, num estudo de otimização do processo é utilizado sangue de animais não humanos. Neste caso usamos sangue de Gallus gallus que sendo uma ave os seus eritrócitos são nucleados, aumentando a quantidade de DNA genómico total na amostra.
O processo de isolamento convencional inicia-se com um passo de lise celular por movimento do solvente. Este processo, controlado pela adição de sacarose (manutenção de pressão osmótica), ocorre devido à fragilização da membrana por coordenação entre os iões Mg2+ e os grupos fosfato dos fosfolípidos. A presença de Triton X-100, um agente surfactante, permite a formação das micelas ao aumentar a tensão superficial. 
Após a rutura da membrana plasmática torna-se necessária a rutura das membranas nucleares que ocorre através da criação de um gradiente de Na+. Nesta etapa é importante a adição de EDTA, um agente quelante, que irá “capturar” os iões bivalentes (Mg2+, Ca2+) inibindo a atividade de DNAses. 
Tendo as células lisadas procede-se à purificação do DNA genómico, um método melhorado através da introdução da Proteinase K3. A adição desta proteína é geralmente aliada à adição de SDS, para desnaturar as proteínas, aumentando a eficiência da Proteinase K. Seguidamente, finaliza-se a remoção de proteínas com reagentes orgânicos como fenol e clorofórmio4, tendo o fenol a capacidade de reduzir as pontes dissulforeto entre resíduos de cisteína. 
Como forma de remoção de proteínas pode ser ainda usado um processo de “salting-out” em que a adição de NaCl leva a uma competição entre o sal e as proteínas pelo solvente (água), culminando na precipitação das proteínas. Numa última fase, é importante a concentração do material genético e para o efeito é utilizado EtOH absoluto que irá diminuir a constante dieléctrica do meio e induzir a precipitação do gDNA que pode ser extraído e ressuspendido. 
Por fim, é necessário averiguar a integridade do DNA isolado através de análises quantitativas e qualitativas. Entre estas encontram-se a electroforese em gel de agarose, permite verificar a integridade, e a quantificação por espectrofotometria de UV5. 
Materiais e Métodos
O método de extração de DNA genómico a partir de sangue periférico utilizado foi igual ao protocolo6 cedido pelos docentes. Na microextração fenólica, não foi necessário adicionar 1/5 volumes de NaCl pois o DNA precipitou logo após adição de clorofórmio.
Resultados/Discussão
De acordo com o espetro UV (fig. 1), identificamos a presença de DNA, devido ao pico nos 260nm. Com os valores das absorvâncias (tabela 1) obteve-se os seguintes rácios: Abs260/280=1,75 e Abs260/230=2,46. De forma a que se possa considerar uma amostra de DNA pura estes valores devem estar dentro dos seguintes intervalos: 1,8<Abs260/280<2,0 e 1,8<Abs260/230<2,2. Estes resultados indicam que a amostra extraída está quase pura, podendo haver uma ligeira contaminação. A concentração de DNA obtida foi de 0.02 mg/ml (Concentração DNA (mg/ml)=A260/20(mg/ml)-1cm-1 * 1 cm).
	Tabela 1. Valor das absorvâncias resultantes da análise por espetroscopia de UV da amostra de DNA obtida, diluída 1:100 em TE.
 Figura 1. Gráfico do espetro do UV da amostra de DNA extraído.
 Figura 2. Electroforese em gel de agarose 0,8%; 80 Volts, 1 hora. 
Poço 1 e 10 – Marcador de peso molecular; Poço 2 a 9 – amostras de DNA genómico. A nossa amostra estava na lane 7. 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
	
A análise da electroforese (fig.2) não permite concluir com segurança o estado da integridade da DNA extraído. Apesar de ser visível uma banda no poço 7, esta é demasiado ténue para tirar conclusões quanto à sua origem. Tendo em conta a baixa concentração da amostra seria expectável uma fraca intensidade do sinal contudo, de uma forma global, todo as amostras parecem apresentar este problema o que pode indicar algum problema intrínseco à electroforese. 
Conclusão
O rendimento do procedimento de extração utilizado foi baixo com algum grau de impureza. Os resultados divergem do esperado devido a possíveis erros experimentais durante a execução do protocolo. 
Com efeito, dever-se-ia considerar possíveis ajustes ao protocolo ou a repetição do mesmo tentando corrigir eventuais erros de execução. 
Referências 
1. Chacon-Cortes D, Haupt LM, Lea RA, Griffiths LR. Comparison of genomic DNA extraction techniques from whole blood samples: A time, cost and quality evaluation study. Mol Biol Rep. 2012;39(5):5961–6.
2.Parzer S, Mannhalter C. A rapid method for the isolation of genomic DNA from citrated whole blood. Biochem J. 1991;231:229–31.
3. Blin N, Stafford DW. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes. Nucleic Acids Res [Internet]. 1976;3(9):2303–8. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=343085&tool=pmcentrez&rendertype=abstract
4. J. Grimberg, S. Nawoschik, L. Belluscio, R. McKee AT and AE. Nucleic Acids Research. Nucleic Acids Res. 1989;17(20):8073–91
5.Koshy L, Anju AL, Harikrishnan S, Kutty VR, Jissa VT, Kurikesu I, et al. Evaluating genomic DNA extraction methods from human whole blood using endpoint and real-time PCR assays. Mol Biol Rep [Internet]. Springer Netherlands; 2016;1–12. Available from: http://link.springer.com/10.1007/s11033-016-4085-9
6. Batista, P.V.; Fernandes, A.R; Isolamento e purificação de DNA genómico; Protocolo Prático – Genética Molecular A; 2016
2
Comprimento de onda (nm)230260280320
Absorvância corrigida0,1370,3370,1930,004
Comprimento de onda (nm)230260280320
Absorvância corrigida0,1370,3370,1930,004