LPI- AAS- THAIS M SOUTO

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LPI- AAS- THAIS M. SOUTO
PIPETAGEM
Instrumentos de medição são fundamentais em laboratórios, que necessitam de aferições de volume exatas nos procedimentos laboratoriais. Com esta finalidade, as pipetas, os pipetadores e as micropipetas são equipamentos importantes no laboratório.
PARA QUE SÃO UTILIZADAS AS PIPETAS? 
As pipetas são instrumentos ou equipamentos utilizados para medir ou transferir líquidos. Problemas de pipetagem são fontes comuns de erro em diagnósticos laboratoriais. Esses problemas podem ser causados por falha na técnica de pipetagem, erro na escolha da pipeta, problemas de ajuste do equipamento ou falta de cuidados de conservação.
QUAIS SÃO OS TIPOS DE PIPETAS MAIS UTILIZADOS EM LABORATÓRIOS?
As pipetas mais utilizadas são as sorológicas ou graduadas, as pipetas de volume fixo ou ajustável e também pipetas multicanal. São usadas ainda as pipetas de Pasteur, SOMENTE PARA TRANSFERIR LÍQUIDOS. Quanto ao funcionamento, as pipetas classificam-se em MANUAIS, SEMIAUTOMÁTICAS E AUTOMÁTICAS. Para líquidos densos, viscosos ou voláteis também são indicadas as pipetas de deslocamento positivo. Essas pipetas são muito utilizadas em técnicas de biologia molecular, uma vez que são desenvolvidas para que não haja contato da substancia pipeta com o corpo da pipeta, prevenindo a contaminação de uma amostra para outra.
O QUE SÃO PIPETAS GRADUADAS?
São instrumentos de vidro ou plástico utilizados para medir diversos volumes. Essas pipetas apresentam menor precisão se comparadas com os manuais de volume fixo ou ajustável. As pipetas graduadas trazem impressas as indicações de uso, a escala de divisão do volume, a capacidade e a temperatura de referência.
Que cuidados devem ser observados na utilização de pipetas graduadas?
•• Antes de usar essas pipetas, verifique se as extremidades superior e inferior nao estão quebradas.
•• Utilize equipamento auxiliar de pipetagem. Nunca pipete com a boca.
•• Ajuste o menisco, erguendo a pipeta na altura de seus olhos.
•• Apos o uso, deixe essas pipetas totalmente submersas, por 24h, em solucao de hipoclorito de sodio◆ a 2%, para garantir sua desinfeccao e, tambem, para evitar que os residuos sequem no seu interior.
QUAIS SAO OS EQUIPAMENTOS AUXILIARES DE PIPETAGEM MAIS UTILIZADOS? FIGURA 2 PIPETADORES
O QUE SÃO PIPETAS MANUAIS DE VOLUME FIXO OU AJUSTÁVEL? PIPETAS ELETRONICAS
São equipamentos de metal ou plástico, de grande precisão, projetados para pipetar um único volume (volume
fixo) ou um volume selecionado dentro de uma faixa (volume ajustável).
Veja, na figura 3, apresentação esquemática de uma pipeta manual com embolo, que e a mais usada em
laboratorios.
QUAIS SÃO OS PRINCIPAIS ACESSÓRIOS DISPONÍVEIS PARA ESSAS PIPETAS?
Os principais acessórios sao as ponteiras e o suporte para manter a pipeta na posição vertical.
O QUE É A PIPETAGEM NORMAL E A REVERSA?
A pipetagem normal e aquela que você utiliza rotineiramente. 
A pipetagem reversa e indicada para volumes de ate 20μl e para pipetar fluidos viscosos como a glicerina ou volateis como acetona.
Quais os principais cuidados durante a pipetagem?
Verifique se a ponteira está corretamente acoplada a pipeta.
Faça a pipetagem com a pipeta na posicao vertical.
Aspire e dispense o liquido, mantendo velocidade lenta e constante.
QUAL O PROCEDIMENTO PARA PIPETAGEM NORMAL?
Para fazer pipetagem normal, siga os seguintes passos:
1. Selecione o volume desejado.
2. Pressione o acionador do embolo da pipeta ate o primeiro estágio.
3. Mergulhe a ponteira, aproximadamente, 5 milimetros abaixo da superficie do liquido.
4. Libere o acionador do embolo, gradativamente, ate a sua posicao original, aspirando o liquido.
5. Dispense o liquido, pressionando o embolo ate o segundo estágio.
6. Libere, lentamente, o acionador do embolo ate a sua posicao original.
7. Descarte a ponteira em recipiente de boca larga e paredes rigidas, contendo hipoclorito de sodio a 2%.
QUAL PROCEDIMENTO PARA PIPETAGEM REVERSA?
Para fazer pipetagem reversa, siga os seguintes passos:
1. Selecione o volume desejado.
2. Pressione o acionador do embolo da pipeta ate o segundo estágio.
3. Mergulhe a ponteira, aproximadamente, 5 milimetros abaixo da superficie do liquido.
4. Libere o acionador do embolo, gradativamente, ate a posicao inicial, aspirando o liquido.
5. Pipete o volume selecionado, pressionando, gradativamente, o acionador do embolo ate o primeiro estágio.
Note que ha um residuo liquido que fica na ponteira.
6. Retorne lentamente o acionador ate a posicao de descanso.
7. Descarte a ponteira em recipiente de boca larga, contendo hipoclorito de sodio a 2%.
QUE CUIDADOS DEVEM SER OBSERVADOS COM PIPETA MULTICANAL?
Essas pipetas requerem os mesmos cuidados observados com as monocanal. Observe ainda:
•• Ao iniciar pipetagem, se todas as ponteiras estão bem acopladas.
•• Ao aspirar, se o líquido se encontra no mesmo nível em todos os canais.
Utilize sempre ponteiras iguais.
PLACA DE 96 POÇOSPLACA PARA CULTURA DE CÉLULAS 96 POÇOS é utilizada como o próprio nome diz, para o cultivo de células e tecidos. Poços de fundo chato, com superfície lisa tratada e borda elevada; TESTE ELISA, técnica de diluição.
DILUIÇÃO SERIADA
Nada mais é do que reduzir a quantidade de determinadas partículas em um volume específico de solvente.
Uma diluição seriada é basicamente uma série de diluições simples que amplifica o fator de diluição. A fonte da amostra para diluição de cada etapa vem da diluição anterior. Todas as diluições na série têm o mesmo fator de diluição, em que a amostra da diluição anterior é usada para fazer a diluição subsequente.
A diluição seriada é a técnica que permite a contagem do número de microorganismos de amostras com concentrações muito elevadas.
IDENTIFICAÇÃO DO AGENTE ETIOLÓGICO E VETOR DA DOENÇA DE CHAGAS
A doença de Chagas (ou Tripanossomíase americana) é a infecção causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Apresenta uma fase aguda (doença de Chagas aguda – DCA) que pode ser sintomática ou não, e uma fase crônica, que pode se manifestar nas formas indeterminada (assintomática), cardíaca, digestiva ou cardiodigestiva.
TRIPOMASTIGOTA: forma alongada (podendo se apresentar como formas finas e largas), com cinetoplasto com formato arredondado localizado na região posterior ao núcleo, flagelo emergindo da bolsa flagelar (não visível ao microscópio óptico) que se localiza lateralmente, na região posterior do parasito. O flagelo emerge e se adere ao longo do corpo do parasito, tornando-se livre na região anterior. Esta forma é altamente infectante, e pode ser encontrada: no inseto vetor (porção posterior do intestino, no reto); sangue e espaço intercelular dos hospedeiros vertebrados; culturas de células infectadas; cultivo axênico (metaciclogênese in vitro).
Amastigota: forma arredondada, com cinetoplasto em forma de barra ou bastão na região anterior ao núcleo, flagelo curto (não visível ao microscópio óptico) que emerge da bolsa flagelar. Esta forma pode ser encontrada: no interior de células em hospedeiros infectados bem como em cultivo axênico.
Epimastigota: forma alongada, com cinetoplasto em forma de barra ou bastão localizado anteriormente ao núcleo. O flagelo emerge da bolsa flagelar com abertura lateral, e percorre aderido a parte do corpo do parasita, tornando-se livre na região anterior. Pode ser encontrado: no tubo digestivo do inseto vetor; cultivo axênico.
Agente etiológico - informações importantes PARASITA DE NOTIFICAÇÃO COMPULSÓRIA.
 • Apresenta cinetoplasto na sua composição, rica em ácido nucleico e fica localizada bem próxima a inserção do flagelo; A partir do cinetoplasto, que o flagelo sai; 
• Parasita que tem trofia pelo tecido cardíaco, se desenvolvendo basicamente lá. Além do tecido cardíaco, pode se desenvolver no intestino; 
• Dois hospedeiros: o vertebrado que pode ser o homem (principalmente) ou outros primatas, gambá ou preguiça; o invertebrado são os insetos hematófagos triatomíneos (barbeiros). Reprodução sempre assexuada do parasita, através da divisão binária (fissão binária)
TRÊS TIPOSDE TRIATOMÍNEO TRIATOMA É O MAIS COMUM ele pica dia e noite
Para caráter de diferenciação, o hematófago (ÚNICO VETOR DO T.CRUZI) possui a probóscide reta e curta, visto que, não precisa ser muito comprida já que irá se adaptar ao indivíduo e não poderia ser curva, para que consiga então chegar a veia do indivíduo.
Na fase aguda da doença de Chagas, o diagnóstico se baseia na presença de sinais e sintomas sugestivos da doença e na presença de fatores epidemiológicos compatíveis, como a ocorrência de surtos. 
Já na fase crônica, a suspeita diagnóstica também é baseada nos achados clínicos e na história epidemiológica, porém como parte dos casos não apresenta sintomas, devem ser considerados os seguintes contextos de risco e vulnerabilidade:
· Ter residido ou residir em habitação onde possa ter ocorrido o convívio com vetor transmissor (principalmente casas de estuque, taipa, sapê, pau-a-pique, madeira, entre outros modos de construção que permitam a colonização por triatomíneos);
· Residir ou ser procedente de área com registro de transmissão ativa de T. cruzi ou com histórico epidemiológico sugestivo da ocorrência da transmissão da doença no passado;
· Ter realizado transfusão de sangue ou hemocomponentes antes de 1992;
· Ter familiares ou pessoas do convívio habitual ou rede social que tenham diagnóstico de doença de Chagas, em especial mãe e irmão (s).
EXAMES LABORATORIAIS 
Na fase aguda: 
• Esfregaço de sangue para determinação de presença de tripomastigota; 
• Infecção aguda - alta parasitemia; 
• Cultura do sangue com células in vitro - coloca o sangue no meio específico para crescimento de tripanossoma e formas tripomastigotas; 
• Pesquisa de anticorpos; 
• Teste de ELISA; 
• Xenodiagnóstico; 
• Em menor proporção, PCR.
Na fase crônica: 
• Diagnóstico de imagem; 
• ECG; 
• Avaliação por diagnóstico tecidual para pesquisa de ninhos;
 • Xenodiagnóstico; 
• Teste de Elisa; 
• Biópsia (raro em vivo, mais comum em necropsia ou coração transplantado).
AS PRINCIPAIS FORMAS DE TRANSMISSÃO DA DOENÇA DE CHAGAS SÃO:
Vetorial: contato com fezes de triatomíneos* infectados após o repasto/alimentação sanguínea. A ingestão de sangue no momento do repasto sanguíneo estimula a defecação e, dessa forma, o contato com as fezes.
Oral: ingestão de alimentos contaminados com parasitos provenientes de triatomíneos infectados ou suas excretas.
Vertical: ocorre pela passagem de parasitos de mulheres infectadas por T. cruzi para seus bebês durante a gravidez ou o parto.
Transfusão de sangue ou transplante de órgãos de doadores infectados a receptores sadios.
Acidental: pelo contato da pele ferida ou de mucosas com material contaminado durante manipulação em laboratório ou na manipulação de caça.
TESTES RÁPIDOS
Os testes rápidos, são aqueles que identificam doenças infecciosas, hormônios e outros analitos, e costumam ser baseados na metodologia de IMUNOCROMATOGRAFIA. 
Como vantagens destacam-se a facilidade de execução (materiais fornecidos pelo fabricante) e interpretação do teste (feita a olho nu, sem auxílio de aparelhos, não exige treinamento específico de pessoal), o baixo custo, a rapidez na obtenção dos resultados (<30m) a alta sensibilidade e especificidade. Ressalta-se também, como vantagens, os pequenos volumes de amostra que a técnica exige, os vários tipos amostras clínicas aceitos para realização estes testes, possibilidade de serem realizados fora do ambiente laboratorial (a campo, locais afastados e de pouca infra estrutura). 
Atualmente, os testes rápidos podem ser utilizados na IDENTIFICAÇÃO DE GRAVIDEZ e na detecção de uma grande quantidade de doenças, tais como ZIKA, DENGUE, MALÁRIA, AMEBÍASE, SÍFILIS, HANSENÍASE, INFECÇÃO POR VÍRUS COMO HIV, HCB, HCV, SARS-COV2, dentre outras. Estes utilizam uma matriz de membrana de nitrocelulose ligada a uma tira de acetato transparente ou inserida num dispositivo plástico e anticorpos ou anti-anticorpos específicos conjugados a partículas coloridas (ouro ou prata coloidal), para detectar, respectivamente, antígenos (teste direto) ou anticorpos (teste indireto) na amostra de um paciente.O soro com antígeno, quando passa pela região do que tem o anticorpo, libera cor. Caso não haja antígeno, não libera.
Pontos negativos do teste rápido • Falso positivo por ser bastante sensível. 
INTERPRETAÇÃO DOS TESTES RÁPIDOS DE IMUNOCROMATOGRAFIA RESULTADO POSITIVO: ocorre quando duas linhas são visíveis, sendo uma linha na região controle (C) e outra na região teste (T), a intensidade da cor da linha teste (T) poderá variar de acordo com a concentração do analito (Ag / Ac) presente na amostra, mas qualquer intensidade de cor na linha teste indica resultado positivo.
O PROCEDIMENTO PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS CONTA HIV1 E HIV2 SIMULTANEAMENTE EM SORO HUMANO, PLASMA OU SANGUE TOTAL PELO TESTE HIV 1/2 3.0 STRIP TEST BIOEASY CONSISTE EM:
 1. Retirar o suporte de teste do envelope e colocar sobre uma superfície plana.
 2. Adicionar 10μl a 20μl de soro, plasma ou 20μl de sangue total ou (uma gota ) na área de amostra (apontada pela figura) 3. Adicionar 3 gotas (90 a 120 μL) do tampão na área de amostra.
 4. Aguardar 15 a 20 minutos após a adição da solução tampão para interpretar o resultado do teste. 
Atenção: o teste não deve ser lido após 30 minutos, pois pode gerar resultados falsos positivos.
REALIZAÇÂO DE TESTE RÁPIDO DE IMUNOCROMATOGRAFIA PARA DETECÇÂO ANTICORPOS CONTRA O VÍRUS DA HEPATITE C 
O procedimento para detecção rápida de anticorpos anti HCV pelo Teste ALERE HCV no soro ou sangue total consiste em: 
1. Retirar o suporte de teste do envelope e colocar sobre uma superfície plana. 
2. Adicionar 5 μL de soro no poço de adição de amostra de cada dispositivo. 
3. Adicionar 3 a 4 gotas (90 a 120 μL) de solução tampão o poço maior de cada dispositivo.
 4. Aguardar 15 a 20 minutos após a adição da solução tampão para interpretar o resultado do teste. 
Atenção: o teste não deve ser lido após 30 minutos, pois pode gerar resultados falsos positivos.
HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA (HAI) PARA DIAGNÓSTICO DE CHAGAS
A técnica de HAI utiliza hemácias sensibilizadas com antígenos de Trypanossoma cruzi, e é realizada com o intuito de verificar-se se no soro do paciente existe a presença de anticorpos contra o antígeno adsorvido a hemácia.
TESTE QUALITATIVO E SEMI- QUANTITATIVO INDIRETO (busca anticorpos no soro do paciente)
A positividade no teste pode ser visualizada a olho nu pelos seguintes critérios de reatividade: 
• Amostra reagente: formação imunocomplexos antígeno-anticorpo. Será observada pela aglutinação das hemácias que permanecem distribuídas em forma de tapete ou manto ocupando todo poço da placa. 
• Amostra não reagente: não haverá formação de imunocomplexos e as hemácias ficam acumuladas em formas de botão no fundo do poço.
O procedimento para a realização da HAI para Doença de Chagas (teste qualitativo) consiste em: 
1. Colocar a placa sobre um pano úmido para neutralizar as forças eletrostáticas. 
2. Usar 1 cavidade de placa por amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo do teste. 
3. Utilizar diluição 1/32 da amostra com a solução diluente (2) com 2- mercaptoetanol 
3). Recomenda-se diluir em um tubo de ensaio 10µl da amostra + 310µl da solução diluente com 2-mercaptoetanol. OBS.: Não diluir soros controles positivo e negativo, pronto para uso, já diluído 1/32. 
4. Pipetar 50µl do soro controle positivo, negativo e da diluição 1/32 de cada amostra nas respectivas cavidades da placa. Sugere-se: A1 controle positivo, A2 controle negativo e A3 soro a ser testados.
5. Adicionar 25µl da suspensão homogênea de hemácias (1) em cada cavidade. 
6. Agitar a placa por vibração mecânica (agitador de placas) ou batendo, com os dedos, nas bordas da placa por 3 a 4 minutos. 
7. Deixar em repouso por 1 a 2 hora sem temperatura ambiente em local livre de vibrações (IMPORTANTE).
 8. Fazer leitura
VDRL (VENERAL DISEASE RESEARCH LABORATOTY) PARA DIAGNÓSTICO DE SÍFILIS
SIFILIS
Primeiro estágio: ferida em órgãos sexuais; 3 a 90 dias
Segundo estágio:erupções cutâneas múltiplas; 4 a 10 semanas
 Terceiro estágio: manifestações diversas (cardíacas, SNC, outros). 3 a 15 anos 
OS TESTES DIAGNÓSTICOS PARA SÍFILIS PODEM SER DIVIDIDOS EM: 
1. Testes antigênicos não-treponêmicos, também chamados testes lipídicos – são testes que detectam anticorpos não-específicos, mas que possuem semelhança imunológica com antígenos do Treponama, e portanto apresentam reação cruzada quando o paciente está infectado. 
2. Testes treponêmicos, também denominados testes para pesquisa de anticorpos verdadeiros, que utilizam antígenos de T. pallidum através de reações imunológicas. 
O VRDL é um teste NÃO-TREPONÊMICO baseado numa reação de floculação utilizado para determinação qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos não treponêmicos (reaginas) presentes no soro, plasma ou líquido céfaloraquidiano utilizado para triagem sorológica da Sifílis em pacientes suspeitos de estarem infectados. A positividade no teste pode ser visualizada com auxílio de um microscópio, utilizando o aumento de 100x, comparando o resultado da amostra com os obtidos para os controles positivos e negativos, pelos seguintes critérios de reatividade: 
• AMOSTRA POSITIVA (contendo anticorpos contra a fração lipídica do Treponema) vão apresentar floculação com as partículas de antígeno. Doenças auto-imune e infecciosas (malária, tuberculose, etc) podem dar + EFEITO PROZONA.
• AMOSTRA NEGATIVA : vão apresentar ausência de floculação
O procedimento para a realização do teste de VDRL para Sífilis consiste em: 
1. Colocar a placa de Kline em uma superfície plana.
 2. Adicionar 50 μL de soro em um poço da placa de Kline 
3. Para o controle positivo: adicionar 50 μL do controle positivo em um poço diferente do passo “2”.
 4. Para o controle negativo: adicionar 50 μL do controle negativo em um poço diferente do passo “2” e “3”. 5. Nos três diferentes poços que foram adicionados: “amostra teste”, “controle-positivo e “controle-negativo”. Deve-se adicionar 20 μL da suspensão antígeno. 
6. Colocar a placa em um agitador mecânico e agitar durante 4 minutos a 180rpm 
7. Imediatamente após os 4 minutos, observar o resultado ao microscópio, utilizando o aumento de 100X, comparando o resultado da amostra com os obtidos para os controles positivos e negativos.
Agente: colesterol (CARDIOLIPINA, LECITINA)> presente em treponema e em outras células do corpo.
Anticorpos de indivíduos infectados apresentam reação!