ApostilaprticaFisiopatologiaeFarmacoterapiaII_20150225215320

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UNIVERSIDADE DE CUIABÁ
AULAS PRÁTICAS DE HEMATOLOGIA
FACULDADE DE FARMÁCIA
DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS
Cuiabá - 2014
ÍNDICE
Introdução ................................................................................................................. 3
Anticoagulantes Usados em Hematologia ................................................................ 6
Hemograma ............................................................................................................... 7
Eritrograma ............................................................................................................... 9
Leucograma ............................................................................................................. 12
Plaquetograma ......................................................................................................... 14
Contagem de Reticulócitos ..................................................................................... 26
Velocidade de Hemossedimentação ....................................................................... 27
Pesquisa de Deficiência de G6PD .......................................................................... 28
Teste de Falcização ................................................................................................ 29
Eletroforese de Hemoglobinas .............................................................................. 30
Hemostasia e Coagulação ...................................................................................... 35
Tempo de Sangramento ......................................................................................... 37
Tempo de Coagulação .......................................................................................... 38
Prova do Laço ........................................................................................................ 39
Retração do Coágulo ............................................................................................. 40
Tempo de Protrombina ......................................................................................... 41
Tempo de Tromboplastina .................................................................................... 42
Preparo de Reagentes ............................................................................................ 43
Anexos ................................................................................................................... 46
Referências Bibliográficas .................................................................................... 51
INTRODUÇÃO
HEMATOPOIESE
 A hematopoeise é um sistema organizado responsável pela produção das células sanguíneas. A formação do sangue se inicia no embrião, no segundo mês de vida, primeiramente no fígado e no baço e mais tarde, a partir do quinto mês, na medula óssea. A medula óssea é constituída por um tecido esponjoso mole localizado no interior dos ossos longos (Figura 1). É nela que o organismo produz praticamente todas as células do sangue: glóbulos vermelhos (hemácias), glóbulos brancos (leucócitos) e plaquetas. As células sangüíneas têm vida curta: os glóbulos vermelhos tem uma vida média de 120 dias, os glóbulos brancos vivem em média 1 semana, as plaquetas 9 dias. Há permanentemente células morrendo, sendo destruídas ou eliminadas e substituídas por novas células normais. Estes componentes do sangue são renovados continuamente e a medula óssea é quem se encarrega desta renovação. Trata-se portanto de um tecido de grande produção celular, em torno de 1012 de células sanguíneas/dia/Kg.
Figura 1 – Esquerda: o osso ilíaco e suas cavidades, muito usado para a coleta de medula óssea; Direita: microscopia de medula óssea em menor aumento, evidenciando o tecido hematopoiético e o tecido gorduroso associado (coloração Leishman).
 
 Todas as células sanguíneas têm origem a partir de células progenitoras na medula óssea, chamadas de células-tronco ou stem-cells. As células-tronco têm duas importantes propriedades: diferenciação e autorenovação. Diferenciação é a capacidade de, mediante estímulos específicos, se modificarem através de alterações na morfologia, passando por diferentes estágios de maturação, até virarem tipos celulares específicos, como um neutrófilo ou uma plaqueta por exemplo, prontos para exercerem função (Figura 2). 
Autorenovação é a capacidade de se duplicarem gerando novas células-tronco, de modo a nunca deixar faltar células-tronco na medula óssea.
 
 O estudo das células do sangue e suas alterações compreende uma ciência chamada de Hematologia, que se utiliza de ferramentas na forma de exames laboratoriais para tal finalidade. Entre os exames laboratoriais usados para analisar as células sanguíneas e as doenças do sangue destacam-se:
 
Eritrograma
Leucograma
Plaquetograma
Mielograma
Contagem de reticulócitos
Velocidade de hemossedimentação (VHS)
Fragilidade osmótica
Teste de falcização
Eletroforese de hemoglobinas 
Pesquisa de deficiência de G6PD
Testes bioquímicos: ferro, transferrina, ferritina, bilirrubina, folato, cianocobalamina (vitamina B12)
Testes de coagulação: tempo de sangramento (TS), tempo de coagulação (TC), prova do laço, retração do coágulo, tempo de protrombina (TAP), tempo de tromboplastina (TTP), tempo de trombina, fibrinogênio, agregação plaquetária
Testes imunohematológicos: tipagem sanguínea, Coombs direto, Coombs indireto, prova cruzada, prova reversa e fenotipagem eritrocitária
Testes parasitológicos: Pesquisa de hematozoários
Testes específicos: teste da sacarose, teste de Ham, colorações citoquímicas, cariótipagem, citometria de fluxo, dentre outros.
 Visto que alguns dos testes laboratoriais mencionados acima são realizados em setores específicos do laboratório que não o de hematologia, serão estudados nesta apostila os testes hematológicos realizados de rotina no laboratório de patologia clínica. 
ANTICOAGULANTES USADOS EM HEMATOLOGIA
 Basicamente são usados três tipos de anticoagulantes em hematologia: EDTA, heparina e citrato de sódio.
EDTA (ácido etileno-diamino-tetra-acético)
 É o anticoagulante mais usado em hematologia, geralmente na concentração de 1 a 2mg /ml de sangue. Pode ser encontrado na forma de sal de Na ou K. 
 Geralmente colhe-se 3 ml de sangue em um tubo contendo 5 mg de EDTA.
 Impede a coagulação do sangue seqüestrando cálcio, cofator necessário para ativação de vários fatores plasmáticos da coagulação. 
 Usos: hemograma, VHS, cpntagem de reticulócitos, eletroforese de hemoglobinas e provas imunohematológicas. 
Heparina
 É considerado um anticoagulante natural devido a sua presença no sangue, em quantidade inferior à necessária para evitar a coagulação do sangue recém-colhido.
 É usada na concentração de 1 gota de heparina na concentração de 5000 UI para cada 5 ml de sangue. É encontrada comercialmente na forma de heparina sódica ou de lítio.
 Age impedindo a coagulação formando um complexo com a antitrombina III, um anticoagulante natural, potencializando a sua ação.
 Usos: prova de fragilidade osmótica.
 Limitação: promove a agregação de leucócitos, não servindo para a sua contagem, nem para preparação de laminas para a hematoscopia, pois as colorações ficam azuladas.
Citrato de Sódio
 Os citratos são muito utilizados na coleta de amostras para várias provas de coagulação e também para a determinação da velocidade de hemossedimentação sanguínea.
 É usado na concentração de 3,8 %, misturando-se 1 parte (0,5 ml) do anticoagulante com 9 partes (4,5 ml) do sangue recém coletado.O mecanismo de ação do citrato de sódio é semelhante ao do EDTA: age quelando íons cálcio do plasma.
 Usos: testes de coagulação (TAP, TTP, fibrinogênio), VHS. 
 
HEMOGRAMA COMPLETO
 O hemograma completo (HC) ou simplesmente hemograma é um exame laboratorial que compreende vários parâmetros que fornecem informações importantes sobre o estado geral do indivíduo, como a presença de uma anemia, de infecções ou de alteração na imunidade, sendo por isso solicitado com freqüência pela classe médica. O HC é um exame padronizado mundialmente, de modo que um resultado feito aqui no Brasil pode ser interpretado por um clínico em outro país sem dificuldade; para tanto, deve conter três partes fundamentais:
Eritrograma – também chamado Série Vermelha, compõe os seguintes parâmetros:
Contagem de hemácias (He)
Dosagem da hemoglobina (Hb)
Dosagem do hematócrito (Ht)
Cálculo dos índices hematimétricos (VCM, HCM, CHCM)
Verificação da morfologia das hemácias ao microscópio
Leucograma – também chamado Série Branca, compõe os seguintes parâmetros:
Contagem total de leucócitos
Contagem diferencial de leucócitos
Verificação da morfologia dos leucócitos ao microscópio
Plaquetograma – também chamado Série Plaquetária, é composto por:
Contagem de plaquetas
Verificação da morfologia das plaquetas ao microscópio
 Na rotina laboratorial há basicamente três maneiras de se realizar o HC, de acordo com os recursos empregados em cada laboratório: manual, semi-automatizado ou totalmente automatizado. 
Procedimento manual:
1. Determinação do microhematócrito;
2. Dosagem da hemoglobina;
3. Contagem de hemácias;
4. Cálculo dos índices hematimétricos;
5. Realização e coloração do esfregaço sanguíneo;
6. Contagem total de leucócitos;
7. Exame microscópico: contagem diferencial de leucócitos, contagem de plaquetas e análise da morfologia; 
8. Cálculo do nº absoluto dos leucócitos. 
Procedimento semi-automatizado (contadores hematológicos):
 1. Determinação do Ht, Hb, He, VCM, HCM, CHCM, contagem de plaquetas e contagem total de leucócitos;
 2. Realização e coloração do esfregaço sanguíneo;
 3. Exame microscópico: contagem diferencial de leucócitos, análise da morfologia e confirmação dos parâmetros determinados pelo aparelho. 
Procedimento automatizado (contadores hematológicos 5 diff):
 1. Determinação do Ht, Hb, He, VCM, HCM, CHCM, RDW, contagem de plaquetas, contagem total e diferencial de leucócitos;
 2. Realização e coloração do esfregaço sanguíneo (se necessário);
 3. Exame microscópico (se necessário) para confirmação dos parâmetros determinados pelo aparelho. 
 
ERITROGRAMA
1. Contagem de hemácias
 - Homogeneizar previamente a amostra
Diluir o sangue 1/200 com líquido de Hayen : 4 ml Hayen + 20 (l sangue 
Misturar e aguardar 2 minutos
 - Preencher a câmara de Neubauer e contar o número de hemácias nos 5 quadrados pequenos (os laterais e o do meio) do quadrante central
 
 A = L x L = 0,2 x 0,2 = 0,04 mm2 x 5 quadradinhos 
 A = 0,2 mm2 
 
 Profundidade = 0,1 mm 
 
 V = A x P = 0,2 x 0,1 = 0,02 mm3
 - Cálculo:
 nº de hemácias contadas ---------- 0,02 mm3 (volume dos 5 quadradinhos)
 nº de hemácias / mm3 --------------- 1 mm3 
Nº de hemácias / mm3 = nº hemácias contadas ( 0,02 x 200 (diluição)
 
 Nº de hemácias / mm3 = nº hemácias contadas x 10.000 
2. Determinação do microhematócrito
 - Homogeneizar previamente a amostra
 - Preencher o capilar de microHt
 - Vedá-lo de um dos lados (com macinha ou na chama)
 - Centrifugar por 5 minutos na microcentrífuga
Ler o valor do microHt na tabela
3. Dosagem da hemoglobina (método cianometaemoglobina)
Homogeneizar previamente a amostra
Pipetar 5 ml de líquido de Drabkin
20 (l sangue previamente homogeneizado
Misturar e após 10 minutos ler em 540 nm, zerando com líquido de Drabkin
Calcular o valor da Hb usando um fator pré determinado 
Obs.: Amostras com lipemia podem interferir na leitura espectrofotométrica da hemoglobina; por isso, deve-se verificar o aspecto do plasma a procura de lipemia sempre que se estiver diante de um resultado de hemoglobina elevado em relação ao hematócrito. 
4. Cálculo dos índices hematimétricos
 VCM = Ht x 10 ( He < 81 = microcitose
 > 96 = macrocitose
 HCM = Hb x 10 ( He < 27 = hipocromia
 > 32 = hipercromia
 CHCM = (Hb x 10) ( (Ht x 10) < 32 = hipocromia
 > 36 = hipercromia 
5. Realização e coloração do esfregaço sanguíneo
5.1. Cuidados para a realização de um bom esfregaço sanguíneo
 - O ideal é o esfregaço realizado no momento da coleta (sem anticoagulante).
 - Esfregaço de sangue anticoagulado deve ser feito até no máximo 4 horas após a coleta, usando lâmina limpa e desengordurada.
 - Laminas suja e esfregaço mal feito produzem artefatos: má distribuição dos leucócitos falseando a contagem diferencial (por ex. falsa linfocitose), presença de equinócitos, esferócitos, hemácias em foice.
 - Esfregaços feitos com sangue velho produzem artefatos de estocagem: leucócitos com núcleo picnótico (semelhante à eritroblastos), eritrócitos com defeito de membrana (esquizócitos). 
 - Nunca se esquecer de limpar a distensora após a realização do esfregaço.
5.2. Colorações hematológicas
 - Os corantes usados em hematologia pertencem a dois grupos: 
 corantes básicos – azul de metileno 
 corantes ácidos - eosina 
 - Os corantes mais utilizados são: Leishman, Wright, May-Grunwald-Giensa e Panótico. Este último é bastante útil para exames de urgência pela rapidez de coloração (poucos segundos).
 - Coloração segundo Leishman:
 Adicionar 1 ml do corante de Leishman sob a lâmina
 Aguardar 2 a 3 minutos
 Adicionar 1 ml do tampão fosfato pH 7,0 (pode-se usar água destilada na ausência de tampão) 
 Misturar assoprando com uma pipeta e aguardar 10 a 15 minutos
 Lavar com água de torneira e deixar secar (pode-se usar secador de cabelos para acelerar o processo de secagem).
Observações:
 - Dependendo do pH do tampão ou da água destilada, a coloração pode ficar mais acidófila ou basofílica.
 - Dependendo da marca do Leishman usado e de sua concentração, pode ser necessário alterar os tempos de coloração acima descritos.
 - A lâmina após corada pode apresentar precipitados de corante ou as células podem ficar hipercoradas (podendo confundir com granulações tóxicas em neutrófilos) se o tempo de coloração for ultrapassado ou houver excesso de corante em relação ao tampão.
 - A lâmina pode ficar mal corada ou pálida se ocorrer o contrário (pouco tempo de coloração ou pouco corante), de modo que pode dificultar a visualização do núcleo e das granulações das células, dificultando sua identificação.LEUCOGRAMA
1. Contagem total de leucócitos
 - Homogeneizar previamente a amostra
Diluir o sangue 1/20 com líquido de Turk: 380 (l Turk + 20 (l sangue
Misturar e aguardar 5 minutos
 - Preencher a câmara de Neubauer e contar o número de leucócitos nos 4 quadrantes laterais (1, 3, 7 e 9) :
 
 A = L x L = 2 x 2 = 4 mm2 
 
 Profundidade = 0,1 mm 
 
 V = A x P = 4 x 0,1 = 0,4 mm3
 - Cálculo:
 nº de leucócitos contados ---------- 0,4 mm3 (volume dos 4 quadrantes)
 nº de leucócitos / mm3 --------------- 1 mm3 
 Nº de leucócitos / mm3 = nº leucócitos contados ( 0,4 x 20 (diluição)
 
 Nº de leucócitos / mm3 = nº leucócitos contados x 50 
2. Contagem diferencial de leucócitos
 - Para uma correta contagem diferencial dos leucócitos, é imprescindível que o esfregaço sanguíneo esteja bem feito e bem corado. 
 - Deve-se contar 100 células na região da cauda do esfregaço, sendo 25 na lateral, 50 no centro e 25 na outra lateral, expressando o resultado em percentagem.
 - Verificar presença de alterações na morfologia dos leucócitos. 
 - Tendo a contagem total de leucócitos (/mm3) e a contagem diferencial em percentual, calcula-se a quantidade em mm3 de cada leucócito. 
Observações:
 - Eritroblastos são comuns no sangue do recém-nascido (RN) e podem ser vistos em grande número nas doenças hemolíticas. Os eritroblastos são contados como leucócitos nos contadores eletrônicos; quando acima de 5% das células nucleadas, justifica-se desconta-los. Usa-se uma fórmula para correção de leucócitos, quando em presença de eritroblastos na lâmina: 
 (Leucócitos x 100) ( (Eritroblastos + 100) = No de leucócitos verdadeiro 
Ex.: foram anotados 20 eritroblastos durante a observação dos 100 leucócitos. Se a contagem de leucócitos obtida for 7.200/mm3, a contagem corrigida será 7.200 x 100 ( 120 = 6.000/mm3. Neste caso, deve-se citar no laudo: contagem corrigida. 
 - Ter como hábito ao realizar a hematoscopia verificar se a contagem de leucócitos é compatível com a quantidade de células distribuídas pela lâmina.
 - Quando a contagem de leucócitos der muito alta (p. ex. > 60.000), verificar a espessura da bufy coat no capilar de Ht ou no tubo após o sangue sedimentar. Repetir a contagem usando amostra diluída quando a contagem de leucócitos ultrapassar a linearidade do equipamento. 
PLAQUETOGRAMA
1. Contagem de plaquetas
1.1. Contagem em lâmina (método de Fônio)
Contar o nº de plaquetas em vários campos (10, 20, 30, etc).
Dividir pelo nº de campos para ter a média do nº de plaquetas/campo.
Multiplicar por 5.
Multiplicar pelo nº de hemácias.
1.2. Contagem em câmara (Neubauer)
1.2.1. Técnica para contagem de plaquetas no plasma
 - Em um tubo de Khan adicionar: 1 ml salina, 10 (l formol e 20 (l plasma (obtido aproximadamente 1mm acima da camada de leucócitos, após sedimentação do sangue)
 - Esperar 5 minutos e carregar a câmara
 - Contar o nº de plaquetas nos 25 quadradinhos do quadrante central ou contar em 5 quadradinhos (das esquinas e central) e multiplicar por 5
 - Cálculo: nº plaquetas/mm3 = (100 – Ht) x 5 x Y
 - Ex.: contou-se 52 plaquetas em 5 quadradinhos. 52 x 5 = 260 = Y; Ht = 33
Nº plaquetas = (100 – 33) x 5 x 260 = 87.000/mm3 
1.2.2. Técnica para contagem de plaquetas no sangue total
 - Diluir o sangue (previamente homogeneizado) 1/200 com o líquido de contagem de plaquetas: 4 ml líquido + 20 (l sangue
 - Misturar e aguardar 2 minutos 
 - Preencher a câmara de Neubauer
 - Contar o nº de plaquetas nos 5 quadradinhos (das esquinas e central) do quadrante central e multiplicar por 10.000.
Observações:
 - Quando a contagem de plaquetas é feita por equipamento automatizado, nunca se deve confiar plenamente da contagem de plaquetas do aparelho quando o valor estiver grifado, houver microcitose significativa ou plaquetopenia. Nesses casos deve-se sempre confirmar pela análise das plaquetas em lâmina ou na câmara de Neubauer.
 - Lembre-se de que plaquetas são as menores células sanguíneas, e sujeira nas tubulações dos equipamentos pode falsear a contagem para mais.
 - Pacientes de UTIs freqüentemente apresentam plaquetopenia; no caso de RN, estar sempre atento quanto à presença de microcoágulos.
 - Quando houver plaquetopenia, verificar se existem macroplaquetas.
INTERPRETAÇÃO DO HEMOGRAMA
1. Eritrograma
Cont. hemácias ( = poliglobulia: primária = Policitemia rubra vera (PRV)
 Secundária = hipóxia - altitude elevada, cardiopatia 
 Cianótica, hipersecreção de eritropoetina 
 ( = anemia
Hb ( = poliglobulia
 ( = anemia
Ht ( = poliglobulia
 ( = anemia
1.1. Classificação laboratorial das anemias
	
	VCM
	HCM
	Microcítica hipocrômica
	
	
	Normocítica normocrômica
	
	
	Macrocítica
	
	
 
1.1.1. Alterações de tamanho
 - Anisocitose 
 - Microcitose
 - Macrocitose
 - Dimorfismo
1.1.2. Alterações de hemoglobinização
 - Hipocromia
 
 - Hipercromia
 - Policromasia
1.1.3. Alterações de forma
 - Drepanócito
 - Codócito
 - Equinócito
 - Esquizócito.
 - Acantócito
 - Esferócito
 - Eliptócito
 - Dacriócito
 - Estomatócito
 - Hemácias fragmentadas 
 - Queratócito (célula mordida) 
 - Hemácias em “roleaux” 
1.1.4. Inclusões eritrocitárias
 - Pontilhado basofílico
 - Corpúsculo de Howell-Jolly
 - Corpúsculo de Pappenheimer 
 
 - Parasitas da malária
1.2. Classificação etiológica das anemias
 = Hemorrágicas
 Agudas: traumatismos, grandes cirurgias (normo/normo) 
 Crônicas: sangramentos crônicos (micro/hipo) 
 = Hemolíticas
 Intravascular
 - Mecânica: próteses, CID, vasculites
 - Osmótica: água destilada, embolia
 - Química: drogas oxidantes, venenos de cobra, toxinas bacterianas
 - Térmica: queimaduras graves
 - Reações: isoanticorpos, hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) 
 Extravascular
 - Adquirida: infecções, drogas oxidantes, auto-imune, transfusão incompatível 
 - Defeitos de membrana: esferocitose, eliptocitose, piropioquilocitose
 - Enzimopatias: deficiência de G6PD, PK, SOD, GPx
 - Hemoglobinopatias: Hb variantes e talassemias
 = Hipoproliferativas
 Constitucional: deficiência de FI, deficiência de transferrina
 Carenciais: deficiência de ferro, B12, ácido fólico
 Sideroblástica: adquirida, hereditária
 Deficiência de eritropoetina
 Aplasia de medula óssea 
 = Secundária a outras doenças
2. Leucograma
 - Neutrofilia = infecções bacterianas agudas e crônicas, algumas infecções virais (varicela, herpes, raiva, poliomielite,hantavírus), algumas infecções fúngicas (coccidioidomicose, actinomicose e algumas infecções por P. carinii), algumas parasitoses (F. hepática, amebíase hepática, filaríase), dano tecidual (trauma, cirurgia, queimadura, infarto), inflamação aguda e crônica, hemorragia e hipoxia agudas, desordens endócrinas e metabólicas, doenças malignas (principalmente quando há doença extensa), Leucemia Mielóide Crônica (LMC), PRV, mielofibrose, trombocitemia essencial, administração de citoquinas, adrenalina, corticóides, tabagismo, exercício vigoroso, dor aguda, convulsões, choque elétrico, eclâmpsia.
 - Neutropenia = infecções virais (sarampo, caxumba, rubéola, influenza, hepatite, mononucleose, citomegalovírus (CMV), febre amarela, dengue, parvovírus, AIDS em estágio avançado), infecções bacterianas (febre tifóide, brucelose, no início de algumas infecções por Gram-negativos, infecção bacteriana avassaladora, infecção bacteriana em RN), infecção por protozoários (malária, calazar, tripanossomíase), infecções fúngicas, irradiação, pós-quimioterapia, interferon, antiretrovirais, substituição da medula óssea por neoplasia, anemia megaloblástica, anemia aplásica, hiperesplenismo, neutropenia associada a doenças auto-imunes, desordens endócrinas (hipopituitarismo, hipertireoidismo), alcoolismo, doença hemolítica do recém-nascido (DHRN). 
 - Eosinofilia = infecções parasitárias (helmínticas), doenças alérgicas (eczema atópico, rinite, asma, urticária, infecções fúngicas broncoalérgicas), hipersensibilidade medicamentosa, pênfigo, doença de Hodgkin, administração de citoquinas, miscelânea (recuperação de algumas infecções bacterianas e virais, escarlatina, tuberculose, algumas infecções fúngicas, LMC).
 - Eosinopenia = estresse agudo (trauma, cirurgia, queimaduras, infecções e inflamações agudas), acompanha neutrofilia relativa e absoluta.
 - Linfocitose = infecções virais (sarampo, rubéola, caxumba, varicela, influenza, hepatite, mononucleose, adenovírus, CMV, HIV), certas infecções bacterianas (coqueluche, brucelose, tuberculose, sífilis, infecções bacterianas em lactentes e crianças pequenas), estresse, tabagismo, exercício vigoroso, convulsão, administração de citoquinas, adrenalina, reações alérgicas a drogas, fase de cura de infecções agudas, leucemias linfóides e desordens linfoproliferativas.
 - Linfócitos atípicos = infecções virais, algumas infecções bacterianas (tuberculose, brucelose, sífilis, Mycoplasma pneumoniae), infecções protozoáricas (toxoplasmose, malária), imunizações, hipersensibilidade a drogas, LES.
 - Linfocitopenia = estresse agudo, carcinoma avançado, AIDS terminal, irradiação, imunossupressão, alcoolismo, artrite reumatóide (AR) e LES, anemia aplásica, SMD.
 - Monocitose = infecções crônicas, inflamações crônicas (AR, LES, doença de Crohn), carcinoma, administração de citoquinas, regeneração medular após quimioterapia, LMA subtipo M5, algumas SMD, LMC, algumas infecções parasitárias.
 - Monocitopenia = fase aguda processos infecciosos, falta de reação do sistema reticuloendotelial (inanição).
 - Basofilia = desordens mieloproliferativas (LMC, PRV, mielofibrose, trombocitemia).
 - Pancitopenia = anemias aplásicas e hipoplásicas (idiopática, induzida por vírus, drogas e agentes químicos), infiltração da medula óssea, SMD, anemia megaloblástica, AIDS, LES, hiperesplenismo. 
3. Plaquetograma
 - Trombocitose: 
 Primária
 Secundária
 
 - Trombocitopenia:
 Produção diminuída
 Destruição aumentada
RELATÓRIOS DA HEMATOSCOPIA
 Relatar presença de anemia, leucocitose, desvio a esquerda, eosinofilia relativa, etc, é errado !! O clínico tem obrigação de saber isso ao comparar o resultado com os valores de referência (seria a mesma coisa que escrever ao lado do resultado da dosagem de glicose: presença de hiperglicemia !!). 
 Só deve ser relatado como observação no hemograma aquilo que o clínico não vê no laudo.
 
1. Relatórios da série vermelha
 Após a realização das determinações citadas, deve-se observar a lâmina corada e relatar as alterações caso presentes. A seqüência do relatório da série vermelha é a seguinte: 
1º relatar alterações de tamanho: anisocitose, microcitose, macrocitose.
2º relatar alterações de cor: hipocromia, policromasia.
3º relatar alterações de forma: poiquilocitose, especificando os tipos celulares (acantócito, esferócito, eliptócito, hemácia em alvo, hemácia falcizada (drepanócito), dacriócito, esquisócito, hemácia fragmentada, queratócito (hemácia mordida), equinócito). 
4º relatar presença de inclusões: corpúsculo de Howell-Jolly, pontilhado basofílico, parasitas da malária.
5º relatar presença de eritroblastos, especificando o nº contado em 100 leucócitos.
Obs.: Em relação aos três primeiros itens, deve-se especificar se discreta, moderada ou acentuada; em relação aos tipos celulares anormais, especificar se alguns, vários ou numerosos.
Ex.: Anisocitose, microcitose e hipocromia acentuadas. Policromasia moderada. Poiquilocitose moderada com várias hemácias em alvo, esquisócitos e eliptócitos. Presença de pontilhado basofílico em algumas hemácias. Presença de 3 eritroblastos em 100 leucócitos.
2. Relatórios da série branca
 Deve ser relatado somente as alterações qualitativas dos leucócitos: 
 - Granulações tóxicas
 - Vacuolização citoplasmática
 
 - Hipersegmentação de neutrófilos
 
 - Hiposegmentação de neutrófilos
 - Bastonete de Auer
3. Relatórios da série plaquetária
 - Macroplaquetas 
 - Plaquetas gigantes
Obs.: Quando o tunrover plaquetário está aumentado, como na púrpura trombocitopênica imunológica (PTI), as plaquetas são usualmente grandes. Conseqüentemente, ausência de plaquetas grandes em pacientes com trombocitopenia tem importância diagnóstica: sugere que haja um defeito da produção. 
VALORES DE REFERÊNCIA
	
	Cordão umbilical
	24 a 72 hs
	1 semana
	Até 6 anos
	6 a 13 anos
	Adultos
	
	
	
	
	
	
	Homem
	Mulher
	Eritrócitos (106/(l)
	4,2-5,2
	5,0-6,5
	4,5-6,0
	4,0 a 5,5
	4,5-5,5
	4,5-6,0
	4,0-5,0
	Hb (g/dl)
	13,0-21,0
	15,0-24,0
	13,8-19,0
	10,0-14,0
	13,5-14,5
	13,5-17,5
	12,5-16,0
	Ht (%)
	43-60
	50-66
	45-62
	28-42
	40-50
	40-52
	37-47
	VCM (fl) 
	106-115
	96-110
	90-100
	70-85
	80-96
	80-98
	HCM (pg)
	32-34
	35-41
	30-35
	25-32
	27-34
	27-34
	CHCM (%)
	30-33
	32-36
	31-36
	31-36
	31-36
	31-36
	Leucócitos/(l
	9-31 mil
	7-31 mil
	6-20 mil
	6-17 mil
	4-14 mil
	3,8 –11 mil
	Mielócitos
(% e (l)
	0-2
0-600
	ocasional
	0
	0
	0
	0
	Metamielócitos
(% e (l)
	0-2
0-600
	0-2
0-620
	0-2
0-400
	0
	0
	0
	Bastonetes
(% e (l)
	4-11
360-2.000
	4-11
280-2.000
	2-5
120-1.500
	0-5
0-850
	0-5
0-700
	0-5
0-550
	Segmentados
(% e (l)
	40-70
5.000-15.000
	35-80
2.500-24.000
	30-50
1.800-10.000
	20-50
1.200-8.500
	30-60
1.200-6.600
	40-70
1.600-7.700
	Neutrófilos
(% e (l)
	49-85
5.800-18.200
	40-93
2.800-26.500
	33-57
2.000-11.400
	20-54
1.200-9.100
	30-64
1.200-7.160
	40-74
1.600-8.140
	Eosinófilos
(% e (l)
	1-4
200-1.200
	1-4
200-1.200
	1-6
100-2.000
	1-5
60-850
	1-5
40-700
	1-5
40-550
	Basófilos
(% e (l)
	0-3
0-400
	0-3
0-400
	0-3
0-400
	0-3
0-400
	0-3
0-400
	0-3
0-330
	Linfócitos
(% e (l)
	20-36
2.000-10.000
	20-58
2.000-15.000
	40-80
2.000-17.000
	40-85
2.500-14.500
	30-70
1.200-8.500
	20-50
1.000-4.500
	Monócitos
(% e (l)
	3-9
270-2.000
	6-13300-9.700
	6-13
300-2.700
	2-10
120-1.700
	2-10
80-1.200
	2-10
80-1.100
	Plaquetas/(l
	150.000-400.000
AUTOMAÇÃO EM HEMATOLOGIA
 Atualmente, as determinações que compõe o hemograma são realizadas em minutos por instrumentos automatizados ou semi-automatizados, com modificações das técnicas manuais ou tecnologias complementares novas. 
 As determinações são reprodutíveis, isto é, repetições da mesma amostra dão resultados praticamente iguais (menor coeficiente de variação em relação às técnicas manuais). Se os instrumentos estiverem cuidadosamente aferidos (calibrados) e o sangue não tiver características pouco usuais, as determinações também são exatas (ou acuradas), isto é, os resultados aproximam-se muito do valor verdadeiro. 
 O hemograma é subjetivo no que se refere a microscopia; a contagem diferencial automatizada (contadores 5 diff) diminui a subjetividade, se a celularidade for normal. 
 Um pré-requisito fundamental para quem trabalha com equipamentos automatizados é a “intimidade” do operador com o equipamento. É necessário que o bioquímico conheça e entenda o funcionamento (princípios técnicos) do equipamento o suficiente para confiar em seus resultados, e para isso é preciso que o aparelho esteja calibrado (uso de controles internos) e com os procedimentos de manutenção em dia.
 Um erro comum é confiar cegamente no resultado fornecido pelo equipamento automatizado. Ocorre que quanto mais alterada estiver a amostra (quanto mais a amostra se distancia do normal), mais difícil fica para o equipamento fazer uma interpretação correta; ocorre sobreposição das contagens (principalmente entre hemácias e plaquetas na presença de microcitose intensa), contagens incorretas (células mielóides imaturas contadas como monócitos, blastos contados como basófilos, monócitos e linfócitos, sujeira nas tubulações falseando o nº de plaquetas). Por isso até hoje o equipamento não substitui o bioquímico. 
 As células sangüíneas são más condutoras de eletricidade. Quando uma coluna de células em um meio condutor passa por uma pequena abertura pela qual circula uma corrente elétrica, há um aumento mensurável da impedância elétrica na abertura à medida que cada célula passa; esse aumento é proporcional ao volume de material condutor deslocado, portanto, ao volume celular. Dessa forma, são contadas e medidas as células a partir dos impulsos elétricos que geram. Este é o princípio da contagem por impedância, idealizado e desenvolvido por Wallace Coulter, nas décadas de 40 e 50, iniciando a era moderna da contagem automatizada das células sangüíneas. 
 Princípios análise:
 - Impedância: nº de pulsos = nº de células (hemácias, leucócitos, plaquetas)
 Amplitude dos pulsos = volume celular
 - Volumetria: 2-20 fl = plaquetas
 35-90 fl = linfócitos
 90-160 fl = mononuclares 3 diff 
 160-460 = granulócitos 
 - Espectrofotometria: Hb (cianometaHb, lauril-sulfato)
 - Radiofreqüência: volume da granularidade interna pela estrutura celular
 - Dispersão (scatter) de raios laser: pela superfície celular e granulações internas
 - Citoquímica: peroxidase (Technicon), eosinofixadores (Abx)
 Algumas marcas de contadores hematológicos automatizados e seus princípios:
Coulter: sistema VCS (volumetria, condutividade e dispersão de raio laser);
Abx: impedância, citoquímica e citometria de fluxo;
Abbott: impedância, espectrofotometria e dispersão de raio laser;
Bayer (Technicon): citoquímica, dispersão de raio laser.
1. Novos parâmetros hematológicos: 
 - IDE (índice de distribuição eritrocitária) ou RDW (red cell distribution width): índice de anisocitose; aumentado quando há anisocitose, aumenta bastante em presença de dupla população eritrocitária. 
 - HDE (índice de distribuição hemoglobínica) ou HDW (hemoglobin distribution width): índice de variação de hemoglobinização dos eritrócitos, índice de hipocromia.
 - IDP (índice de distribuição plaquetária) ou PDW (platelet distribution width): índice de anisocitose de plaquetas; aumentado quando há displaquetopoiese e quando há macroplaquetas.
 - VPM: volume plaquetário médio.
 - ALY: presença de linfócitos atípicos.
 - LIC: “large immature cells”, presença de grandes células imaturas (mielócitos, pró-mielócitos, blastos).
2. Detecção de erros nas contagens automatizadas de glóbulos 
Causais gerais de contagens sangüíneas automáticas inexatas:
 - Erro de coleta: 
 Sangue do paciente errado (troca de pacientes ou de tubos durante a coleta) 
 Amostra diluída: excesso de EDTA para pouco sangue; colhida acima de uma infusão endovenosa
 Amostra parcialmente coagulada
 Amostra hemolisada
 - Erro de armazenamento: 
 Amostra inadvertidamente aquecida (p. ex. algumas horas dentro de um veículo fechado ao sol) ou congelada.
 Sangue velho 
 - Erro na realização: 
 Homogeneização inadequada
 Volume inadequado da amostra
 Má calibração do aparelho 
 Erro na aspiração da amostra (p. ex. por um coágulo da amostra anterior)
 Falta de manutenção (sujeira na tubulação)
	Principais causas de erros nas contagens automatizadas
	Parâmetro
	Falsamente elevado
	Falsamente diminuído
	Eritrócitos
	Cont.leucócitos muito alta
	Hemólise “in vitro”, crioaglutininas, aglutinação EDTA dependente
	Hb
	Lipemia, cont. leucócitos muito alta 
	-
	VCM
	Crioaglutininas, aglutinação EDTA dependente
	- 
	Leucócitos
	Eritroblastos, falta de lise dos eritrócitos (amostras fetais e neonatais, paraproteína), muitas plaquetas gigantes, parasitas da malária
	
Sangue colhido a mais de três dias, crioaglutinina 
	Plaquetas
	Microcitose intensa ou fragmentos de eritrócitos, sujeira nas tubulações 
	Coagulação parcial da amostra, agregados plaquetários, agregação EDTA dependente 
	Linfócitos
	Eritroblastos, parasitas da malária
	-
	Monócitos
	Linfócitos grandes, desvio à esquerda, parasitas da malária 
	-
CONTAGEM DE RETICULÓCITOS
 Reticulócitos são hemácias recém liberadas da medula óssea para o sangue e que no indivíduo sadio correspondem a 0,5 a 2,0 % das hemácias circulantes. Eles diferenciam-se das hemácias adultas por ainda conterem resquícios de RNA, produzindo Hb em cadência lenta, e tornam adultos em 1 a 2 dias na circulação. Este RNA é revelado pela coloração supra-vital com o azul cresil brilhante na forma de retículos intra-eritrocitários.
 Reticulocitose é resposta da medula a uma perda periférica aumentada (anemia hemolítica aumentada ou hemorragia aguda) ou resposta terapêutica. Quando houver policromasia acentuada (com eritroblastos ou não), pode haver franca reticulocitose, podendo chagar a 30%, 40% ou mais.
 Reticulocitopenia é sinal de falta de resposta medular, e pode ocorrer em inflamações (principalmente doenças crônicas), insuficiência renal, aplasia medular, SMD e mielofibrose ou ser um sinal inicial de infiltração medular (leucemia ou metástase). 
 Método: azul cresil brilhante. 
 Amostra: sangue total com EDTA.
 Procedimento:
 - Em um tubo pequeno adicionar quantidades iguais de sangue previamente homogeneizado e do corante azul cresil bilhante.
 - Homogeneizar e colocar em BM 37°C por 15 minutos.
 - Após fazer um esfregaço sangüíneo.- Contagem: na objetiva de imersão contar o nº de reticulócitos em vários campos e dividir pelo nº de campos. 
 Valores de referência:
 Recém-nascidos = 2,5 a 6,5 %
 Adultos = 0,5 a 2,0 %
 
VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO
 A hemossedimentação, eritrossedimentação ou velocidade de hemossedimentação (VHS) mede o tempo que os glóbulos vermelhos levam para sedimentarem em um tubo colocado verticalmente. 
 A presença de proteínas estranhas interfere na VHS porque elas irão anular as cargas das hemácias no sangue normal. As hemácias não se empilham normalmente porque elas possuem cargas iguais e se repelem, mas em presença de proteínas estranhas, estas anulam as cargas das hemácias que formarão pilhas de células denominadas “rouleaux”. Albumina e betaglobulinas não interferem na VHS; fibrinogênio, alfa1, alfa2 e gamaglobulinas em quantidades aumentadas favorecem o empilhamento eritrocitário. Nas infecções agudas há aumento de alfa1, alfa2 e fibrinogênio; nas infecções crônicas há aumento de gamaglobulinas; nas neoplasias há aumento de alfa2. Anemia acelera a VHS porque existe um número reduzido de hemácias. 
 A VHS aparece aumentada em: anemias, moléstias acompanhadas de agressões tissulares, processos inflamatórios e infecciosos, neoplasias, menstruação e colagenoses. Pode atingir valores bastante elevados dependendo da magnitude da doença; LES e mieloma múltiplo podem cursar com 100 mm ou mais de VHS. 
 Apesar de inespecífico, sua utilidade maior está no acompanhamento da evolução da doença, diminuindo com a melhora do processo inflamatório. 
 Amostra: sangue total com EDTA.
 1º Método: Westergreen. 
 Procedimento:
 - Homogeneizar o sangue e completar o tubo de Westergreen até a marca superior.
 - Colocar o tubo em posição vertical na estante apropriada e deixar por 60 minutos. 
 - Após este período, realizar a leitura da sedimentação dos eritrócitos expressando o resultado em mm.
 
 2º Método: Vesmatic
 Procedimento:
 - Homogeneizar o sangue e completar o tubo vesmatic até a marca. 
 - Ligar o aparelho e esperar que ele inicialize.
 - Colocar o tubo no carrossel do aparelho, apertar F1 (VHS 1 hora) e apertar RUN.
 Valores de referência:
 Homem = até 15 mm/hora
 Mulher = até 20 mm/hora 
 
PESQUISA DE DEFICIÊNCIA DE G6PD
 A deficiência de glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD) é uma enzimopatia ligada ao cromossomo X, portanto muito mais freqüente no sexo masculino; a mulher se comporta como portadora do gene e o transmite a seus filhos homens, que manifestam a doença. 
 A G6PD é uma enzima que faz parte do metabolismo aeróbico da glicose do eritrócito cuja deficiência produz um defeito na eliminação do peróxido e desnaturação da hemoglobina, com conseqüente hemólise. A deficiência de G6PD é o defeito enzimático mais comum do mundo, afetando cerca de 400 milhões de pessoas.
 O teste é utilizado para triagem de quadros de hemólise de etiologia desconhecida, que podem ser desencadeados por infecções virais, bacterianas, uso de drogas oxidativas e distúrbios metabólicos como a acidose. 
 Este teste envolve a oxidação da Hb (Fe+2) pelo nitrito de sódio em metaHb (Fé+3) e posterior reconversão enzimática em Hb na presença de azul de metileno que ativa a enzima metahemoglobina redutase se a G6PD tiver atividade normal. 
 Método: Brewer (redução da metahemoglobina).
 Amostra: sangue total com EDTA.
 Procedimento:
 - O exame deve ser realizado até 3 horas após a coleta
 - Identificar três tubos de ensaio: A, B, C
 Tubo A = padrão normal
 Tubo B = padrão positivo
 Tubo C = desconhecido
	
	Tubo A
	Tubo B
	Tubo C
	Sangue
	200 (l
	200 (l
	200 (l
	Nitrito de sódio 0,18 M
	-
	10 (l
	10 (l
	Glicose 0,28 M
	-
	10 (l
	10 (l
	Azul de metileno 0,0004 M
	-
	
	10 (l
 - Homogeneizar e incubar em BM 37°C por 3 horas.
 - Após transferir 100 (l de cada tubo para outros 3 tubos A, B, C contendo 10 ml de água destilada cada e homogeneizar.
 - Interpretação: tubo A (padrão normal) cor avermelhada; tubo B (padrão positivo) cor castanha; tubo C (desconhecido) cor variável desde o vermelho (teste normal) ao castanho (deficiente de G6PD).
 Valor de referência: não deficiente
TESTE DE FALCIZAÇÃO
 O fenômeno da falcização trata de uma reorganização das moléculas de Hb em estado reduzido, formando longas cadeias denominadas tactóides, isto é, massas cristalinas. In vitro, o fenômeno é demonstrado pelo uso de agentes redutores como o ditionito de sódio e o metabissulfito de sódio. In vivo a falcização ocorre pela baixa tensão de oxigênio nos capilares, levando ao aparecimento de hemácias falciformes circulantes, o que ocasiona anemia hemolítica e crises vaso-oclusivas. 
 As hemácias contendo Hb S sofrem falcização e precipitação em presença de ditionito de sódio, levando a formação de um precipitado no papel de filtro.
 Método: Ditionito de sódio ou método da mancha.
 Amostra: sangue total com EDTA.
 Procedimento:
 - Pipetar 100 (l de tampão HbS e 10 (l do sangue previamente homogeneizado.
 - Colocar uma pitada de ditionito de sódio (Na2S2O4) e homogeneizar.
 - Pingar 1 gota em papel de filtro.
 - Interpretação: um resultado positivo é observado quando a Hb se precipita no centro da gota, formando uma mancha redonda (lembrando um alvo). Falcização positiva ocorre em indivíduos AS, SS, SC e outras interações da Hb S.
 - Devem ser empregados controles positivos (AS, SS) e negativos com sangues recentes.
 Valor de referência: negativo
 
 
ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS
 A eletroforese de hemoglobina é composta pelas seguintes análises:
Resistência Globular Osmótica em NaCl 0,36%
Eletroforese alcalina em acetato de celulose
Eletroforese ácida em ágar fosfato
Dosagem de hemoglobina A2
Dosagem de hemoglobina fetal
Dosagem de hemoglobinas variantes
Pesquisa de hemoglobina H
Resistência Globular Osmótica em NaCl 0,36%
 Os eritrócitos microcíticos presentes nos portadores de talassemia beta heterozigota são mais resistentes à hemólise em NaCl 0,36% que os eritrócitos normais. Esse método não é específico para talassemia beta heterozigota, pois resultados positivos são encontrados também em anemias carenciais e outras hemoglobinopatias, como os heterozigotos para hemoglobina C. Cerca de 97% dos portadores de beta talassemia beta heterozigota apresentam positividade para o teste.
 Método: Silverstroni & Bianco.
 
 Amostra: concentrado de hemácias com EDTA. 
 Procedimento:
 - Pipetar 2,0 ml de NaCl a 0,36% e 20 (l de concentrado de hemácias. 
 - Homogeneizar e aguardar 10 minutos.
 - Leitura: colocar o tubo a 2,0 cm de uma folha de papel branca com linhas negras. A resistência aumentada (ou positiva) à hemólise do eritrócito torna a amostra opaca e não visualiza-se as linhas negras. Em amostras com resistência normal à hemólise visualiza-se facilmente as linhas através da solução.
 Valor de referência: Negativo.
Eletroforese Alcalina em Acetato de Celulose pH 8,6
 A eletroforese alcalina em pH 8,6 é utilizadapara qualificação e quantificação de hemoglobinas normais e anormais. As diferentes motilidades eletroforéticas das hemoglobinas anormais são originadas por alteração de carga elétrica, causada por substituição de aminoácidos de diferentes pontos isoelétricos nas cadeias formadoras das moléculas. Assim, por esse método as hemoglobinas normais e grande parte das anormais são separadas. Para a realização da eletroforese alcalina em acetato de celulose utiliza-se soluções de hemoglobina obtidas através de hemolisado com saponina à 1%.
 Método: Marengo & Rowe.
 Amostra: sangue total com EDTA.
 Procedimento:
 - Embeber as fitas de acetato de celulose em tampão TEB pH 8,5.
 - Secar as fitas entre duas folhas de papel absorvente e colocá-las na cuba de eletroforese, conectando-as com os compartimentos eletrolíticos.
 - Aplicar as amostras de hemoglobinas a 1,0 cm da extremidade da fita que está em contato com o pólo negativo.
 - Passar 300 volts por 40 minutos.
 - Analisar as frações. 
 Valor de referência: AA.
Eletroforese em Ágar-Fosfato ph 6,2
 A eletroforese em gel de ágar fosfato pH 6,2 é específica para diferenciar alguns tipos de hemoglobinas mais lentas que a hemoglobina A, por exemplo: Hb S e Hb D; Hb C e Hb E que em eletroforese alcalina, migram em posições semelhantes, dificultando a caracterização. Por esse método, as hemoglobinas S e C se separam da hemoglobina A, enquanto as hemoglobinas D e E migram na mesma posição da hemoglobina A. esse método permite a caracterização semi quantitativa de hemoglobina Fetal.
 Método: Vella. 
 Amostra: sangue total com EDTA.
 Procedimento:
 - Aplicar as amostras de hemoglobinas a 1,0 cm da marca do gel voltado para o pólo positivo.
 - Passar 100 a 150 volts por 40 minutos.
 - Analisar as frações. 
 Valor de referência: AA.
Dosagem de Hemoglobina A2
 O aumento de A2 na grande maioria das vezes está associado às talassemias beta heterozigotas. Porém, em algumas condições patológicas, muitas de origem adquiridas, os níveis dessa hemoglobina estão acima dos normais. A Hb A2 está aumentada nos estígmas ( talassêmicos (heterozigtos para ( talassemia) e na talassemia major. A Hb A2 está normal ou diminuída na anemia microcítica ferropriva e nas delta e alfa talassemias. Pode estar elevada na anemia megaloblástica e diminuída na anemia sideroblástica, doença de Hb H e eritroleucemia.
 Método: Marengo & Rowe.
 Amostra: sangue total com EDTA.
 Procedimento:
 - Aplicar 20 microlitros de solução de hemoglobinas em fitas de acetato de celulose com 5,7 cm de largura. Para acetatos com 2,5 cm de largura, usar duas fitas, depositando 10 microlitros em cada uma delas.
 - Passar 300 volts por 40 minutos.
 - Após a separação das frações de hemoglobina A2 e A, recortá-las e eluí-las em tubos de ensaio contendo 3 ml água destilada para a hemoglobina A2 e 15 ml de água destilada para hemoglobina A.
 - Deixar eluir por duas a seis horas, com agitação periódica.
 - Ler as densidades ópticas (D.O.) em 415 nm, usando água destilada como branco.
 - Cálculo:
 
% Hb A2 = D.O. Hb A2 x 100 .
 D.O. Hb A2 + ( D.O. Hb A x 5)
 Valor de referência: 2,0 a 3,7 %.
Dosagem de Hemoglobina Fetal
 A hemoglobina fetal é álcali resistente, enquanto que as hemoglobinas A, A2 e outros tipos normais são facilmente desnaturáveis por soluções alcalinas. Esse método é sensível para detectar pequenas quantidades de hemoglobina fetal. Em sangue de cordão umbilical a quantidade de hemoglobina Fetal é de aproximadamente 70 a 90%. Em indivíduos com talassemia beta homozigota oscila entre 60 a 98%; na interação talassemia beta/Hb S, o valor varia entre 0,5 a 21,2%. Na talassemia beta heterozigota, a hemoglobina Fetal pode estar normal ou discretamente aumentada. Valores altos de Hb Fetal são encontrados em crianças até os seis meses de vida. Podem estar elevados na talassemia minor, nas hemoglobinopatias heterozigóticas (SS, CC, talassemia major, etc) e duplo heterozigóticas, na persistência hereditária de Hb fetal e síndromes mieloproliferativas (eritroleucemia, LMC juvenil). 
 Método: Singer. 
 Amostra: sangue total com EDTA.
 Procedimento:
 - Lavar o sangue 3 x com salina.
 - Ao concentrado lavado adicionar 1 ml de água destilada e homogeneizar. 
 - Adicionar 1 ml de clorofórmio e centrifugar.
 - Em um tubo rotulado “Hb fetal”, adicionar 1,6 ml de NaOH 0,083 N e 100 ul da solução de hemoglobina e acionar o cronômetro. Agitar cuidadosamente por 10 segundos.
 - Exatamente após 60 segundos, adicionar 3,4 ml de sulfato de amônio parcialmente saturado e homogeneizar. Deixar em repouso por 30 minutos e filtrar.
 - Em outro tubo identificado “Hb total”, adicionar 5 ml de água destilada e 20 ul de solução de hemoglobina e homogeneizar.
 - Ler as densidades ópticas (DO) das soluções “Hb total” e “Hb fetal” em 540 nm, zerando com água.
 - Cálculo:
% Hb F = D.O. Hb . x 0,203 x 100 
 D.O. padrão 
 Valor de referência: Após os seis meses de idade: 0 a 1,0%
HEMOSTASIA E COAGULAÇÃO
 O termo hemostasia significa prevenção da perda de sangue. Sempre que um vaso é lesionado ou rompido, a hemostasia é alcançada por vários mecanismos que são ativados com o objetivo de interromper o extravasamento de sangue e proporcionar a reconstrução do vaso e do tecido lesado. A hemostasia é marcada por 4 fases:
1º - Fase vascular: imediatamente após um vaso ser lesado ou rompido, ocorre espasmo ou contração vascular, provocado pela liberação local de agentes vasoconstritores (tromboxano A2 e endotelina). Esse efeito tende a diminuir a perda de sangue.
2º - Fase plaquetária: Paralelamente a fase vascular, as plaquetas começam a se agregar umas às outras no local de lesão, de modo a formar num período de poucos minutos um tampão, chamado de tampão plaquetário.
3º - Fase coagulante: é marcada pela ativação em cascata dos fatores plasmáticos da coagulação, que ocorre em duas vias: extrínseca e intrínseca. A lesão vascular ocasiona a liberação de substancias ativadoras dos fatores plasmáticos de coagulação. O resultado final é a conversão da protrombina em trombina, que transforma o fibrinogênio em fibrina. Esta última torna o sangue endurecido no local do trauma, originando o coágulo. Nas pessoas normais, este processo demora até 10 minutos para ocorrer após o trauma vascular.
4º - Fase fibrinolítica: após a formação do coágulo, enquanto o tecido conjuntivo e o endotélio lesado se reconstituem lentamente, haverá uma lenta e progressiva degradação da fibrina formada. Isso ocorre por meio de uma enzima chamada plasmina, que dissolve o coágulo de fibrina.
 Em indivíduos que apresentam suspeita de distúrbios hemorrágicos a realização de teste laboratoriais que avaliam o mecanismo de coagulação (principalmente as três primeiras fases) é importante para descobrir se existe alguma anormalidade presente, de modo a tratar a causa e prevenir a ocorrência de uma hemorragia letal. Situações que envolvem sangramentos cutâneo-mucoso recorrentes, sangramentos espontâneos e sangramento pós-traumático excessivo e que demora a parar devem ser investigadas.
 
 A cascata da coagulação e seus fatores plasmáticos:
TEMPO DE SANGRAMENTO
 É o tempo necessáriopara se estancar uma hemorragia provocada por uma lanceta descartável, com ferimento de profundidade média de 2 a 3 mm. Esta prova permite avaliar a função plaquetária, a contratilidade e integridade anatômica dos capilares e vasos. Não depende de fatores plasmáticos. 
 O tempo de sangramento está prolongado em defeitos da parede vascular (escorbuto, síndrome de Marfan e síndrome de Erlers-Danlos), anomalias plaquetárias quantitativas (púrpura trombocitopênica) e qualitativas (síndrome de Glazmann e uso de aspirina). Raramente está prolongado devido à deficiência de fatores plasmáticos.
 Método: Duke. 
 Procedimento:
 - Após assepsia, produz-se um ferimento na polpa de um dos dedos da mão ou no lóbulo da orelha do paciente, com o auxílio de uma lanceta descartável. 
 - Ao mesmo tempo em que se produz o ferimento, dispara-se um cronômetro. 
 - A cada 15 segundos retira-se o excesso de sangue do local do ferimento com papel de filtro, até a parada total do sangramento.
 - Anotar o tempo decorrido. 
 Valores de referência: 1 a 3 minutos.
 
TEMPO DE COAGULAÇÃO
 É o tempo que o sangue leva para coagular, após sua retirada da veia e colocada sob as condições padrões. Tem-se uma avaliação direta dos fatores plasmáticos que atuam no processo de coagulação. 
 O tempo de coagulação prolongado indica uma severa alteração no mecanismo de coagulação. A anomalia pode dever-se a:
 - defeito de um fator específico da coagulação, como na hemofilia;
 - defeito de mútiplos fatores da coagulação, como nas hepatopatias crônicas;
 - uso de heparina utilizada em tratamento de enfermidade trombótica.
 
 Método: Lee White.
 Procedimento:
 - Após assepsia, colhe-se o sangue venoso do paciente, ao mesmo tempo, que se dispara o cronômetro. 
 - Colocar 1 ml de sangue em um tubo de ensaio pequeno e por em banho-maria a 37º.
 - A cada 30 segundos verifica-se a formação de coágulo, ou seja, até o momento em que não escorra mais sangue pelas paredes do tubo.
 - Anotar o tempo decorrido. 
 Valores de referência: 4 a 10 minutos.
 
PROVA DO LAÇO
 Também chamada de prova da resistência capilar, avalia a fragilidade do vaso quando submetido a uma pressão externa. Normalmente é negativa, não tendo relação com o tampo de sangramento. Pode estar alterada nos defeitos da parede vascular e quando houver plaquetopenia severa.
 Método: Rumpel Leede.
 Procedimento:
 - Com o auxílio de um manguito, aplica-se ao braço do paciente uma pressão intermediaria entre a pressão arterial máxima e mínima, mantendo-se esta pressão por 5 minutos. 
 - Após este período, retira-se o manguito e verifica-se o aparecimento de petéquias (manchas puntiformes de 1 a 2 mm) na parte interna da dobra do braço. 
 - Se for encontrado mais de 5 petéquias em um círculo de 5 cm de diâmetro a prova é positiva. 
 Valores de referência: negativa.
 
RETRAÇÃO DO COÁGULO
 Existe uma proteína contrátil no citoplasma das plaquetas chamada tromboastenina, responsável pelo retiro das plaquetas, fazendo com que ocorra a retração do coagulo, facilitando a fibrinólise e contribuindo para que o sangue flua normalmente. 
 Este teste mede a retração da fibrina após a coagulação do sangue pela quantidade de soro que é expelido elo coágulo. A retração do coágulo pode estar alterada nas trombocitopenias e hipofibrinogenemias severas.
 Método: Mac Farlane.
 Amostra: sangue sem anticoagulante. 
 Procedimento:
 - Colher 5 ml de sangue do paciente, colocar em um tubo de ensaio cônico graduado e deixar coagular. 
 - Deixar o tubo por 3 horas em banho-maria 37º C. 
 - Retirar o coágulo formado e centrifugar o soro e hemácias restantes por 5 minutos.
 - Anotar o volume somente da quantidade de soro restante a aplicar a fórmula:
 R = volume de soro (ml) x 100 / volume de sangue colhido (ml)
 % retração = R + hematócrito / 2
 Valores de referência: 40 a 50 %.
 
TEMPO DE PROTROMBINA
 A determinação do tempo de protrombina (TAP), também chamado tempo de Quick, é um método global que explora o sistema extrínseco da coagulação. Utiliza-se um plasma a 37º C em excesso de tromboplastina tissular e cálcio. A conversão do tempo de protrombina em taxa de protrombina permite apreciar a atividade protrombínica do plasma teste comparado com um plasma de referência (100 %).
 A TAP depende dos seguintes fatores: fator V, fator VII, fator X, a protrombina (fator II) e o fibrinogênio (fator I). 
 O TAP encontra-se prolongado nas enfermidades hemorrágicas do RN, na insuficiência hepática (cirrose, hepatite), deficiência de vitamina K (mal absorção), consumo excessivo de fatores de coagulação (CID), uso de anticoagulantes orais (warfarin, dicumarol) e nas deficiências isoladas congênitas dos fatores da via extrínseca. 
 Método: Quick. 
 Amostra: sangue total com citrato de sódio. 
 Procedimento:
 - Em um tubo de Khan adicionar 100 ul de plasma e incubar em banho-maria a 37º C por 2 minutos. 
 - Adicionar 200 ul de tromboplastina previamente incubada a 37º C e simultaneamente acionar o cronômetro. 
 - Anotar o tempo de coagulação. 
 - Resultado: consultar a tabela de conversão do tempo obtido, em porcentagem, que acompanha o Kit. Em caso de tratamento com anticoagulantes orais, os resultados podem ainda expressar-se em RNI (relação normatizadora internacional) que se define:
 RNI = RISI sendo:
 R = relação entre o tempo do paciente dividido pelo tempo do controle; 
 ISI = índice de sensibilidade internacional determinado frente a uma tromboplastina de referência da OMS. O ISI é determinado para cada lote de tromboplstina e encontra-se fornecido na bula de cada Kit.
 Valores de referência: 70 a 100%.
 
TEMPO DE TROMBOPLASTINA
 O tempo de tromboplastina parcial ativado ou tempo de cefalina ativada (TTPA) é um teste global que explora o sistema intrínseco da coagulação: os fatores de contato, a pré-calicreína, o fator XII, fator XI, os fatores anti-hemofílicos A (fator VIII) e B (fator IX), o fator X, fator V, a protrombina (fator II) e o fibrinogênio (fator I). O TTPA consiste na determinação do tempo de coagulação de um plasma a 37º C após recalcificação em quantidades ótimas de fosfolipídeos (cefalina) e um ativador (caolim). É o teste adequado para o diagnóstico inicial da hemofilia. 
 O TTPA está prolongado nas deficiências congênitas de fatores da via intrínseca como a hemofilia e doença de Von Willebrand, e nas deficiências adquiridas: insuficiência hepática, CID, carência de vitamina K, uso de heparina, uso de medicamentos fibrinolíticos (estreptoquinase).
 
 Método: Bell Alton. 
 Amostra: sangue total com citrato de sódio. 
 Procedimento:
 - Em um tubo de Khan adicionar 50 ul de plasma e 50 ul de cefalina e incubar em banho-maria a 37º C por 2 minutos. 
 - Adicionar 50 ul de cloreto de cálcio previamente incubado a 37º C e simultaneamente acionar o cronômetro. 
 - Anotar o tempo de coagulação.Valores de referência: 20 a 40 segundos.
PREPARO DOS REAGENTES
Líquido de Hayen:
 Bicloreto de mercúrio..........................…...0,5 g
 Cloreto de sódio……………..............…...1,0 g
 Sulfato de sódio..........................................5,0 g 
 Água destilada...................qsp................200 ml
 
Líquido de Drabkin:
 KCN..........................…...0,05 g
 K3Fe(CN)6..............…....0,20 g
 Água destilada....qsp........1 litro
Conservar em frasco âmbar. 
Líquido de Turk:
 Ácido acético glacial...................................2ml
 Violeta genciana sol. aquosa 1%................1ml 
 Água destilada....qsp...............................100 ml 
Este líquido deve ser filtrado freqüentemente para remover leveduras e bolores.
Corante de Leishman:
 Eosina azul de metileno Leishman...............1,0 g
 Metanol.......................................................1 litro
Deixar agitando por 24 horas e filtrar.
Obs.: dependendo da marca do pó do corante, pode ser necessário pesar mais de 1 grama.
Tampão Fosfato Neutro:
 Na2HPO4.........................3,20 g 
 KH2PO4...........................6,63 g
 Água destilada....qsp........1 litro
Líquido de Contagem de Plaquetas:
 Citrato de sódio.........................3,8 g
 Formol 40% (formalina)............0,2 ml
 Azul cresil brilhante...................0,1 g
 Água destilada.........................100 ml 
Corante Azul de Cresil Brilhante:
 Azul de cresil brilhante...........................1,0 g
 Citrato de sódio.......................................0,4 g
 Salina (NaCL 0,85%).........qsp............100 ml 
Solução de Glicose 0,28 M:
 Glicose..............................................5,0 g
 Água destilada...............qsp............100 ml
Solução de Nitrito de Sódio 0,18 M:
 Nitrito de sódio...............................1,25 g
 Água destilada.............qsp.............100ml 
Solução de Azul de Metileno 0,0004 M:
 Cloreto de azul de metileno triidratado..................0,15 g
 Água destilada......................qsp.........................1000 ml 
 
Tampão HbS:
 KH2PO4 (anidro)....................6,75 g
 K2HPO4 (anidro)..................11,86 g
 Saponina PA............................0,50 g
 Água destilada........qsp..........50 ml 
 
 
Corante de Giensa Estoque:
 Corante de Giensa em pó ............ 0,75 g
 Metanol puro ............................... 65 ml
 Glicerina pura .............................. 35 ml
Dissolver o corante com metanol e adicionar a glicerina e agitar com agitador, filtrar e guardar em frasco plástico escuro. O corante de Giensa deve ser preparado na hora (para cada 1 gota de Giensa 1 ml de tampão fosfato). 
Tampão TRIS-EDTA-Borato, pH 8,5:
	Tris hidroximetil aminometano.....................
	 10,2 g 
	Ácido etileno diamino tetracético..................
	 0,6 g
	Ácido bórico...................................................
	 3.2 g 
	Água destilada q.s.p.......................................
	1000 ml
Tampão Fosfato pH 6,2:
	Na2HPO4.......................................................
	 2,02 g
	NaH2PO4.H2O...............................................
	 7,66 g 
	Água destilada q.s.p....................................... 
	1000 ml
Sulfato de Amônio Parcialmente Saturado:
 Sulfato de Amônio ................................ 500 g
 Água destilada ..............qsp.................. 500 ml
 Remover 400ml do sobrenadante da solução acima, colocando-o num becker e adicionar 400ml de água destilada e 2 ml HCl 10N (80,6ml HCl + 19,4ml água destilada) 
	Solução de Hidróxido de Sódio 0,083 N:
	
	Hidróxido de sódio........................................
	 3,3 g 
	Água destilada q.s.p......................................
	1000 ml
Sacarose 10 %:
Sacarose .................................................... 10 g
Água destilada ...................qsp............ 100 ml 
HCL 0,2 N :
HCl ............................................................. 17 ml
Água destilada ..................qsp................ 1000 ml
O ácido é adicionado cuidadosamente sobre a água, com agitação constante.
ANEXOS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BAIN, B. J. Células Sanguíneas: Um Guia Prático. 2ª ed. Porto Alegre: Artes Médicas, 1997.
BEVILACQUIA, F; et al. Fisiopatologia Clínica. 5ª ed. São Paulo: Atheneu, 1995.
BURTIS, C; ASHWOOD, E. Tietz Fundamentos de Química Clínica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998.
HENRY, J. Diagnósticos Clínicos e Tratamento por Métodos Laboratoriais. 19ª ed. São Paulo: Manole, 1999.
JANINI, P. Interpretação Clínica do Hemograma. 10 ª ed. São Paulo: Sarvier, 1990.
LEHNINGER, A. Princípios de Bioquímica. 2º ed. Rio de Janeiro: Sarvier, 1996.
LIMA, O; et al. Métodos de Laboratório Aplicados à Clínica. 7ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1992.
MILLER, O. Laboratório Para o Clínico. 8 ª ed. São Paulo: Atheneu, 1999.
MOURA, R. Técnicas de Laboratório. 3ª ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 1999.
NAUOM, P. Eletroforese -Técnicas e Diagnóstico. São Paulo: Santos, 1990.
ROBBINS, S; KUMAR, V. Patologia Estrutural e Funcional. 6ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000.
VOET, D.; et al. Fundamentos de Bioquímica. Porto Alegre: Artes Médicas, 2000.
VALADA, E. P. Manual de Técnicas Hematológicas. Rio de Janeiro: Atheneu, 1988.
WILLIAN, J. W.; et al. Hematologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1972.
Sangue periférico normal.
Hemácias microcíticas e hipocrômicas vistas em um caso de anemia ferropriva.
Hemácias macrocíticas e um neutrófilo hipersegmentado na anemia megaloblástica. 
Hemácias policromáticas, esferócitos e eritroblastos: quadro característico das anemias hemolíticas. 
Reticulocitose observada nas reações hemolíticas. 
Anemia falciforme: notam-se anisocitose, hemácias policromáticas, hemácias falciformes e um eritroblasto.
Talassemia beta major: várias hemácias em alvo e dois eritroblastos. 
Numerosos esferócitos em um paciente portador de esferocitose hereditária. 
Hemácias em forma de charuto ou eliptócitos são vistos em grande número na eliptocitose hereditária. 
Plasmodium falciparum: hemácia com trofozoíto e um gametócito. 
Neutrofilia com desvio à esquerda na septicemia por Staphylococcus aureus. 
Linfócitos atípicos: são linfócitos ativados frente a um estímulo, freqüentes na mononucleose. 
Blastos no sangue periférico de um indivíduo com leucemia mielóide aguda. 
Leucemia mielóide crônica: presença de células mielóides em todos os estágios de maturação. 
Numerosos plasmócitos na medula óssea de um caso de mieloma múltiplo. 
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Segmentado
Bastão
Metamielócito
Mielócito
Pró-Mielócito
UFC-G (Mieloblasto)
Macrófago
Monócito
Pró-Monócito
UFC-M 
(Monoblasto)
UFC-GM
Stem Cell
Mielóide
Mega Basófilo
Mega Acidófilo
UFC-Meg 
(Megacarioblasto)
Plaquetas
UFC-E
(Pró-eritroblasto)
Eritroblasto
Basófilo
Eritroblasto
Policromático
Eritroblasto
Ortocromático
Reticulócito
Eritrócito
Linfoblasto T
Pró-linfócito
Linfócito T (CD4/CD8/NK)
Linfoblasto B
Pré pré-B
Pré-B
Linfócito B
Plasmócito
Stem Cell
Linfóide
Stem Cell
Unipotente
Stem Cell
Pluripotente
Stem Cell
Pluripotente
IL2,7,9,13
IL4,5,13,14
IL7
IL6
Ag
IL1,3,7
IL1,3,7
EPO
TPO/IL6,11
IL4/9
CSF-GM
IL4,9
IL4,9
LPS
IL8,11
IL5
PGE2
ITF
ITF
FNT,ITF,IL2
FNT,ITF,FP4
IL10
ESTIMULA
INIBE
Figura 2: formação das células do sangue, evidenciando todos os estágios celulares; a linha cinza indica a transição da medula para o sangue