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Saúde & Ambiente em revista - 1/2006 Cunha, M.A. MÉTODOS DE DETECÇÃO DE MICRORGANISNOS INDICADORES Autor: Michele Almeida da Cunha Orientador: Marilene Rodrigues e Silva Resumo A contaminação de alimentos por microrganismos, a sua proliferação em termos de saúde publica e a preocupação em desenvolver métodos de controles em empresas alimentícias vem a muito tempo crescendo no mundo todo. O alimento por si próprio é um meio de cultura exce- lente para a proliferação de microorganismos. E é através destes microrganismos que podemos avaliar o grau e a procedência da contami- nação, bem como o período previsto para o consumo do alimento antes da sua deterioração. Tem-se, portanto, tornado normal a prática de analisar nos alimentos a existência de bactérias produtoras de toxinfecções alimentares. Estas bactérias são denominadas microrganismos indicadores e são geralmente consideradas como sendo de grande significância quando da avaliação da segurança e qualidade microbioló- gicas de alimentos. Tal identificação só é possível através de alguns métodos de análises, onde destacamos a importância da amostragem e da preparação da amostragem para um diagnóstico preciso e confiável perante aos padrões exigidos pelos órgãos oficiais. Palavras-chave: Microrganismos indicadores; contaminação e segurança alimentar. Abstract The food contamination by microorganisms, its proliferation in terms of public health and the preoccupation of development controls methods in food companies are growing in the all world a long time. The food is an excellent culture ambience for microorganisms proli- feration. We can evaluate the degree and the contamination origin through these microorganisms, as well a period foreseen for the food contamination before its deterioration. However, it has become normal practice to analyze in food an existence of bacterium that produces alimentary toxinfections. The bacterium is called indicative microorganism and it is generally considered as being of great importance when evaluates of the microbiological security and quality food. Such identification is possible only through some analyze methods, where we detach the importance of the sampling and of the sampling preparation for a precise and trustful diagnostic by standards demanded by official organs. Keywords: Indicating microorganism; contamination and security alimentary. Saúde & Ambiente em revista - 1/2006 Cunha, M.A. 1- Introdução Os microrganismos estão intimamente associados com a disponibilidade, a abundância e a qualidade do alimento para consumo humano. Alimentos são facilmente contaminados com microrganismos na natureza, durante manipulação e processa- mento. Após ter sido contaminado, o alimento serve como meio para o crescimento de microrganismos, podendo até mesmo mu- dar as características físicas, químicas e organolépticas do ali- mento levando o mesmo a deterioração. (Chan, Krieg & Pelczar, 1996). Embora as estatísticas brasileiras sejam precárias, acre- dita-se que a incidência de doenças microbianas de origem ali- mentar em nosso país seja bastante elevada. Mesmo em países desenvolvidos, nos quais o abastecimento de gêneros alimentí- cios é considerado seguro do ponto de vista de higiene e saúde pública, a ocorrência de doenças desta natureza é significante e vem aumentando, apesar dos avanços tecnológicos nas áreas de produção e controle de alimentos. (Franco, 2003). Nos Estados Unidos até a década de 50, a indústria de alimentos contava apenas com a análise laboratorial dos lotes produzidos para fins de controle de segurança e qualidade. As- sim, um lote era preparado e, caso a análise demonstrasse que apresentava as condições desejadas, era liberado; se não, era re- tido. Tentando melhorar, a indústria de alimentos adaptou a Boas Práticas (BP) da indústria farmacêutica, dando um grande passo para melhorar e dinamizar a produção de alimentos seguros e de qualidade. Com as Boas Práticas de Fabricação (BPF), começou- se a controlar, segundo normas estabelecidas, a água, as conta- minações cruzadas, as pragas, a higiene e o comportamento do manipulador, a higienização das superfícies, o fluxo do processo e outros itens. (SENAI, 2005). Com o tempo foi sendo verificado que a BPF e a análise do produto final não garantia 100% de segurança dos alimen- tos. Este dado foi comprovado com estudos feitos pela NASA ao observar que durante os vôos tripulados o principal veículo de patógenos para os astronautas eram os alimentos. Assim, a NASA junto com o Pilrsbury Co desenvolveu o sistema “Hazard Analysis and Critical Control Point” (HACCP), traduzido no Brasil como Sis- tema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC). Este sistema permite levantar os perigos biológicos, químicos e físicos significativos que podem ocorrer na produção de um deter- minado alimento em uma determinada linha de processamento, e controlá-los nos Pontos Críticos de Controle (PCC), durante a produção (SENAI, 2005). Os perigos de natureza biológica incluem bactérias toxi- gênicas e infecciosas dentre outros. Os perigos de natureza quí- mica incluem pesticidas, produtos de limpezas enquanto que os perigos de natureza física incluem fragmentos de metais pesados, vidro, farpas de madeira, pedras, etc. (Franco,2003). No Brasil, entre a década de 60 e 70 as BP já eram exi- gidas, pelo Decreto-lei nº 986, de 21 de outubro de 1969 que instituiu normas básicas sobre alimentos. Porém o APPCC só foi introduzido no final da década 90 pela portaria do governo nº326/SVS/MS de 30 de julho de 1997 que aprova o regulamen- to técnico; “Condições Higiênico-Sanitárias e de Boas Práticas de Fabricação para estabelecimento produtos/ industrializadores de alimentos”. Em 2 de janeiro de 2001 a ANVISA (Agência Nacio- nal de Vigilância Sanitária) aprovou a resolução RDC Nº12, que estabelece os Padrões Microbiológicos para alimentos e determi- na os critérios para a conclusão e interpretações de resultados das análises microbiológicas dos alimentos destinados ao consumo humano. (ANVISA, 2005). O alimento é quem determina qual o microrganismo é capaz ou incapaz de se desenvolver. Conhecendo-se as caracterís- ticas do alimento, podemos, predizer a flora microbiana que nele poderá se multiplicar. (SILVA, 2000). Daí se dá a importância da análise microbiológica, pois inúmeros métodos laboratoriais po- dem ser utilizados para investigar a ausência ou presença destes microrganismos. (Franco, 2003). Cuidados especiais devem ser tomados na colheita de amostra para análise microbiológica de alimentos. Desta primeira fase de análise, depende, em muito, a validade de interpretação dos resultados laboratoriais. (Siqueira, R. S., 1995). Os seguintes tópicos são importantes no estudo dos métodos de análise micro- biológica de alimentos: amostragem, preparação da amostra para análise, métodos de contagem de microrganismos e isolamento e identificação de patógenos. (Franco, 2003). 2- Microrganismos Indicadores Os números e tipos de microrganismos presentes dentro ou sobre os alimentos produzidos podem ser usados para avaliar com segurança a qualidade microbiológica dos mesmos. A segu- rança é determinada pela ausência ou presença de microrganis- mos patogênicos ou suas toxinas, a quantidade do inóculo, e o tempo de controle ou destruição desses agentes. Testes para orga- nismos indicadores podem ser usados para avaliar também a qua- lidade microbiológica ou segurança quando há uma relação entre a ocorrência de um organismo indicador e a provável presença de um patógeno ou toxina for estabelecida. (Doyle, Beuchat, & Montiville, 1997). Alguns critérios devem ser considerados na definição de um microrganismo ou grupo de microrganismos indicadores: (I) deve ser de rápida e fácil detecção; (II) deve ser facilmente distinguível de outros microrganismos da microbiota do alimen- to; (III) não deve estar presente como contaminante natural do alimento, pois assim sua detecção não indicará, necessariamente,a presença de matéria fecal ou dos patógenos; (IV) deve estar sempre presente quando o patógeno associado estiver; (V) seu número deve correlacionar -se com o do patógeno; (VI) deve apre- sentar necessidades de crescimento e velocidade de crescimento semelhantes as do patógeno; (VII) deve ter velocidade de morte que seja ao menos semelhante à do patógeno e, se possível, so- brevivência levemente superior à do patógeno; (VIII) deve estar ausente nos alimentos que estão livres do patógeno, ou estar pre- sente em quantidades mínimas .(XI) ter como hábitat exclusivo o trato intestinal do homem e outros animais; (X) deveria ocorrer em número muito alto nas fezes; (XI) deveria apresentar alta re- Saúde & Ambiente em revista - 1/2006 Cunha, M.A. sistência ao ambiente extra-enteral; (XII) deveria haver técnicas rápidas, simples e precisas para a sua detecção e/ou contagem. (Doyle, Beuchat, & Montiville, 1997). Segundo a ICMSF (International Commission on Mi- crobiological Specifications for Foods) microrganismos indi- cadores podem ser agrupados em: (I) Microrganismos que não oferecem um riscos direto a saúde: contagem padrão de mesófila, contagem de psicrotróficos e termófilos, contagem de bolo- res e leveduras. (II) Microrganismos que oferecem um risco baixo ou indireto à saúde: coliformes totais, coliformes fecais, Entero- coccus, Enterobactériaceae totais e Escherichia coli . (SILVA, 2002). O uso de Escherichia coli como um indicador de conta- minação de origem fecal presente em água foi proposto em 1892 por Teobaldo Smith, uma vez que esse microrganismo é encontra- do no conteúdo intestinal do homem e animais homeotérmicos. (Franco, 2003). 2.1- Coliformes totais Este grupo é composto por bactérias da família Ente- robacteriaceae, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, quando incubados a 35-37ºC, por 48 horas. São bacilos gram-negativos e não formadores de esporos. (Franco, 2003). Fazem partes desse grupo predominantemente bactérias perten- centes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. Destes, apenas a Escherichia coli tem como hábitat primário o trato intestinal do homem e animais homeotérmicos. Os demais - Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella -, além de serem encontrados nas fezes, também estão presentes em ou- tros ambientes como na vegetação e no solo, onde persistem por tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal como Samonella e Shigella. Conseqüentemente, a presença de coliformes totais no alimento não indica, necessariamente, conta- minação fecal recente ou ocorrência de enteropatógenos. (Franco, 2003). 2.2- Coliformes fecais e Escherichia coli As bactérias pertencentes a este grupo correspondem aos coliformes totais que apresentam a capacidade de continuar fermentando lactose com produção de gás, quando incubadas a temperaturas de 44-45ºC. (Franco, 2003). Os critérios microbioló- gicos que envolvem E.coli são úteis quando é desejável determi- nar se houve contaminação fecal. (Doyle, Beuchat, & Montiville, 1997). Atualmente, ao invés de enumerar os coliformes fecais e E.coli alguns laboratórios estão preferindo enumerar as bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae como um todo, isto é, as fermentadoras e não fermentadoras de lactose, pois números falsos seriam obtidos ao se verificar apenas a presença de micror- ganismos fermentadores de lactose, quando a população fosse constituída, na sua maioria, por microrganismos não fermentado- res, incluindo-se aqui as salmonelas lactose-negativas ou outros fermentadores tardios desses açúcares. (Franco, 2003) 2.3- Enterococcus Essas bactérias, antes um subgrupo do gênero Strep- tococcus, a partir de 1984 passaram a pertencer ao gênero En- terococcus, com 19 espécies reconhecidas atualmente. Antes de 1984, os Estreptococcus fecais eram chamados genericamente de enterococos, e consistiam de duas espécies: Streptococcus faecalis e Streptococcus faecium. São atualmente denomina- dos Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium. (Franco, 2003). São relativamente resistentes ao calor e podem sobreviver as pasteurizações do leite. (Doyle, Beuchat, & Montiville, 1997). Algumas restrições quanto a utilização dos Enterococ- cus como indicadores de contaminação fecal dos alimentos são feitas, uma delas seria de encontrarmos em outros ambientes além do trato intestinal e apresentarem uma sobrevivência maior em relação aos enteropatógenos encontrados no solo, nos vege- tais e em alimentos, principalmente naqueles submetidos à desidratação, ação de desinfetantes e a flutuações de tempera- tura por serem mais resistentes. (Franco, 2003). Apesar das limitações do uso desses microrganismos como indicadores de contaminação fecal, sua presença em núme- ros elevados em alimentos indica práticas sanitárias inadequadas ou exposição do alimento a condições que permitiram a multipli- cação de microrganismos indesejáveis.(Franco, 2003). 3- Métodos de Análise Atualmente os métodos de análise são comumente divi- didos em métodos “convencionais” e métodos “rápidos”. (Franco, 2003). Os métodos convencionais são chamados assim pois fo- ram desenvolvidos há muitos anos e desde então são utilizados como métodos oficiais na maioria dos laboratórios brasileiros e também em outros países. (Franco, 2003). Os métodos rápidos surgiram a partir da década de 70, como conseqüência da necessidade de se abreviar o tempo necessário para a obtenção de resultados analíticos e melhorar a produtividade laboratorial. Além desses objetivos, esses méto- dos visam também a simplificação do trabalho e a redução de custos. Para alguns métodos, a essas vantagens, aliam-se ou- tras como maior sensibilidade e especificidade que os métodos convencionais.(Franco, 2003). Os métodos rápidos aprovados pelos órgãos oficiais, podem ser utilizados somente para controle, sendo que resulta- dos negativos são considerados como definitivos, mas resultados positivos considerados como presuntivos devem ser confirmados por métodos padrões. (Tese USP, 2002). No estudo dos métodos de análise microbiológica de ali- mentos, a obtenção correta das amostras, seu transporte para la- boratório e sua preparação para análise são etapas fundamentais para o sucesso da análise. Dá execução correta dessas três etapas depende a exatidão dos resultados obtidos. (Franco, 2003). A 1º etapa é a da amostragem onde no momento da obtenção de uma amostra para análise, todas as precauções devem ser tomadas para que a Saúde & Ambiente em revista - 1/2006 Cunha, M.A. amostra obtida seja representativa do produto como um todo. Como regra geral, toda amostra deve ser analisada até 36 horas após sua obtenção. (Franco, 2003). A 2º etapa é a preparação da Amostragem, onde Técni- cas corretas de preparação de uma amostra para análise são indispensáveis. Técnicas assépticas devem ser utilizadas em todas as etapas. Uma vez que a distribui- ção dos microrganismos nos alimentos não é uniforme, uma ho- mogeneização prévia de toda a amostra é indispensável. A esco- lha do diluente para homogeneização depende do tipo de produto e dos microrganismos a serem pesquisados. (Franco, 2003). 3.1- Contagem de microrganismo psicrófilos e termófilos Essas contagens avaliam o grau de deterioração de ali- mentos refrigerados ou daqueles submetidos a tratamento térmi- co. (Franco, 2003). 3.2- Contagem total de microrganismo mesófilos aeróbios Está contagem detecta, em um alimento, o número de bactérias aeróbias e/ou facultativa e mesófilas (35 - 37° C), pre- sentes tanto sob a forma vegetativa quanto esporulada. (Tese USP, 2002). Segundo a ICMSF (International Commission on Mi- crobiological Specifications for Foods) o número de micror- ganismo aeróbios e mesófilos (contagem em placa) encontrado em um alimento tem sido um dos indicadores microbiológicos da qualidade dos alimentos mais comumente utilizados, indicando se a limpeza, a desinfecção e o controle da temperatura durante oprocesso de tratamento industrial, transporte e armazenamento foram realizados de forma adequada. Esta determinação permite também obter informação referente a alteração incipiente dos ali- mentos, sua provável vida útil, e a falta de controle no desconge- lamento dos alimentos ou desvios na temperatura de refrigeração estabelecida. (Teses USP, 2002). Contagem de Bolores e Leveduras O crescimento de bolores e leveduras é mais lento do que observado em bactéria nos alimentos de baixa acidez e alta atividade de água. Portanto dificilmente serão responsáveis pela deterioração desses alimentos. Em alimentos ácidos e de baixa atividade de água, no entanto, o crescimento de fungos é maior, provocando deterioração com grande prejuízo econômico em fru- tas frescas, vegetais e cereais. (Franco, 2003). 3.3- Contagem em placas O método de contagem de microrganismos em placas é um método geral, que pode ser utilizado para contagem de gran- des grupos microbianos, como aeróbios, mesófilos, aeróbios psi- crófilos, termófilos, bolores e leveduras, variando o tipo de meio, a temperatura e o tempo de incubação. (Tese USP, 2002). Por este método, amostras de alimentos são homogenei- zada, diluídas em séries, em diluente apropriado, plaqueadas com ou sobre um meio de ágar apropriado e incubadas, após o que to- das as colônias visíveis são contadas o procedimento se baseia na premissa de que cada célula presente em uma amostra irá formar uma colônia separada e visível, quando fixada com meio que lhe permita crescer. (Tese USP, 2002). 3.4- Técnica do Número Mais Provável A técnica do Número Mais Provável , também chamada de técnica dos tubos múltiplos, é outra maneira bastante utilizada pelos laboratórios de microbiologia de alimentos para estimar a contagem de alguns tipos de microrganismos, como coliformes fecais, coliformes totais, E.coli e Staphylococcus aureus.(Teses USP, 2002). Na técnica do Número Mais Provável, o produto a ser analisado, após homogeneização, é submetido a pelo menos três diluições decimais seriadas. De cada uma dessas diluições, alíquo- tas iguais são transferidas para três ou para cinco tubos contendo o meio de cultura escolhido e um tubo coletor de gás (tubo de Durhan). Todos os tubos são incubados, e em seguida, os positivos são identificados. Pelo número de tubos positivos em cada uma das diluições empregada determina-se o Número Mais Provável por grama de produto, tendo como base a tabela estatística de Hoskins para três ou para cinco tubos. (Franco, 2003). O NMP é estimado de respostas onde resultados são relatados como positivos e negativo em uma ou mais diluições decimais da amostra. Por esta técnica pode-se obter informações sobre a população presuntiva de coliformes (teste presuntivo), so- bre a população real de coliformes (teste confirmativo) e sobre a população de coliformes de origem fecal (coliformes fecais). (Te- ses USP, 2002). 4- Considerações Finais A preocupação com a qualidade e segurança dos ali- mentos é uma questão mundial de saúde pública, pelo fato de po- dermos ingerir algum tipo de alimento contaminado por micror- ganismos patogênico. Essa preocupação se amenizou pela criação do HACCP que é uma grande ferramenta no controle de qualidade dos alimentos produzidos em grande escala pelas industrias. O conhecimento dos microrganismos indicadores tor- nou-se uma ferramenta muito importante pelo fato de identificar á fonte da contaminação. Os métodos de análise se comprovaram como uma fer- ramenta eficiente e rápida, pois com a velocidade de produção das indústrias estes métodos são grandes aliados para o diag- nóstico de comprovação de um patógeno e quando dentro dos parâmetros estabelecidos são aceitos pelos órgãos oficiais e pela comunidade cientifica. 5- Agradecimentos A Deus, pois sem ele nada é possível. Aos meus pais grandes incentivadores desta minha longa caminhada acadêmica. Aos professores pela dedicação e paciência, aos meus amigos da faculdade com quem compartilho minhas experiências, dúvidas Saúde & Ambiente em revista - 1/2006 Cunha, M.A. e esperança nesta nova profissão que estou abraçando. A minha orientadora professora Marilene Rodrigues e Silva exemplo de profissional dedicada, que me orientou brilhantemente neste tra- balho. 6- Referência Bibliográfica CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R.; PELCZAR Júnior, M. J. Microbiolo- gia: Conceitos e Aplicações, segunda edição - São Paulo: Makron books, 1996. DOYLE, M. P.; BEUCHAT, L. R.; MONTVILLE, T. J. Food Microbio- logy: Fundamentals and Frontiers, 2º edição - Washington: Editora , 1997. EVANGELISTA, J. Tecnologia dos Alimentos, 2º edição – São Pau- lo: Editora Atheneu, 2000. FRANCO, B. D. G. M. Microbiologia dos Alimentos, 2º edição – São Paulo: Editora Atheneu, 2003. SILVA Junior, E. A. Manual de Controle higiênico-sanitário em ali- mentos, 1º edição – São Paulo: Livraria Varela, 1995. SILVA, J. A. Tópicos da Tecnologia dos Alimentos, 2º edição – São Paulo: Livraria Varela, 2000. SIQUEIRA, R. S. Manual de Microbiologia de Alimentos, 2º edição – Rio de Janeiro: Embrapa CTAA, 1995. SILVA, M. C. Avaliação da qualidade microbiológica de alimentos com a utilização de metodologias convencionais e do sistema sim- plate. 2002. Tese (Mestre em Ciências) – Escola Superior de Agri- cultura, Universidade de São Paulo, 2002, Piracicaba. Disponível em http://www.teses.usp.br/. Acesso em: 02 maio 2005. www.anvisa.gov.br. Acesso em: 22 março 2005. www.alimentos.senac.br. Acesso em: 22 março 2005.
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