Aula_P_1

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1	
  
 
 
 
 
 
FISIOLOGIA	
  
ANIMAL/GERAL	
  
	
  
AULA	
  1	
   Utilização da técnica de ELISA no diagnóstico da doença de Alzheimer	
  
	
  
 
 
 
 
 
	
  
PAULO	
  SANTOS	
  e	
  ANTÓNIO	
  MORENO	
   2013	
  	
  
 
DEPARTAMENTO	
  DE	
  CIÊNCIAS	
  DA	
  VIDA	
  
FACULDADE	
  DE	
  CIÊNCIAS	
  E	
  TECNOLOGIA	
  
UNIVERSIDADE	
  DE	
  COIMBRA	
  
2	
  
PARTE	
  A	
   INTRODUÇÃO	
  
	
  
	
  
A	
  Doença	
  de	
  Alzheimer	
  
	
  
A	
  Doença	
  de	
  Alzheimer	
  (DA),	
  descrita	
  em	
  1906	
  pelo	
  psiquiatra	
  alemão	
  Alois	
  Alzheimer,	
  é	
  a	
  
forma	
  mais	
   frequente	
   de	
   demência	
   nos	
   países	
   industrializados.	
   A	
   evolução	
   da	
   doença	
   é	
  muito	
  
lenta	
  e	
  a	
  maior	
  parte	
  dos	
  casos	
  são	
  precedidos	
  de	
  uma	
  fase	
  pré-­‐clínica,	
  com	
  a	
  duração	
  de	
  alguns	
  
anos,	
   que	
   é	
   caracterizada	
   por	
   perturbações	
   de	
   memória.	
   A	
   incidência	
   da	
   DA	
   aumenta	
   com	
   o	
  
avançar	
   da	
   idade,	
  mas	
   pode	
   atingir	
   pessoas	
  mais	
   novas,	
   não	
   sendo,	
   portanto,	
   um	
  problema	
  da	
  
velhice.	
  As	
  características	
  clínicas	
  da	
  DA	
  podem	
  variar	
  significativamente	
  de	
  pessoa	
  para	
  pessoa,	
  
com	
   um	
   início	
   dissimulado	
   que	
   dificulta	
   o	
   diagnóstico.	
   Porém,	
   como	
   a	
   evolução	
   é	
   crónica	
   e	
  
progressiva,	
  é	
  indispensável	
  uma	
  identificação	
  correta	
  e	
  precoce	
  da	
  doença	
  nas	
  primeiras	
  fases,	
  a	
  
fim	
  de	
  permitir	
  tratar	
  os	
  doentes	
  e	
  lhes	
  prolongar	
  a	
  autonomia.	
  
	
  
Os	
  sintomas	
  
Os	
  sintomas	
  não	
  são	
  iguais	
  em	
  todas	
  as	
  pessoas	
  e,	
  frequentemente,	
  são	
  influenciados	
  pela	
  
personalidade,	
   o	
   estado	
   físico,	
   o	
   grau	
   de	
   cultura	
   e	
   o	
   estilo	
   de	
   vida.	
   Um	
   médico	
   especialista	
  
(neurologista,	
   geriatra,	
   psiquiatra)	
   com	
   uma	
   abordagem	
   diagnóstica	
   adequada	
   e	
   aprofundada,	
  
pode	
  diagnosticar	
  a	
  doença	
  após	
  uma	
  conversa	
  clínica	
  com	
  o	
  doente	
  ou	
  com	
  os	
  familiares,	
  além	
  
de	
  exames	
  neuropsicológicos	
  e	
  instrumentais.	
  
	
  
As	
  indagações	
  preliminares	
  para	
  o	
  diagnóstico	
  
Não	
   existe	
   um	
   teste	
   clínico	
  que,	
   por	
   si	
   só,	
   permita	
   formular	
   um	
  diagnóstico	
   certo	
  da	
  DA.	
  O	
  
diagnóstico	
   é	
   efetuado	
   através	
   da	
   recolha	
   de	
   uma	
   série	
   de	
   dados	
   clínicos	
   e	
   laboratoriais	
   que	
  
ajudam	
   a	
   excluir	
   outras	
   patologias	
   suscetíveis	
   de	
   causarem	
   os	
   mesmos	
   sintomas.	
   Os	
   exames	
  
indispensáveis	
  ao	
  diagnóstico	
  são:	
  
• Avaliação	
  neuropsicológica	
  efetuada	
  com	
  o	
  auxílio	
  de	
  baterias	
  de	
  testes	
  padronizados;	
  
• TAC	
  ou	
  ressonância	
  magnética	
  (RM);	
  
• Exame	
  clínico	
  cuidadoso	
  
	
  
Outros	
  métodos	
  de	
  diagnóstico	
  têm	
  vindo	
  a	
  ser	
  desenvolvidos,	
  no	
  sentido	
  de	
  possibilitar	
  um	
  
diagnóstico	
   precoce	
   da	
   doença.	
   Um	
   desses	
   testes	
   consiste	
   na	
   utilização	
   da	
   técnica	
   de	
   ELISA	
  
(enzyme-­‐linked	
   immunosorbent	
  assay)	
  para	
  detetar	
  e	
  quantificar	
  a	
  presença	
  da	
  proteína	
  Tau	
  no	
  
líquido	
   cefalorraquidiano.	
   Esta	
   proteína	
   é	
   encontrada	
   no	
   interior	
   dos	
   neurónios,	
   onde	
  
desempenha	
   um	
   papel	
   na	
   estabilização	
   da	
   rede	
   de	
   microtúbulos.	
   Na	
   DA,	
   esta	
   proteína	
   sofre	
  
hiperfosforilação,	
   formando	
   tranças	
   fibrilares	
   no	
   interior	
   das	
   células,	
   um	
   dos	
   marcadores	
  
característicos	
  da	
  DA.	
  Normalmente,	
  o	
  nível	
  de	
  Tau	
  no	
  líquido	
  cefalorraquidiano	
  é	
  reduzido,	
  pois	
  
3	
  
esta	
  é	
  uma	
  proteína	
  intracelular.	
  Mas	
  com	
  o	
  desenvolvimento	
  da	
  doença,	
  e	
  a	
  consequente	
  morte	
  
neuronal,	
   o	
   nível	
   de	
   Tau	
   sofre	
   um	
   aumento.	
  Um	
  estudo	
   realizado	
   com	
  um	
  número	
   elevado	
   de	
  
doentes	
  de	
  Alzheimer	
  mostrou	
  que	
  os	
  níveis	
  são	
  sempre	
  superiores	
  a	
  200	
  pg/ml	
   (Jones	
  e	
  Quax,	
  
1998).	
  Assim,	
  a	
  deteção	
  e	
  quantificação	
  desta	
  proteína	
  no	
  líquido	
  cefalorraquidiano	
  promete	
  ser	
  
um	
  dos	
  métodos	
  a	
  utilizar	
  no	
  diagnóstico	
  da	
  DA.	
  	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Fig.	
  1-­‐	
  Representação	
  esquemática	
  da	
  desagregação	
  dos	
  microtúbulos.	
  E	
  formação	
  das	
  tranças	
  fibrilares	
  no	
  
interior	
  dos	
  neurónios.(http://www.pueblo.gsa.gov/cic_text/health/alz-­‐cure/alz-­‐cure.htm)	
  
	
  
	
  
	
  
A	
  técnica	
  de	
  ELISA	
  
	
  
A	
  técnica	
  de	
  imunodetecção	
  utilizada	
  (ELISA)	
  é	
  uma	
  técnica	
  relativamente	
  simples,	
  que	
  se	
  
baseia	
  em	
  quatro	
  passos:	
  
A	
   avaliação	
   dos	
   resultados	
   poderá	
   ser	
   feita	
   por	
   visualização	
   direta	
   ou	
   por	
   quantificação	
  
através	
   de	
   um	
   leitor	
   de	
   placas	
   ELISA.	
   Os	
   poços	
   que	
   permanecem	
   incolores	
   são	
   considerados	
  
negativos,	
  ou	
  seja,	
  não	
  possuem	
  os	
  anticorpos	
  em	
  estudo,	
  enquanto	
  os	
  poços	
  onde	
  se	
  desenvolve	
  
a	
  cor	
  azul	
  são	
  considerados	
  positivos.	
  Se	
  pretender	
  quantificar	
  terá	
  de	
  realizar	
  previamente	
  uma	
  
curva	
  padrão	
  e	
  analisar	
  a	
  placa	
  com	
  o	
  auxílio	
  de	
  um	
  leitor	
  de	
  placas	
  ELISA.	
  
	
  
4	
  
1º-­‐	
  Adição	
  das	
  amostras.	
  
As	
  amostras	
  são	
  adicionadas	
  aos	
  poços	
  existentes	
  nas	
  
microplacas.	
   As	
   amostras	
   contêm	
   várias	
   proteínas	
   e	
  
podem	
  conter,	
  ou	
  não	
  o	
  antigénio	
  em	
  estudo.	
  Após	
  um	
  
determinado	
   período	
   de	
   tempo,	
   necessário	
   para	
   que	
  
ocorra	
  a	
  ligação	
  dos	
  antigénios	
  aos	
  poços,	
  procede-­‐se	
  à	
  
lavagem	
   dos	
   poços	
   com	
   detergente,	
   para	
   retirar	
   os	
  
antigénios	
   não	
   ligados	
   e	
   também	
   para	
   bloquear	
  
ligações	
  não	
  especificas	
  dos	
  anticorpos	
  ao	
  plástico.	
  
	
  
	
  
2º-­‐	
  Adição	
  do	
  anticorpo	
  primário.	
  
Uma	
   solução	
   contendo	
   o	
   anticorpo	
   primário	
   (Ab),	
  
desenvolvido	
   contra	
   a	
   proteína	
   em	
   estudo	
   é	
  
adicionado	
  aos	
  poços.	
  Se	
  a	
  amostra	
  conter	
  o	
  antigénio,	
  
ligará	
  os	
  Ab.	
  Os	
  Ab	
  não	
   ligados	
   são	
  depois	
   removidos	
  
por	
  lavagem.	
   	
  
	
  
3º-­‐	
  Adição	
  do	
  anticorpo	
  secundário.	
  
Uma	
   solução,	
   contendo	
   o	
   anticorpo	
   secundário,que	
  
tem	
   ligado	
   uma	
   enzima	
   cromática,	
   é	
   adicionada	
   aos	
  
poços	
   e	
   incubada,	
   para	
   permitir	
   a	
   ligação	
   dos	
  
anticorpos	
   secundários	
   aos	
   anticorpos	
   primários.	
   Os	
  
anticorpos	
   secundários	
   não	
   ligados	
   são	
   depois	
  
removidos	
  por	
  lavagem.	
  
	
  
	
  
4º-­‐	
  Adição	
  do	
  substrato	
  para	
  a	
  enzima.	
  
Uma	
  solução	
  contendo	
  o	
  substrato	
  para	
  a	
  enzima,	
  que	
  
se	
   encontra	
   ligada	
   ao	
   anticorpo	
   secundário,	
   é	
  
adicionada	
   aos	
   poços	
   e	
   incubada	
   durante	
   um	
   curto	
  
período	
   de	
   tempo,	
   de	
   modo	
   a	
   permitir	
   o	
  
desenvolvimento	
  da	
  cor	
  (1).	
   	
  
	
  
(1) –	
  Reação	
  colorimétrica	
  descrita	
  em	
  anexo	
  
	
  
	
  
Objetivos	
  
	
  
v Consolidar	
  conhecimentos	
  relativos	
  à	
  doença	
  de	
  Alzheimer;	
  
v Aplicar	
  a	
  técnica	
  de	
  ELISA;	
  
v Conhecer	
  as	
  potencialidades	
  e	
  debilidades	
  dos	
  testes	
  de	
  diagnóstico	
  para	
  a	
  doença	
  de	
  
Alzheimer.	
   	
  
5	
  
PARTE	
  B	
   PARTE	
  EXPERIMENTAL	
  
	
  
Este	
  trabalho	
  experimental	
  deverá	
  ser	
  realizado	
  em	
  grupo	
  com	
  4	
  elementos.	
  
	
  
Procedimento	
  	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
  
	
  
1. Identifique	
  os	
  tubos	
  com	
  a	
  indicação	
  do	
  grupo	
  a	
  que	
  pertence;	
  
2. Marque	
  a	
  tira	
  de	
  12	
  poços	
  como	
  indicado	
  na	
  figura	
  seguinte;	
  
	
  
a. 	
  Qual	
  o	
  motivo	
  pelo	
  qual	
  todos	
  os	
  poços	
  estão	
  em	
  triplicado?	
  
	
  
	
  
	
  
3. Coloque	
  50	
  µl	
  do	
  controlo	
  positivo	
  nos	
  poços	
  marcados	
  com	
  (+);	
  
	
  
4. Coloque	
  50	
  µl	
  do	
  controlo	
  negativo	
  nos	
  poços	
  marcados	
  com	
  (-­‐);	
  
5. Coloque	
  50	
  µl	
  do	
  “LCR”	
  obtido	
  em	
  cada	
  um	
  dos	
  grupos	
  com	
  poços	
  respetivos	
  (G1,	
  G2,	
  G3	
  ou	
  
G4);	
  
6. Espere	
  5	
  minutos;	
  
a. Qual	
  o	
  objetivo	
  desta	
  incubação?	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
7. Lave	
  os	
  poços	
  para	
  retirar	
  os	
  antigénios	
  não	
  ligados;	
  
6	
  
a. Vire	
  a	
   tira	
  de	
  poços	
  sobre	
  uma	
  pilha	
  de	
  toalhas	
  de	
  papel	
  e	
  bata	
  suavemente	
  algumas	
  
vezes	
  de	
  modo	
  a	
  retirar	
  todo	
  o	
  liquido;	
  	
  
	
  
b. Encha	
  com	
  cuidado	
  cada	
  poço	
  com	
  o	
  tampão	
  de	
  lavagem,	
  tendo	
  cuidado	
  para	
  não	
  
entornar	
  para	
  o	
  poço	
  vizinho;	
  	
  
	
  
c. Vire	
  a	
  tira	
  de	
  poços	
  sobre	
  uma	
  pilha	
  de	
  toalhas	
  de	
  papel	
  e	
  bata	
  suavemente	
  algumas	
  
vezes	
  de	
  modo	
  a	
  retirar	
  todo	
  o	
  liquido;	
  
d. Descarte	
  as	
  2	
  toalhas	
  do	
  topo	
  da	
  pilha;	
  	
  
8. Repita	
  o	
  ponto	
  anterior;	
  
	
  
	
  
9. Proceda	
  à	
  ligação	
  do	
  anticorpo	
  primário	
  aos	
  poços,	
  transferindo	
  50	
  µl	
  para	
  cada	
  um	
  dos	
  poços;	
  
	
  
10. Espere	
  5	
  minutos;	
  	
  
a. Qual	
  o	
  objetivo	
  desta	
  incubação?	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
11. Lave	
  todos	
  os	
  poços,	
  repetindo	
  o	
  ponto	
  7	
  duas	
  vezes;	
  
7	
  
2x 	
  
12. Coloque	
  50	
  µl	
  do	
  anticorpo	
  secundário	
  em	
  cada	
  um	
  dos	
  poços;	
  
	
  
13. Espere	
  5	
  minutos;	
  
a. Qual	
  o	
  objetivo	
  desta	
  incubação?	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
14. Retire	
  os	
  anticorpos	
  secundários	
  não	
  ligados	
  repetindo	
  o	
  ponto	
  7	
  três	
  vezes;	
  
3x 	
  
	
  
15. Coloque	
  50	
  µl	
  do	
  substrato	
  enzimático	
  em	
  cada	
  um	
  dos	
  poços;	
  
	
  
16. Espere	
  5	
  minutos;	
  
a. Qual	
  o	
  objetivo	
  desta	
  incubação?	
  
	
  
	
  
17. Observe	
  e	
  registe	
  os	
  resultados;	
  
8	
  
18. Proceda	
  à	
  leitura	
  no	
  Leitor	
  de	
  placas	
  ELISA	
  ao	
  comprimento	
  de	
  onda	
  de	
  655nm	
  (opcional).	
  
	
  
	
  
Resultados	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
  
	
  
	
   Assinale,	
  na	
  figura	
  seguinte,	
  quais	
  os	
  poços	
  que	
  apresentaram	
  cor	
  azul	
  e	
  responda	
  às	
  seguintes	
  
perguntas.	
  
	
  
1. O	
  LCF	
  das	
  amostras	
  analisadas	
  pelo	
  seu	
  grupo	
  continha	
  proteínas	
  Tau?	
  
	
  
	
  
	
  
2. Se	
  o	
  resultado	
  foi	
  positivo,	
  significa	
  que	
  é	
  portador	
  da	
  doença	
  de	
  Alzheimer?	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
3. Poderá	
  obter	
  um	
  resultado	
  falso	
  positivo?	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
4. Indique	
  outros	
  testes	
  onde	
  a	
  técnica	
  de	
  ELISA	
  poderá	
  ser	
  utilizada.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
9	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Bibliografia	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
  
ELISA	
  Immuno	
  Explorer	
  kit	
  instruction	
  manual.	
  Bio-­‐Rad,	
  (2004)	
  
Jones,	
   B.	
   e	
   Quax,	
   W.	
   (1998)	
   Alzheimer	
   tau	
   test	
   and	
   detergent	
   cellulose.	
   Made	
   by	
   genetic	
  
engineering	
  (No.	
  9	
  in	
  a	
  series	
  of	
  articles	
  to	
  promote	
  a	
  better	
  understanding	
  of	
  the	
  use	
  of	
  genetic	
  
engineering).	
  Journal	
  of	
  Biotechnology	
  66,	
  229–233	
  
10	
  
Anexo	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
  
	
  
Deteção	
  colorimétrica	
  
Os	
   anticorpos	
   secundários	
   utilizados	
   na	
   técnica	
   de	
   ELISA	
   estão	
   ligados	
   a	
   enzimas.	
   A	
  
deteção	
   dos	
   anticorpos	
   secundários,	
   que	
   se	
   encontram	
   ligados	
   aos	
   anticorpos	
   primários,	
   é	
  
efetuada	
   através	
   de	
   uma	
   reação	
   enzima-­‐substrato.	
   Nesta	
   aula	
   prática	
   	
   o	
   anticorpo	
   secundário	
  
utilizado	
  está	
  ligado	
  a	
  uma	
  peroxidase	
  de	
  rábano	
  (Horseradish	
  peroxidase,	
  HRP).	
  Na	
  presença	
  de	
  
peróxido	
   de	
   hidrogénio	
   (H2O2),	
   a	
   HPR	
   cataliza	
   a	
   oxidação	
   do	
   substrato	
   3,3’,5,5’-­‐
tetrametilbenzideno	
  (TMB).	
  A	
  oxidação	
  do	
  TMB	
  pela	
  HRP	
  resulta	
  na	
  formação	
  de	
  um	
  produto	
  azul.