Daniele e Jorge Relatório 3

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Universidade Federal do Amazonas.
Instituo de Ciências Exatas e Tecnologia.
Docente: Profª. Dra. Welma Souza Silva Carneiro. 
Discentes: Daniele Berger Negreiros.
 José Jorge Amazonas Barros.
Relatório de Aula Prática:
Extração de DNA vegetal.
 Relatório de aula pratica sobre a Extração de DNA Vegetal da disciplina de Biologia Molecular apresentado como nota parcial a profª: Dra Welma Sousa.
 ITACOATIARA-AM.
2021.
Introdução. 
 O DNA (Ácido Desoxirribonucleico) é uma molécula presente no núcleo das células de todos os seres vivos e que carrega toda a informação genética de um organismo ou seja o genoma humano, vegetal, bacteriano e é formado por uma fita dupla em formato de espiral composta por nucleotídeos e esta molécula é constituída por três substâncias químicas principais :Bases Nitrogenadas-Adenina (A), Timina (T), Citosina (C) e Guanina (G); Pentose um açúcar que apresenta moléculas formadas por cinco átomos de carbono e que sofre ciclização, e um grupo Fosfato – um radical de ácido fosfórico.
 O método de extração de DNA mais utilizado para se extrair diferentes tipos de DNA de espécies vegetais é baseado no uso do detergente CTAB onde este detergente possui a função de solubilizar as membranas celulares e, dependendo da concentração de NaCl no tampão, forma um complexo direto com o DNA, podendo, ser utilizado para precipitá-lo seletivamente em casos de difícil separação, como folhas maduras (Kidwell & Osborn, 1992).
 A maior parte dos protocolos para diferentes espécies, descritos na literatura, utiliza o método CTAB padrão (Romano & Brasileiro, 1999), que podem sofrer alterações de acordo com a espécie estudada e o tecido a ser utilizado para a extração pois podem correr modificações nos métodos básicos, pela adição de antioxidantes, agentes desproteinizantes e outros, podem melhorar a eficiência ou mesmo possibilitar a obtenção de DNA, principalmente em espécies com elevada concentração de metabólitos secundários assim como pode-se citar que a forma de coleta e a condição final do tecido são fundamentais para a qualidade do DNA.
 Neste experimento foi realizada a extração do DNA das folhas de Coleus amboinicus conhecida popularmente como hortelã grande ou hortelã grosso e que possui diversos usos na medicina popular.
Objetivo.
 Realizar extração do DNA vegetal a partir das folhas jovens da Coleus amboinicus utilizando o método padrão CTAB.
Metodologia.
 Protocolo de extração de DNA: Pesagem de 0,051 g de tecido vegetal desidratado da Coleus amboinicus, macerar cerca de 0,051 g da amostra, previamente dessecado utilizando sílica gel , com auxílio de pistilo e almofariz, até obter um “pó” bem fino. Dividir o material em duas partes, transferindo para dois tubos de polipropileno de 2 ml de tampão CTAB, previamente aquecido à 65°C . Misturar por inversão e, quando necessário, auxiliar com um bastão. Incubar em banho-maria a 65°C por 30 min, agitando a cada 10 min. Após atingir a temperatura ambiente, adicionar, na capela, 500 μL de CIA. Agitar, cuidadosamente, por inversão, durante 15 min. Em seguida, centrifugar a 10.000 RPM, por 10 min. Transferir o sobrenadante para um tubo de polipropileno limpo. Adicionar 100 μL de RNA se, agitando lentamente por inversão, e deixar em banho de gelo por 30 min. Adicionar 600 μL de CIA, agitando por inversão por 10 min. Centrifugar a 10.000 RPM 40°C, por 10 min. Transferir o sobrenadante para um outro tubo e adicionar 0,6 μL de etanol P.A. gelado, misturando com suaves inversões, até a precipitação do DNA. Deixar no freezer -20oC por 60 min. Com o auxílio de uma alça de vidro, “pescar” o DNA, lavá-lo com etanol 70% gelado por 30 min. e com etanol 95% gelado, por mais 30 min. cada. Secar bem o pellet e ressuspendê-lo em 100μL de TE.
Resultados e Discussões.
 Os resultados obtidos nesse experimento estão relacionados diretamente com cada fase envolvida nesse procedimento laboratorial: 
Maceração: permite a quebra da parede celular e que aumenta a superfície de contato.
Sais: agem diretamente neutralizando a carga negativa do grupo fosfato do DNA e a carga positiva das proteínas interligadas ao DNA.
Detergente: desconstrói diretamente as moléculas de lipídeos da membrana plasmática e da membrana nuclear age como quebra de gorduras.
Etanol: promove a desidratação da molécula de DNA, separando-a do meio aquoso 
dificulta a dissolução do DNA, pois possui caráter apolar frente aos líquidos.
Banho-maria: promove diretamente a desnaturação de diversas proteínas e enzimas, dentre elas, algumas que podem degradar o DNA, como as DNAses.
 A extração de DNA se mostra uma eficiente técnica quando se almeja estudar apenas o material genético de um determinada célula, uma vez que essa técnica tem se mostrado bastante eficiente quando se nota aspectos como a qualidade e quantidade de material obtido para análise deste, e durante o processo o etanol adicionado aumentou a força iônica do meio assim como diminuiu a constante dielétrica, visto que a força iônica controla a força de repulsão ou atração e desta maneira as moléculas de DNA pararam de interagir com a água e começou a interagi entre si e a centrifugação fez com que o material mais denso do tubo se concentrasse no fundo do enpendorfe e isto permitiu a formação do pellet de DNA assim como a adição do tampão TE (Tris 10mM e EDTA 1mM) e permitiu que o pH da amostra se mantivesse.
Conclusão. 
 Por meio desta técnica foi possível extrair com qualidade e eficiência o material genético em especial o DNA além de nos ofertarem um conhecimento maior sobre os métodos utilizados em laboratórios para a realização desse tipo de procedimento podendo aprender ainda mais.
Referências:
ROMANO, E.; BRASILEIRO, A.C.M. Extração de DNA de plantas. Biotecnologia,
v.2, n.9, p.40-43, 1999.